Name: Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende a detectar S-acilación proteica mediante captura asistida por resina acilo en células vivas, tejidos primarios y muestras congeladas. Este método sensible permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas.

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Este trabajo fue apoyado por las becas 5R01GM115446 y 1R01GM130840 de los Institutos Nacionales de Salud.

Los ratones utilizados en este protocolo fueron eutanasiados de acuerdo con las directrices de NIH. El Comité de Bienestar Animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston aprobó todo el trabajo animal.
1. Preparación de los lysaatos celulares
<ol><li>Prepare el búfer de lisis como se describe en la Tabla 1. A 10 ml de PBS, añadir 0,1 g de detergente n-dodecílo-D-maltoside (DDM) y rotar para disolver. Añadir 100 l de cóctel inhibidor de fosfatasa 2, ML211 (10 m), PMSF (10 mM) y cóctel inhibidor de proteasa (1x) y enfriar el tampón en hielo antes de usarlo.</li>
	<li>Transfiera los medios necesarios que contengan células de la incubadora en tubos cónicos de 15 ml o 50 ml y espíre células a 350 x g durante 5 min y aspire para deshacerse de los restos celulares. NOTA: Utilizamos 1 x 107 celdas para cada reacción acyl-RAC a realizar.</li>
	<li>Lavar el pellet resubyándolo en 5 ml de PBS y girando a 350 x g durante 5 min. NOTA: Realice el paso 1.3 rápidamente para evitar la lisis celular debido a la incubación prolongada en PBS.</li>
	<li>Añadir 600 l de tampón de lisis preparado en el paso 1.1 al pellet y lijarlo agitando a 1500 rpm en una coctelera térmica durante 30 minutos a 4 oC.</li>
	<li>Lisiado transparente por centrifugación a 20.000 x g a 4 oC durante 30 minutos a materiales insolubles en detergente de pellets. Recoger el lisado despejado en tubos de microfúgey de 1,5 ml preenfriados y mantenerlos en hielo.</li>
	<li>Realice un ensayo Bradford/BCA para estimar la concentración de proteínas. Es fundamental asegurar la misma cantidad de proteína en diferentes muestras antes de realizar el experimento. Recomendamos el uso de al menos 500 g de proteína por reacción. NOTA: En los experimentos descritos, utilizamos células cultivadas (Jurkat) y astillocitos primarios del tejido de ratones. El método de lisis descrito anteriormente también se puede adoptar a otros tipos de células. La concentración media de proteínas obtenida para los tipos de células antes mencionados es de aproximadamente 500 g por 1 x 107 células. Las células Jurkat se mantuvieron en un medio RPMI-1640 modificado para contener 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato sódico, 4.500 mg/L de glucosa y 1.500 mg/L de bicarbonato sódico complementado con 10% de FBS a 37oC con5%CO2. Usamos 1 x 107 células Jurkat por reacción. Los esplenocitos primarios se aislaron del tejido del bazo del ratón como se describe26. Brevemente, el tejido del bazo fue macerado sobre hielo, seguido de la lisis de los eritrocitos en solución hipotónica y la separación de los linfocitos por centrifugación. Usamos 1 x 107 células primarias por reacción.</li>
</ol>2. Acyl-RAC: Bloqueo de grupos de tiol libres
NOTA: Todos los pasos subsiguientes se pueden realizar a temperatura ambiente (RT).
<ol><li>Transfiera el lisado a un tubo de microfófugo fresco de 1,5 ml y realice precipitaciones cloroformo-metanol (CM) como se describe a continuación.<ol>
<li>Añadir metanol (MeOH) y cloroformo (CHCl3) al lisado a una proporción final de lisato: MeOH: CHCl3 de 2:2:1 y agitar vigorosamente para crear una suspensión homogénea.</li>
		<li>Gire a 10.000 x g durante 5 min para formar un pellet ("panqueque") en la interfase entre fases acuosas y orgánicas.</li>
		<li>Incline el tubo y aspire tanto disolvente como sea posible utilizando una aguja o una punta de carga de gel.</li>
		<li>Seque al aire el pellet proteico durante unos minutos y lávelo suavemente añadiendo 600 ml de MeOH y mezclando suavemente para evitar romper el pellet</li>
		<li>Retire cuidadosamente el MeOH restante y seque el pellet proteico en una mesa durante aproximadamente 5 minutos.</li>
		<li>(Opcional) Realice un paso de centrifugación adicional para espinar cualquier pellet roto después del lavado MeOH para evitar la pérdida de la muestra. NOTA: El experimento se puede detener después del paso de precipitación CM. Una vez obtenido el pellet, se puede almacenar en 500 oL de MeOH en -20 oC hasta una semana.<ol>
<li>Disolver el pellet proteico en 200 ml de tampón de 2SHB vortexing a 42 oC/1500 rpm en una coctelera térmica hasta que el pellet se disuelva.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(Opcional) Incubar durante 5-10 minutos adicionales en un baño de agua sonicante para disolver el pellet. NOTA: La duración de la sonicación varía dependiendo de la solubilidad del material. Sin embargo, la sonicación prolongada puede causar degradación de las proteínas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar un 0,2% de metandoiosulfonato de metilo (MMTS) (v/v) en 2SHB añadiendo 2 ml de MMTS a 998 l de tampón de 2SHB. NOTA: Utilice MMTS del 0,2% recién preparado para cada experimento.</li>
	<li>Añadir 200 ml de MMTS al 0,2% en 2SHB a cada tubo a una concentración final de 0,1% MMTS. Incubar durante 15 min a 42oC con agitación a 1500 rpm en una coctelera térmica.</li>
</ol>3. Acyl-RAC: Escote de hidroxilamina (HAM) y captura de proteínas S-aciladas
<ol><li>Repita las precipitaciones de 3-4x CM como se describió anteriormente para eliminar MMTS. La eliminación de MMTS se puede estimar por la falta de olor distinto de MMTS. Después de cada precipitación, disolver el pellet en 100 l de tampón de 2SHB por vórtice a 42 oC/1500 rpm en una coctelera térmica hasta que el pellet se disuelva, y luego diluir con 300 s de Tampón A.</li>
	<li>Después de la precipitación final, disolver las muestras en 200 l de tampón de 2SHB como se describió anteriormente y diluir con 240 s de tampón A.</li>
	<li>En caso de comparar los cambios en la acilación S en respuesta a varias condiciones de tratamiento, mida de nuevo la concentración de proteínas y proceda con la misma cantidad de proteína para cada condición.</li>
	<li>Conservar 40 l de cada muestra como un control de entrada.</li>
	<li>Divida las muestras en dos partes iguales de 200 l y marque los tubos como "+ HAM" y "- HAM". Añadir 50 ml de HAM neutro de 2 M recién preparado (pH 7.0-7.5) a una concentración final de 400 mM a uno de los tubos (+ HAM) y 50 ml de naCl neutro de 2 M al segundo tubo (- HAM), que se utilizará como control negativo. Proceder a la adición de cuentas de tiopropilo-sepharose (TS). NOTA: El experimento se puede detener después de cualquiera de los pasos de precipitación CM. Una vez obtenido el pellet, se puede almacenar en 500 oL de MeOH en -20 oC hasta una semana. El pH neutro de 2 M HAM asegura su selectividad para la unión de tioester de acile-cisteína y debe ajustarse cuidadosamente. Se debe tener cuidado al manipular muestras en el tampón 2SHB para evitar la pérdida de la muestra debido a la formación excesiva de espuma. Todos los pasos siguientes son idénticos para las muestras HAM y + HAM.</li>
	<li>Añadir 30 sl de perla-slurry TS a cada tubo y girar los tubos durante 1-2 h en RT.</li>
	<li>Lave las perlas TS 4x con 1% de SDS en el tampón A para eliminar el HAM residual.<ol>
<li>Gire suavemente hacia abajo todas las muestras de cuentas usando un microfudurante durante 1 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda las perlas en 500 s l de 1% de SDS en el búfer A.</li>
		<li>Repita el paso 3.7.1–3.7.2 tres veces. NOTA: La tiopropilo-sefestina (TS) activada se suministra liofilizada en presencia de aditivos que deben lavarse a pH neutro antes del acoplamiento. Se recomienda el uso de agua destilada para la hinchazón y el lavado. Pesar 0,1 g de perlas y resuspender en 1 ml de agua destilada y permitir que se hinche mientras se gira durante 30 min-1 h en RT. Lavar las perlas 1x con tampón A y preparar una suspensión con tampón A, en una proporción de 50% de tampón medio a 50%. La TS inflamada puede almacenarse a pH neutro en presencia de 20% de etanol a 4 oC hasta una semana. No utilice azida sódica como agente bacteriostático, ya que los iones de azida reaccionan con los grupos de disulfuro de 2 piridilo. Para una mayor eficiencia, prepare perlas frescas. Durante el manejo de las perlas, la punta de una punta de pipeta P200 se puede cortar ligeramente para evitar cualquier daño. NOTA: El experimento se puede detener en cualquier etapa después de la precipitación CM. El pellet se puede almacenar en 500 ml de MeOH en -20 oC hasta una semana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Elución y detección de proteínas S-aquiladas
<ol><li>Después del último lavado, gire suavemente hacia abajo las cuentas como se describió anteriormente y aspirar tanto sobrenadante como sea posible sin perturbar las cuentas.</li>
	<li>Recupere las proteínas de las perlas con un búfer de muestra de 4 x SDS con TDT.<ol>
<li>Añadir 50 l de tampón de muestra de SDS 4x a las perlas e incubar a 80 oC, 1500 rpm durante 15 minutos en una coctelera térmica. Deja que los tubos se enfríen.</li>
		<li>Centrifugar las perlas a 5.000 x g durante 3 min para peletizar completamente las perlas y transferir las proteínas eluted a un tubo fresco de 1,5 ml utilizando una punta de carga de gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute SDS-PAGE y analice la Acilación S de las proteínas de interés por hincha occidental.</li>
</ol>

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<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
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<li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina%2C+heart%2C+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li>
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<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
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<li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwissPalm%3A+Protein+Palmitoylation+database%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).</li>
<li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+%5B3H%5Dpalmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li>
<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
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<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
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<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
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<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Aquí, utilizamos con éxito el ensayo acyl-RAC para detectar La acilación S de proteínas seleccionadas tanto en células humanas cultivadas como en células primarias derivadas del tejido del ratón. Este método es simple, sensible y se puede realizar fácilmente con requisitos mínimos de equipos utilizando técnicas de bioquímica estándar. Se ha demostrado que este método identifica con éxito nuevas proteínas S-aciladas, como la subunidad del sistema de transubicación de proteínas (Sec61b), la proteína ribosomal S11 (Rps11) y...

La acilación S es una modificación post-traduccional reversible que implica la adición de una cadena de acilo graso a un residuo interno de cisteína en una proteína diana a través de una unión labile tioester1. Primero se informó como una modificación de proteínas con palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos2,y por lo tanto esta modificación se conoce a menudo como S-palmitoylation. Además del palmitato, las proteínas pueden ser modificadas reversiblemente por una variedad de ácidos grasos saturados más largos y más cortos (miristate y estearato), monoinsaturados (oleato) y poliinsaturados (araquidonato y eicosapentanoato)3,4,5,6,7. En las células eucariotas, la acilación S es catalizada por una familia de enzimas conocidas como aciltransferasas de proteína DHHC y la reacción inversa de la deccilación de cisteína es catalizada por tilanarias de proteína, la mayoría de las cuales siguen siendo enigmáticas8.
La labilidad del enlace tioester hace que esta modificación lipídica sea reversible, lo que le permite regular dinámicamente el clustering de proteínas, la localización de membranas plasmáticas, el tráfico intracelular, las interacciones proteína-proteína y la estabilidad de proteínas9,,10. En consecuencia, la acilación S se ha relacionado con varios trastornos, incluyendo la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y varios tipos de cáncer (próstata, gástrico, vejiga, pulmón, colorrectal), que requiere el desarrollo de métodos confiables para detectar esta modificación de proteína post-traduccional11.
El etiquetado metabólico con palmitato radiactivo ([3H], [14C] o [125I]) fue uno de los primeros enfoques desarrollados para analizar la proteína S-acylation12,13,14. Sin embargo, los métodos basados en radioetiquetado presentan problemas de salud, no son muy sensibles, consumen mucho tiempo y sólo detectan la lipidedeción de proteínas altamente abundantes15. Una alternativa más rápida y no radioactiva al radioetiquetado es el etiquetado metabólico con sondas de ácidos grasos bioortogonales, que se utiliza rutinariamente para analizar la dinámica de la proteína S-acylation16. En este método, un ácido graso con un reportero químico (grupo de alquino o azida) se incorpora a la proteína S-acilado por una proteína acitransferasa. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (clic chemistry) se puede utilizar para unir un grupo funcionalizado, como un fluoróforo o biotina, al ácido graso integrado que permite la detección de la proteína S-acylated17,18,19.
El intercambio de acilina-acilo (ABE) es uno de los métodos bioquímicos ampliamente utilizados para la captura e identificación de proteínas s aciladas que evita algunas de las deficiencias del etiquetado metabólico, como la inadecuación para las muestras de tejido15. Este método se puede aplicar para el análisis de S-acylation en una amplia gama de muestras biológicas, incluyendo tejidos y muestras de células congeladas20,,21. Este método se basa en el escote selectivo del enlace tioéster entre el grupo de acilo y el residuo de cisteína por hidroxilamina neutra. Los grupos tiol liberados son capturados con un derivado de la biotina tiol-reactivo. Las proteínas biotiniladas generadas se purifican con afinidad mediante agarosa de estreptavidina y se analizan mediante inmunoblotting.
Más tarde se introdujo un enfoque alternativo llamado captura asistida de acilo-resina (Acyl-RAC) para reemplazar el paso de biotinylación por la conjugación directa de cisteínas libres por una resina tio-reactiva22,23. Este método tiene menos pasos en comparación con ABE y de forma similar se puede utilizar para detectar la proteína S-acylation en una amplia gama de muestras1.
Acyl-RAC consta de 4 pasos principales(Figura 1), 1. Bloqueo de grupos de tiol libres; 2. Escisión selectiva de la unión tioester de cisteína-acyl con hidroxilamina neutra (HAM) para exponer los grupos de tiol de cisteína; 3. Captura de las cisteínas lipicadas con una resina tiol-reactiva; 4. Enriquecimiento selectivo de las proteínas S-acylated después de la elución con tampón reductor.
Las proteínas capturadas pueden ser analizadas mediante inmunoblotting o sometidas a espectrometría de masas (MS) proteómica para evaluar el proteoma S-acilado en una variada gama de especies y tejidos22,,24,,25. Los sitios individuales de S-acylation también pueden ser identificados por la digestión de la trippsina de las proteínas capturadas y el análisis de los péptidos resultantes por LC-MS/MS22. Aquí, demostramos cómo acile-RAC se puede utilizar para la detección simultánea de S-acylation de múltiples proteínas tanto en una línea celular como en una muestra de tejido.

<table><tbody><tr><td>cOmplete Inhibidor de la proteasa Tabletas de cóctel Sigma</td><td></td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxilamina (HAM)</td><td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>Metanetiosulfonato de metilo (MMTS)</td><td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotador de tubo</td><td>LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil &beta;-D-maltósido (DDM)</td><td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de fosfatasa 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Tiopropil-Sepharose 6B (TS)</td><td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonidos Quantrex Sonicator</td><td>L &; R</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detección de proteína s-acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

La proteína S-acylation, también conocida como S-palmitoylation, es una modificación post-traduccional reversible de residuos de cisteína con ácidos grasos de cadena larga a través de un enlace labile tioester. La acilación S, que está emergiendo como un mecanismo regulador generalizado, puede modular casi todos los aspectos de la actividad biológica de las proteínas, desde la formación compleja hasta el tráfico de proteínas y la estabilidad de las proteínas. Los recientes avances en la comprensión de la función biológica de la proteína S-acylation se lograron en gran medida debido al desarrollo de nuevas herramientas bioquímicas que permitieron la detección robusta y sensible de la proteína S-acylation en una variedad de muestras biológicas. Aquí, describimos la captura asistida por resina de acilo (Acyl-RAC), un método desarrollado recientemente basado en la captura selectiva de proteínas endógenamente S-aciladas por cuentas de sepharose tiol-reactivas. En comparación con los enfoques existentes, Acyl-RAC requiere menos pasos y puede producir resultados más fiables cuando se combina con espectrometría de masas para la identificación de nuevos objetivos de acilación S. Una limitación importante en esta técnica es la falta de capacidad para discriminar entre especies de ácidos grasos unidos a las cisteínas a través del mismo enlace tioester.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, primero usamos acyl-RAC para detectar simultáneamente S-acylation de varias proteínas en las células de Jurkat, una línea de células T inmortalizada originalmente derivada de la sangre periférica de un paciente de leucemia de células T27. Las proteínas de células T reguladoras previamente identificadas como S-acylated9,28,29 fueron elegidas para demostrar la ...

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) es un método altamente sensible, confiable y fácil de realizar para detectar la modificación reversible de los residuos de cisteína (S-acylation) en una variedad de muestras biológicas.

Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

La captura asistida de acil-resina o Acyl-RAC es un método sensible y fiable que se puede utilizar para detectar la proteína S-acilación en una variedad de muestras biológicas. Este protocolo evita algunas de las limitaciones del etiquetado metabólico y el etiquetado radioeléctrico, y permite la detección simultánea de S-acilación de múltiples proteínas. No sólo células vivas, sino también tejidos primarios y muestras congeladas.La acilación S puede regular una variedad de procesos celulares como el tráfico de proteínas, la focalización de la membrana plasmática, la transducción de señales, el transporte de hierro y las interacciones proteína-proteína. Es importante utilizar una solución de hidroxilamina recién preparada con pH cuidadosamente ajustado para cada experimento para asegurar un escote eficiente y específico del enlace de tioester. Con una demostración de este método es fundamental para pasos como cloroformo, precipitación de metanol.El pellet de forma de panqueque obtenido durante este paso debe manejarse con mucho cuidado. Puede ser frágil y la pérdida parcial de la muestra durante el paso puede conducir a una recuperación de la muestra desigual. Demostrar el procedimiento estará Savannah West, una estudiante graduada de nuestro laboratorio.Para obtener los lysates celulares, recoja las células de interés en un tubo de centrífuga cónica. Y retire los restos celulares por centrifugación. Lavar el pellet en 5 mililitros de PBS.Y resuspender inmediatamente las células en 600 microlitros de tampón de lelisis recién preparado. Agitar la muestra a 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Antes de limpiar los lysates, detergente de pellets y material soluble por centrifugación.Al final de la centrifugación, recoger el izado despejado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preenfriado sobre hielo. Y realizar un ensayo de Bradford o ácido bicinchoninic para estimar la concentración de proteínas de acuerdo con los protocolos estándar. Añadir metanol y cloroformo para el izado en una proporción de 2:1.Agitar rigurosamente para crear una suspensión homogénea y centrifugar la muestra para recoger un pellet de proteína en la interfaz entre las fases acuosa y orgánica. Inclinar el tubo, utilizar una aguja o una punta de carga de gel para aspirar tanto disolvente como sea posible. Seque al aire el pellet proteico durante unos minutos.Antes de mezclar suavemente el contenido del tubo con 600 microlitros de metanol, teniendo cuidado de no romper el pellet. Después de retirar cuidadosamente el lavado de metanol, seque el pellet proteico en una mesa de banco durante aproximadamente cinco minutos. A continuación, resuspender el pellet de proteína en 200 microlitros de tampón 2SHB.Y vórtice a 42 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico. Cuando el pellet se disuelva, agregue 200 microlitros de 0.2%MMTS en 2SHB a la muestra. E incubar la proteína durante 15 minutos a 42 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico.Al final de la incubación, realizar 3:4 precipitaciones de cloroformo-metanol como se demuestra. Para eliminar el MMTS, disuelva el pellet en 100 microlitros de tampón 2SHB fresco con vórtice. Y diluir la muestra con 300 microlitros de tampón A después de cada precipitación.Después de la precipitación final, disolver las muestras en 200 microlitros de tampón 2SHB y diluir con 240 microlitros de tampón A.Medir la concentración de proteína de nuevo y reservar 40 microlitros de cada muestra como controles de entrada. Divida las muestras en dos volúmenes iguales de 200 microlitros. Y marcar los tubos como más hidroxiamina y menos hidroxiamina.Añadir 50 microlitros de dos hidroxiamina molares neutrales recién preparados a una concentración final de 400 mililitros al tubo de hidroxilamina más. Y 50 microlitros de cloruro de sodio molar neutro al control negativo, un tubo menos hidroxiamina. A continuación, agregue 30 microlitros de lodo de perlas TS a cada tubo.Y gire los tubos durante una o dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación lavar las cuentas cuatro veces con 1%SDS en el tampón A para eliminar cualquier hidroxilamina residual. Después del último lavado, lave todas las muestras de cuentas con tres microcentrifugaciones suaves de un minuto.Aspirar cuidadosamente los sobrenadantes y resuspender las perlas en 500 microlitros de 1%SDS en el tampón A en cada lavado. Después del último lavado, gire suavemente hacia abajo las cuentas como se ha demostrado. Y aspirar tanto sobrenadante como sea posible sin alterar las cuentas.Para recuperar las proteínas de las perlas, agregue 50 microlitros de tampón de muestra 4%SDS a cada tubo e incubar las muestras a 80 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto durante 15 minutos en un agitador térmico. Al final de la incubación, deje que las muestras se enfríen antes de centrifugar para peletizar completamente las perlas. Luego usa una punta de carga de gel para transferir las proteínas eluidas a nuevos tubos de 1,5 mililitros.Y ejecuta las muestras en un gel SDS-PAGE para analizar la S-acilación de las proteínas de interés por western blotting. La tirosina quinasa Lck se puede detectar en licanatos tratados con dos hidroxiamina molares neutrales. para cortar el enlace de tioester entre los residuos de cisteína y la mitad de ácidos grasos.El despojo y el reproche con anticuerpos contra proteínas Fyn y LAT demuestran que el ensayo de captura asistida por acil-resina se puede utilizar para analizar la Acilación S de múltiples proteínas al mismo tiempo. Además, la Acilación S de Lck, Fyn y LAT se puede detectar fácilmente en los splenocitos primarios de ratón. Indicando que esta modificación se conserva entre dos especies.Además de la identificación de nuevas proteínas S-aciladas, este método también se puede utilizar para evaluar los cambios en la proteína S-acilación en diferentes condiciones biológicas. El número de proteínas S-aciladas recién identificadas ha aumentado enormemente después de que el doble significado una técnica rápida y confiable como Acyl-RAC. Además de la identificación de nuevas proteínas S-aciladas, este método también se puede utilizar para evaluar los cambios en la proteína S-acilación en diferentes condiciones biológicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura...

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

Proteínas de la superficie celular son biológicamente importantes y ampliamente glicosilada. Presentamos aquí un enfoque glucopéptidos captura para solubilizar, enriquecer y deglycosylate estas proteínas para análisis proteómicos fáciles LC-MS basados.

Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

Este protocolo describe los pasos necesarios para ejecutar ensayos de desacetilación in vitro e in vivo con el fin de establecer el papel de las proteínas como sustratos de desacetilación específicos para las sirtuinas y estudiar más a fondo el papel de la acetilación reversible de lisina como modificación postraduccional.

Ensayos de desacetilación para desentrañar la interacción entre las sirtuinas (SIRT2) y proteína-sustratos específicos

Describimos un método para generar líneas celulares estables inducibles marcadas con localización y purificación por afinidad (LAP) para investigar la función de las proteínas, la localización subcelular espacio-temporal y las redes de interacción proteína-proteína.

Inducible líneas celulares estables LAP-etiquetado para la investigación de la función de proteínas, espacio-temporal y localización de las redes de interacción de proteínas

Ácido siálico es una típica unidad de monosacárido encontrada en glicoconjugados. Participa en una gran cantidad de interacciones moleculares y celulares. Aquí presentamos un método para modificar la expresión de superficie ácido siálico celular con glycoengineering metabólico derivados de N- acetylmannosamine.

Glycoengineering metabólico del ácido siálico utilizando N-acil-modificado Mannosamines

Investigando múltiples, modificaciones post-traduccionales endógenas para una proteína de la blanco pueden ser extremadamente difíciles. Técnicas descritas aquí utilizan un sistema de buffer y filtro de lisis optimizado desarrollado con metas específicas de PTM, matrices de afinidad para detectar las modificaciones de fosforilación de tirosina, acetilación, ubiquitinación y sumoilación 2/3 para un objetivo proteína mediante un sistema único y aerodinámico.

Utilizando un sistema de enriquecimiento integral inmunoprecipitación para identificar un perfil endógeno modificación poste-de translación de proteínas blanco

Aquí, presentamos imparcial cuantificación de proteína específica acetilación o succinylation ocupación (estequiometría) de un proteoma completo mediante un análisis radiométrica de modificaciones endógenas a modificaciones introducidas después de cuantitativo química acilación con anhídridos marcado con el isótopo estables. En combinación con la espectrometría de masas adquisición independiente de los datos sensibles, se obtienen mediciones de ocupación del sitio exacto.

Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

El estudio de la acilación grasa tiene importantes implicaciones en las interacciones y enfermedades de las proteínas celulares. Aquí se presenta un protocolo modificado para mejorar la detección química de clics de proteínas aciladas grasas, que se puede aplicar en varios tipos de células y combinarse con otros ensayos, incluida la persecución de pulsos y la espectrometría de masas.

Incorporación optimizada de análogos de ácidos grasos alquilinos para la detección de proteínas aciladas grasas utilizando Click Chemistry

La oxidación de la proteína tiol tiene implicaciones significativas en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas normales. Describimos los detalles de un método cuantitativo de proteómica redox, que utiliza captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas, lo que permite la identificación y cuantificación de proteínas de cisteína oxidadas reversibles.

Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

Aprende a detectar S-acilación proteica mediante captura asistida por resina acilo en células vivas, tejidos primarios y muestras congeladas. Este método sensible permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas.

Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

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