Name: Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprende a determinar el estado de palmitoilación de proteínas de membrana cerebral mediante el ensayo APEGS, que utiliza cambios en la movilidad en gel sin necesidad de purificación por afinidad.

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Los autores agradecen a K. Woolfrey por su consejo y aportación sobre el ensayo APEGS. Estos estudios fueron financiados por becas de investigación a E.D. de la Fundación Whitehall y el NIH-NIMH (1R01MH119347).

Todos los procedimientos de animales siguieron las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis.
1. Preparación de membranas cerebrales de ratón
<ol><li>Decapitar el ratón usando un aparato de guillotina y diseccionar el cerebro rápidamente (en <1 min, si es posible, para minimizar los cambios de palmitoylación que pueden ocurrir durante el procedimiento de disección). Homogeneizar inmediatamente en 10 ml de tampón de homogeneización(Tabla 1) en un homogeneizador de vidrio (12 golpes) sobre hielo.</li>
	<li>Centrifugar los lysates durante 15 min a 1.400 x g a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo sobre hielo. Resuspenda el pellet (6 golpes) en un volumen igual de tampón de homogeneización y centrífuga a 710 x g durante 10 min a 4 oC.</li>
	<li>Combine los sobrenadores del paso 1.2 y centrífuga a 40.000 x g durante 20 min a 4 oC.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante (fracción citosólica) y resuspenda la fracción de membrana peletada (P2) en el tampón de homogeneización. NOTA: Las muestras pueden congelarse y almacenarse a -80 oC para su uso posterior.</li>
	<li>Realizar un ensayo de ácido bicincino (BCA) para cuantificar los niveles de proteína. Para el ensayo APEGS, comience con una proteína de 100 a 200 mg (máximo 250 mg) en un volumen de 470 ml de tampón A(Tabla 1) en un tubo de 1,5 ml. Sonicar y centrifugar a >13.000 x g durante 10 min a 25oC para eliminar la proteína insoluble. Transfiera la proteína solubilizada a un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
</ol>2. Ensayo de intercambio de gel de Acyl-PEGyl (APEGS)
<ol><li>Interrumpe los enlaces de disulfuro y bloquea las cisteínas libres.<ol>
<li>Interrumpir los enlaces de disulfuro mediante la incubación en 25 mM tris(2-carboxiletyl)fosfina (TCEP; 25 l, añadido a partir de una solución de stock; Tabla 1) durante 60 min a 55oC.</li>
		<li>Bloquear las cisteínas libres de bloques con 50 mM de N-etilmaleimida (NEM; 12,5 l, añadidos a partir de una solución de stock; Tabla 1) a temperatura ambiente durante 3 h. NOTA: La reacción se puede extender durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realice precipitaciones de metanol de cloroformo (CM).<ol>
<li>Transfiera la solución proteica de un tubo de 1,5 ml a un tubo de polipropileno o de vidrio que se puede centrifugar en un rotor de cubo oscilante a una velocidad modesta. Un tubo de 5 ml es ideal. Agregue cuatro volúmenes (2 ml) de metanol (MeOH) y vórtice brevemente.</li>
		<li>Agregue brevemente dos volúmenes (1 ml) de cloroformo y vórtice.</li>
		<li>Agregue brevemente tres volúmenes (1,5 ml) de dH2O y vórtice.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 3.000 x g durante 30 min a 25 oC en un rotor de cucharón oscilante.</li>
		<li>Retire y deseche cuidadosamente la fase superior.</li>
		<li>Añadir 3 volúmenes (1,5 ml) de MeOH y mezclar suavemente pero a fondo, teniendo cuidado de no fragmentar el panqueque de proteína opaca.</li>
		<li>Centrífuga a 3.000 x g durante 10 min a 25oC en un rotor de cucharón oscilante.</li>
		<li>Usando una pipa serológica de vidrio, eliminar la mayor parte de la fase superior posible sin alterar el panqueque de proteína.</li>
		<li>Enjuague cuidadosamente el pellet con 1 ml de MeOH.</li>
		<li>Seque al aire el pellet durante al menos 10 min. NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar escote de enlaces palmitóilo-tioester con hidroxilamina (NH2OH, HAM).<ol>
<li>Resuspenda el precipitado proteico en 125 ml de tampón A y sonice brevemente. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC para eliminar el material insoluble. Transfiera la proteína solubilizada a un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Añadir 375 sl de tampón H (HAM+; Tabla 1) o tampón T (HAM-; Tabla 1) e incubar muestras durante 60 min a 25oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita la precipitación CM descrita en el paso 2.2. NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC.</li>
	<li>Añadir mPEG a las cisteas desprotegidas.<ol>
<li>Resuspenda el gránulo en 100 ml de tampón A que contenga 10 mM TCEP. Transfiera a un tubo de 1,5 ml. NOTA: Es normal que se haya producido una pérdida significativa de proteína durante los pasos de precipitación de CM. Todos los pasos subsiguientes se realizarán en un tubo de 1,5 ml, limitando el volumen de proteína a un máximo de 120 a 130 l. Esto reducirá la pérdida de proteínas durante la precipitación final del CM.</li>
		<li>Añadir 20 mM mPEG-5k (25 l, añadidos desde una solución de stock; Tabla 1) a la muestra de proteínas y mezclar por pipeteo. Incubar durante 60 min a 25oC con rotación de extremo sobre extremo.</li>
		<li>Para eliminar mPEG-5k no incorporado, realice la precipitación CM como se describe en el paso 2.2 utilizando estos volúmenes ajustados: 4 volúmenes de MeOH (500 l), 2 volúmenes de cloroformo (250 l) y 3 volúmenes de dH2O (375 ol). Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC.</li>
		<li>Retire cuidadosamente la fase superior como antes, evitando el panqueque grueso y floculante. Añadir 1 mL de MeOH y mezclar suavemente pero a fondo. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC.</li>
		<li>Retire cuidadosamente el sobrenadante y enjuague el pellet con 1 ml de MeOH. Centrífuga a >13.000 x g durante 10 min a 25oC. Pellets secos al aire. NOTA: El pellet seco se puede almacenar a -20 oC.</li>
		<li>Resuspenda el gránulo seco en 50 ml de tampón A (sin TCEP ni ningún agente reductor). Reservar 5 l para la cuantificación de proteínas BCA. Después de la cuantificación, añadir una cantidad adecuada de 4x Tampón de muestra de Laemmli y, dependiendo de la proteína de interés, potencialmente calentar la muestra a 70 o 100 oC durante 10 min. NOTA: La ebullición puede causar la agregación de algunas proteínas de membrana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de manchas occidentales de proteínas PEGylated
<ol><li>Cargue la muestra en un gel de electroforesis de gel de poliacrilamida dodecilo sulfato sódico (SDS-PAGE)13. NOTA: En este protocolo se utilizó 10% poliacrilamida.</li>
	<li>Utilice protocolos estándar de separación, transferencia y detección para western blotting14.</li>
	<li>Utilice densitometría14 para determinar las cantidades relativas de proteínas PEGylated frente a proteínas no PEGylated.</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En nuestro trabajo anterior, utilizamos el ensayo ABE para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función6. Una limitación es que el ensayo ABE requiere purificación de afinidad con resinas de agarosa conjugadas con mitades de avidina como el paso final en el procedimiento, lo que resulta en una pérdida significat...

La S-palmitoylation es una modificación post-traduccional reversible de las proteínas diana que regula la asociación estable de membranas, el tráfico de proteínas y las interacciones proteína-proteína1. Implica la adición de una mitad de palmitato de 16 carbono a los residuos de cisteína a través del enlace tioéster catalizado por las enzimas palmitoyl acyltransferase (PAT). Muchas proteínas sinápticas en el cerebro son palmitoylated, incluyendo AMPA-Rs y PSD-95, de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización, y la función2,3,4. Las alteraciones en los niveles de LOS AFOR sinápticos en el PSD a través de la interacción de factores auxiliares con andamios sinápticos como el PSD-95 subyace en la plasticidad sináptica; por lo tanto, los métodos para determinar el estado de palmitoylación de las proteínas sinápticas proporcionan una visión importante de los mecanismos de plasticidad sináptica.
Anteriormente, identificamos la familia SynDIG de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los AmpARs5. La sobreexpresión o desmontaje de SynDIG1 en las neuronas del hipocampo de ratas disociadas aumenta o disminuye, respectivamente, el tamaño y el número de la sinapsis AMPA-R en un 50 % según se detecte mediante inmunocitoquímica y electrofisiología5. Utilizamos el ensayo de intercambio de acilina de acilo (ABE) para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función6. El ensayo ABE se basa en el intercambio de biotina en cisteínas protegidas por la modificación y posterior purificación de afinidad7. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acyl-PEGyl (APEGS)8,9,10,11,12, que no requiere purificación de afinidad y en su lugar utiliza cambios en la movilidad del gel para determinar el número de modificaciones para una proteína de interés. El protocolo se describe para la investigación de proteínas de membrana endógenas del cerebro del ratón para los que se dispone de anticuerpos adecuados.

<table><tbody><tr><td>Hidroxilamina (HAM)</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>Metoxi-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~5000 kDa</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>o equipo equivalente</td></tr><tr><td>N-etilmalemida (NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>Altamente tóxico.</td></tr><tr><td>Generador de imágenes óptico para densitometría</td>, <td>Azure Biosystems</td><td>, Sapphire Biomolecular Imager</td><td>o equipo equivalente</td></tr><tr><td>, Tubos de polipropileno con tapón</td>, <td>Fisher Scientific</td>, <td>14-956-1D</td><td></td></tr>, <tr><td>Pipetas serológicas (vidrio)</td><td>Fisher Scientific</td>, <td>13-678-27D</td><td></td>,</tr><tr><td>centrífuga de sobremesa</td>, <td>Beckman</td><td>, Allegra, X-15R</td><td>o equipo equivalente</td></tr><tr><td>Clorhidrato de fosfina (2-carboxietil) Tris (TCEP)</td><td>EMD Millipore</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de cambio de gel de intercambio acyl-pegyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Alteraciones dependientes de la actividad en los niveles de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro de la densidad postsináptica (PSD) se cree que representan un mecanismo celular para el aprendizaje y la memoria. La palmitoylation regula la localización y la función de muchas proteínas sinápticas, incluyendo AMPA-R, factores auxiliares y andamios sinápticos de una manera dependiente de la actividad. Identificamos la familia de genes inducidos por la diferenciación de la sinapsis (SynDIG) de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los ACAR y regulan la fuerza de la sinapsis. SynDIG1 se palmitoylated en dos residuos de cisteína ubicados en las posiciones 191 y 192 en la región de la yuxta-transmembrana importante para el desarrollo de sinapsis excitatoria dependiente de la actividad. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitilación de cualquier proteína de interés y demostrar su utilidad con la familia de proteínas SynDIG en los cascos cerebrales de ratón.

La inmunoblotación con anticuerpos contra la proteína de interés revela el estado palmitilado (no, por separado, doblemente, etc.) en los efectos cerebrales del ratón según lo determinado por el cambio de movilidad en comparación con las muestras en las que no se incluyó el HAM. Anteriormente, habíamos demostrado que SynDIG1 estaba palmitoylated en dos sitios utilizando el ensayo ABE6; sin embargo, no pudimos determinar si ambos sitios fueron modificados en el teji...

La palmitoylación implica la incorporación de una mitad de palmitato de 16 carbonos a los residuos de cisteína de proteínas diana de una manera reversible. Aquí, describimos un enfoque bioquímico, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitoylación de cualquier proteína de interés en los cascos cerebrales de ratón.

Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Este método bioquímico permite la determinación del estado de palmitoilación de cualquier proteína de membrana expresada en el cerebro para la que se dispone de un anticuerpo adecuado. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere purificación de afinidad y en su lugar utiliza cambios en la movilidad del gel para determinar el número de modificaciones de una proteína de interés. Después de diseccionar el cerebro, homogeneizarlo inmediatamente en 10 mililitros de tampón de homogeneización en un homogeneizador de vidrio sobre hielo.Usando aproximadamente 12 golpes, centrifugar los lysates durante 15 minutos a 1400 veces G, y cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo sobre hielo. Resuspender el pellet en 10 mililitros de tampón de homogeneización.Homogeneizarlo usando aproximadamente seis golpes. Centrifugar la suspensión a 710 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Combina los sobrenadantes y los centrifuga a 40.000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.Deseche el sobrenadante y resusppend la fracción de membrana peletada en un tampón de homogeneización rompiendo el pellet con una punta de pipeta y pipeteando arriba y abajo. Realizar el ensayo ABCA para cuantificar los niveles de proteína. Para realizar el ensayo APEGS, coloque 470 microlitros de tampón A en un tubo de 1,5 mililitros y agregue aproximadamente 100 a 200 miligramos de proteína.Sonicar el tubo y luego separar la proteína insoluble centrifugando el tubo a 25 grados Celsius y un mínimo de 13.000 veces G durante 10 minutos. Transfiera la proteína solubalizada a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. En primer lugar, interrumpir los enlaces de disulfuro incubando la proteína solubalizada en 25 microlitros de TCEP durante 60 minutos a 55 grados centígrados.A continuación, bloquee los cicinos libres incubando la solución con 12,5 microlitros de la solución de stock de NEM durante tres horas a temperatura ambiente. A continuación, comenzar el proceso de precipitación de metanol cloroformo. Transfiera la solución proteica del tubo de 1,5 mililitros a un tubo de polipropileno o vidrio que se pueda centrifugar en un rotor de cubo oscilante a una velocidad modesta.Agregue dos mililitros de metanol y vórtice brevemente. Añadir un mililitro de cloroformo y vórtice brevemente. A continuación, agregue 1,5 mililitros de agua desionizada y vórtice brevemente de nuevo.Si es necesario, invierta el tubo para asegurar una mezcla exhaustiva. Centrifugar las muestras a 3000 veces G y 25 grados Celsius durante 30 minutos en un rotor de cubo oscilante. Retire y deseche cuidadosamente la fase superior de la solución en un tubo.Añadir 1,5 mililitros de metanol. Mezclar suavemente pero a fondo por la inversión suave del tubo, teniendo cuidado de no fragmentar el panqueque de proteína opaca. Centrifugar la muestra a 3000 veces G y 25 grados Celsius durante 10 minutos en un rotor de cubo oscilante.Con una pipeta serológica de vidrio, retire la mayor parte de la fase superior de la solución como sea posible sin alterar el panqueque proteico. Enjuague cuidadosamente el pellet con un mililitro de metanol y deje que se seque al aire durante al menos 10 minutos. Con la precipitación de metanol cloroformo completa, comience el escote de los enlaces de tioester de palmitoilo resusppendiendo el precipitado de proteína en 125 microlitros de tampón A.Transfer a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.Sonicar el tubo brevemente y luego centrifugarlo a 13.000 veces G o más o más y 25 grados Celsius durante 10 minutos para eliminar el material insoluble. Transfiera la proteína solubalizada a nuevos tubos de 1,5 mililitros y añada 375 microlitros de tampón H o tampón T.Después de incubar las muestras durante 60 minutos a temperatura ambiente, repita la precipitación de metanol cloroformo. Para añadir m-PEG a las ciisteínas desprotegidas, comience resuspendiendo el pellet en 100 microlitros de tampón A que contienen 10 mil o más TCEP.A continuación, transfiera la suspensión a un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 25 microlitros de la solución m-PEG 5K y mezclar por pipeteo. Incubar a temperatura ambiente con rotación de extremo sobre extremo.Después de 60 minutos de incubación, retire m-PEG 5K no incorporado realizando de nuevo la precipitación de metanol cloroformo. Centrifugar a más de 13.000 veces G y 25 grados centígrados durante 10 minutos. Retire cuidadosamente la fase superior como antes, evitando el panqueque grueso y floculante.Agregue un mililitro de metanol y mezcle suavemente pero a fondo. Centrifugar a más de 13.000 veces G y 25 grados centígrados durante 10 minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y enjuague el pellet con un mililitro de metanol.Una vez más, centrifugar a más de 13.000 veces G y 25 grados celsius durante 10 minutos. Después de secar al aire el pellet, resuspenderlo en 50 microlitros de tampón A sin TCEP o cualquier agente reductor. Reserve 5 microlitros de la solución para la cuantificación de proteínas BCA.Después de la cuantificación, agregue una cantidad adecuada de búfer de muestra de 4x Laemmli. Cargue la muestra en un gel de página SDS. Utilice protocolos estándar de transferencia y detección de separación para la hinchazón occidental.Para investigar el estado de palmitoilación de las proteínas SynDIG, las fracciones de membrana P2 de cerebros de ratón homogeneizados fueron sometidas al ensayo APEGS. La separación y el sondeo con anticuerpos demostraron que SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 y Prrt2 están palmitoilados en el cerebro del ratón. El propósito de la precipitación de metanol cloroformo es evitar que un producto químico, como NEM, interfiera con el siguiente paso del protocolo.Una precipitación adecuada de metanol cloroformo eliminará los productos químicos indeseables al tiempo que minimiza la pérdida de proteínas. Este método se puede aplicar a los licatos cerebrales de ratones de diferentes edades o de diferentes regiones cerebrales para investigar las regulaciones espaciales-temporales de la palmitoilación.

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

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Biochemistry

Bioquímica

Endocitosis regulado regula los niveles de expresión de la superficie celular de la mayoría de las proteínas de la membrana. Aquí se utilizan los reactivos reducible, la membrana impermeant biotinilación para medir la tasa de endocitosis del transportador de dopamina (DAT), una proteína de membrana politópica. El método facilita un método directo para medir la tasa de endocitosis de la mayoría de las proteínas de la membrana plasmática.

Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

El vídeo muestra el análisis del estado de palmitoilación de proteínas de la membrana celular aisladas de tejido cerebral de ratón. El proceso consiste en exponer las cisteínas no palmitoiladas y bloquearlas, y luego usar un polímero que se une a las cisteínas palmitoiladas, lo que ayuda a evaluar el estado de palmitoilación de las proteínas aisladas.

Evaluación del estado de palmitoilación de las proteínas de la membrana celular a partir de tejido cerebral de ratón

La adición de palmitato reversible a las proteínas es un importante regulador de tráfico intracelular de proteínas. Esto es de particular interés en las neuronas donde muchas proteínas sinápticas se palmitoilada. Nosotros utilizamos un método simple bioquímico para detectar proteínas palmitoiladas en las neuronas cultivadas, que pueden ser adaptados para múltiples tipos de células y tejidos.

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) es un método altamente sensible, confiable y fácil de realizar para detectar la modificación reversible de los residuos de cisteína (S-acylation) en una variedad de muestras biológicas.

Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

El estudio de la acilación grasa tiene importantes implicaciones en las interacciones y enfermedades de las proteínas celulares. Aquí se presenta un protocolo modificado para mejorar la detección química de clics de proteínas aciladas grasas, que se puede aplicar en varios tipos de células y combinarse con otros ensayos, incluida la persecución de pulsos y la espectrometría de masas.

Incorporación optimizada de análogos de ácidos grasos alquilinos para la detección de proteínas aciladas grasas utilizando Click Chemistry

Aquí, describimos protocolos que utilizan sensores de lípidos fluorescentes y liposomas para determinar si una proteína extrae y transporta fosfatidilserina o fosfatidilinositol 4-fosfato in vitro.

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Describimos un método para utilizar la ciclodextrina para mediar el intercambio entre lípidos de la membrana plasmática con lípidos exógenos. Esta técnica se puede combinar con experimentos que estudian proteínas transmembrana, que se comportan de manera diferente en entornos lipídicos similares a balsas que en entornos no similares a balsas.

Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

Este estudio describe métodos experimentales para caracterizar bioquímicamente el GFAP y sus mutaciones causantes de enfermedades, centrándose en el ensamblaje, agregación y modificación postraduccional de filamentos. Se analizaron proteínas GFAP de alta pureza, lo que reveló conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad de Alexander que podrían proporcionar un marco para estudiar posibles objetivos terapéuticos y comprender las mutaciones y trastornos relacionados con GFAP.

Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

Aprende a determinar el estado de palmitoilación de proteínas de membrana cerebral mediante el ensayo APEGS, que utiliza cambios en la movilidad en gel sin necesidad de purificación por afinidad.

Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral (Video) | JoVE Journal

Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral

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