Name: Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende hibridación in situ para detectar ARN mensajero en el fluido celómico de Sipunculus nudus, un recurso pesquero importante. Este método permite visualizar patrones de expresión génica específicos.

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Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Jóvenes Científicos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Beca No. 31801034), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian, China (2016J01161), los Fondos de Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao (15BS306) y el Fondo Innovador de Posgrados en Investigación Científica de la Universidad de Huaqiao.

El procedimiento animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Bienestar Animal de la Universidad de Huaqiao.
1. Preparación de ribosondas
<ol><li>Diseño de imprimación<ol>
<li>Abra el programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copie la secuencia dmrt1 (GenBank: MK182259) en la ventana de secuencia.</li>
		<li>Ajuste la longitud de imprimación (23-25 bp), la temperatura de fusión (55-60 oC) y el contenido de G/C (40-60%). Haga clic en Seleccionar imprimaciones. NOTA: El tamaño mínimo requerido para la sonda de ARN es de aproximadamente 500 bp. Las sondas más largas normalmente tienen mayor especificidad.</li>
		<li>Agregue la secuencia promotora de la polimerasa de ARN T7 (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) a una de las imprimaciones seleccionadas. Las secuencias de imprimación dmrt1 para ISH se muestran en la Tabla 1. NOTA: Para las sondas de detección, el promotor de la polimerasa de ARN T7 se encuentra en el extremo de 5' de las imprimaciones delanteras. Para las sondas antisentido, el promotor de la polimerasa de ARN T7 se encuentra en el extremo 5 de las imprimaciones inversas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificación de PCR<ol>
<li>Colocar los tubos de microfúctil sobre hielo y preparar la siguiente mezcla de reacción (para una reacción de 50 l): 1 mezcla de ADN polimerasa Taq, 1 g de ADNc (que se prepara a partir de 100 ml de líquido celómico), imprimación delantera de 1 m, imprimación inversa de 1 m y agua libre de nucleasas.</li>
		<li>Mezcle brevemente la reacción de PCR pipeteando y centrífuga.</li>
		<li>Colocar el tubo de reacción en un ciclor térmico, y ejecutar el PCR utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 oC durante 2 min seguida de 36 ciclos de desnaturalización a 95 oC durante 30 s, recocido a 55-60 oC para 30 s, extensión a 72 oC para 30 s y una extensión final a 72 oC durante 7 min. NOTA: La temperatura de recocido debe optimizarse de acuerdo con las imprimaciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificación y verificación de productos PCR<ol>
<li>Cargue la mezcla de PCR de 50 ml directamente sobre un gel de agarosa del 1%. Ejecute el gel de agarosa a 150-180 V durante 10 min en 0.5x TBE. Aísle los fragmentos específicos de ADN del gel de agarosa del 1%. NOTA: El ADN debe aparecer como una sola banda y no como un frotis.</li>
		<li>Purificar los fragmentos de ADN utilizando un kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuantificar los productos purificados mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 260 nm.</li>
		<li>Verifique la autenticidad de los productos PCR por secuenciación. NOTA: (Punto de pausa) Los productos de PCR purificados se pueden almacenar a -20 oC durante varios meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Síntesis de ribosondas<ol>
<li>Coloque los tubos de microfúgelos libres de RNase sobre hielo y añada lo siguiente al tubo de microfúge (para una reacción de 10 l): 1 x mezcla de etiquetado de ARN Digoxygenin, 1 tampón de transcripción de 1x, 0,5 l de inhibidores de la RNase, 1 l de polimerasas de ARN T7, 1 g de producto de PCR y agua libre de rnalos. Mezcle brevemente la reacción pipeteando y centrífuga. Incubar durante 2 h a 37oC.</li>
		<li>Añadir 2 l de DNase I libre de RNase. Mezclar brevemente la reacción pipeteando y centrífuga. Incubar durante 15 min a 37oC.</li>
		<li>Añadir 2 sL 0,2 M EDTA (pH 8.0). Mezcle brevemente la reacción pipeteando y centrífuga.</li>
		<li>Añadir 2,5 ml de LiCl de 4 M y 75 ml de etanol preenfriado a la reacción anterior. Mezcla bien. Dejar actuar durante 30 min a -70oC.</li>
		<li>Centrífuga a 12.000 x g durante 10 min a 4oC. Decantar el etanol. Añadir 1 ml de etanol preenfriado al 70% (v/v) y lavar la precipitación mezclando suavemente.</li>
		<li>Centrífuga a 12.000 x g durante 5 min a 4oC. Decantar el 70% de etanol y secar la precipitación brevemente cerca de una lámpara de alcohol. Disuelve la precipitación añadiendo 30 ml de agua libre de RNase y mezcle suavemente.</li>
		<li>Cargar 2 ml de ARN sintetizado en un gel de agarosa del 1%. Ejecute el gel de agarosa a 180 V durante 5-10 min en 0.5x TBE. Mida la concentración del ARN etiquetado utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.<ol>
<li>Utilice tubos de microfusión libres de RNase y puntas de filtro para evitar la contaminación de RNase. NOTA: (Punto de pausa) Las sondas etiquetadas con digoxigenina se pueden almacenar a -70 oC durante varios meses.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Recolección de fluidos coelómicos
<ol><li>Fije el S. nudus en la mesa de disección con alfileres. Abra el cuerpo del S. nudus con pequeñas tijeras autoclave. Aísle el líquido celómico con una pipeta.</li>
	<li>Recoger y transferir 1 ml de líquido coelómico con una pipeta a diapositivas de microscopio tratadas con poli-D-lisina. Aplique el líquido celómico uniformemente con una punta de pipeta. Seque los portaobjetos durante 1 h a 37oC.</li>
</ol>3. Hibridación in situ
<ol><li>Día 1<ol>
<li>Rehidrata los portaobjetos en un frasco de tinción deslizante que contiene 100 ml de 1 x solución salina tamponada con fosfato tratado con pirocarbonato de dietil (DEPC-PBS). Rehidratar 3 veces con 1x DEPC-PBS, 5 min por lavado con agitación suave.</li>
		<li>Permeabilizar el frotis de líquido celómico por digestión con 10 g/ml de proteinasa K a temperatura ambiente durante 5 min. Incubar los portaobjetos en 4% paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos para detener la digestión. Lave los portaobjetos en 1x DEPC-PBS con agitación suave durante 5 min 3 veces.</li>
		<li>Añadir 50 l de mezcla de hibridación (HM) que contiene la ribosondas sentido/antisentido en las diapositivas y añadir un resbalón de cubierta.</li>
		<li>Agregue el tampón de la caja húmeda a la caja húmeda. Coloque las diapositivas en la caja húmeda y selle bien con película de parafina. Hibridación durante la noche (al menos 16 h) a 60oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 2<ol>
<li>Precalentar el tampón de lavado a 65 oC. Sumerja la diapositiva en el frasco de tinción de la diapositiva que contiene el tampón de lavado y déjelo reposar hasta que el cubreobjetos se deslice automáticamente. Se tarda unos 5 minutos.</li>
		<li>Lavar 2 veces con tampón de lavado a 65oC, 30 min por lavado con agitación suave. Lavar 2 veces con un citrato de solución salina-sodio (SSC) a 65oC, 30 min por lavado con una agitación suave. Lavar 2 veces con tampón de ácido maleico que contiene Tween 20 (MABT) a temperatura ambiente, 30 min por lavado con agitación suave.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 3-4 h en el tampón de bloqueo. Incubar las diapositivas en 1 ml de solución de fragmentos antidigoxigenina-AP Fab diluido a 1/5000 con el tampón de bloqueo a 4oC durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 3<ol>
<li>Retire la solución de anticuerpos y lave los portaobjetos brevemente en MABT. Lavar 4 veces con MABT a temperatura ambiente, 25 minutos por lavado con agitación suave.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos con tampón de fosfatasa alcalina a temperatura ambiente 3 veces, 5 min por lavado. Retire el tampón de fosfatasa alcalina y agregue 1 ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolyl fosfato (BCIP)/nitro azul tetrazolium (NBT) solución de tinción. Mantenga las diapositivas en la oscuridad.</li>
		<li>Observe la reacción del color periódicamente bajo un microscopio óptico. Cuando el color esté completamente desarrollado (tiempo de reacción en el rango de 1-4 h), lave los portaobjetos 2 veces con MABT a temperatura ambiente, 5 min por lavado con agitación suave.</li>
		<li>Lavar 2 veces con solución de parada a temperatura ambiente, 15 minutos por lavado con agitación suave. Incubar los portaobjetos en metanol para eliminar el exceso de manchas, a temperatura ambiente durante 30 min. De acuerdo con el color de fondo, el lavado de metanol se puede hacer 2 o 3 veces y el tiempo de decoloración se puede extender.</li>
		<li>Lavar 2 veces con MABT a temperatura ambiente, 5 min por lavado con agitación suave. Transfiera las diapositivas a un papel de filtro nuevo. Añadir 50 s de glicerol. Agregue los labios de las cubiertas y observe microscópicamente. NOTA: La composición de la solución se muestra en la Tabla 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li>
<li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li>
<li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li>
<li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li>
<li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884(2009).</li>
<li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721%2C+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li>
<li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li>
<li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li>
<li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt1%2C+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators%2C+is+required+for+mammalian+testis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).</li>
<li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li>
<li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41(2012).</li>
<li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Hydrobiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361(1993).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Estudios anteriores mostraron que la ISH es adecuada para detectar múltiples ARN objetivo16,17,18. En este protocolo, describimos un método ISH de alta resolución para detectar el ARNm en fluido celómico y enfatizar las condiciones de hibridación optimizadas en Sipunculus nudus. Las señales obvias de dmrt1 que observamos demostraron la aplicación exitosa de este protocolo en la detección de la expresión génica<...

Ish, utilizando una sonda de ácido nucleico etiquetada para detectar la secuencia específica de ADN o ARN de interés, es un método útil para describir el patrón de expresión espacial de genes diana en tejidos morfológicamente preservados1,2,3. Normalmente, la secuencia diana es generada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y luego se utiliza como plantilla para sintetizar la sonda de ARN antisentido/sentido etiquetada con digoxigenina uridina-5'-trifosfato. Las muestras se fijan y permeabilizan antes de la incubación con ribosondas. Después de lavar el exceso de sonda, la hibridación es visualizada por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-digoxigenina, que es fosfatasa alcalina conjugada3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; order Sipunculida: Sipunculidae) es un gusano marino no segmentado, coelomate y bilateralmente simétrico7,8. Sipunculus nudus es una especie cosmopolita ampliamente distribuida en aguas costeras tropicales y templadas. También es un importante recurso pesquero marino en el sur de China debido a sus altos valores nutricionales y medicinales9,,10. Sin embargo, Sipunculus nudus en biología molecular todavía está en su infancia. Para entender plenamente el papel biológico de los genes, la investigación de los patrones de expresión de genes a una resolución celular es de gran interés. En el organismo no modelo Sipunculus nudus, el método ISH, que es un método ideal para detectar los patrones de expresión de genes, aún no se ha establecido. Su líquido celómico contiene varios tipos de células, incluyendo granulocitos, células de urna, células vesiculares, células germinales, eritrocitos, etc11. El doble factor de transcripción relacionado con el sexo/mab-3(dmrt1),utilizado como gen representativo en este método, es un regulador transcripcional altamente conservado de la determinación y diferenciación del sexo en la mayoría de las especies que van desde invertebrados hasta mamíferos12,,13. En una gama de especies (es decir, porgy negro, etc.) 14, dmrt1 se expresó en las células sertoli, rodeando las células germinales, cuya función es similar a las células trofoblastos de Sipunculus nudus. Por lo tanto, hipotetizaron que dmrt1 de Sipunculus nudus se expresa en células trofoblastos de espermatozoides, y el resultado del método ISH confirmó claramente la hipótesis.
Este protocolo describe por primera vez la ISH, con sondas de ARNm antisentido/sentido con etiqueta digoxigenina, para determinar los patrones de expresión de ARNm en su frotis de fluido coelómico. Se proporcionan las condiciones óptimas de reacción, que permiten una visualización muy sensible de la expresión de ARNm a alta resolución. El método ISM desarrollado podría aplicarse potencialmente en más especies de Sipunculida distintas de Sipunculus nudus.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoxigenina-AP Fragmentos Fab Roche</td><td></td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT Kit de desarrollo de color de fosfatasa alcalina</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>cítricoSinopharm Reactivo Químico Co.</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico trisódico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>4/3/6132</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Beyotime</td><td>FCGF60</td><td></td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>Amresco</td><td>07/12/1975</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo, DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Sustancia nociva</td></tr><tr><td>Digoxigenina (DIG) Mezcla de etiquetado de ARN</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I, Invitrogen libre de ARNasa</td><td></td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma 431788</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imágenes de gel de electroforesis</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood III</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kits de extracción de gel</td><td>Omega</td><td>D2500</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis</td><td>de gel Beijing Liuyi Instrument Factory</td><td>DYY-6C</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G5417</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>8/1/9041</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co.</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>203637</td><td></td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>110-16-7</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co.</td><td>67-56-1</td><td>Sustancia nociva</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Biofount</td><td>JT0001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co.</td><td>1310-73-2</td><td>Película de parafina corrosiva</td></tr><tr><td></td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído, PFA</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Sustancia nociva</td></tr><tr><td>PCR Instrument Life</td><td>Technology</td><td>Proflex</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>Deli</td><td>16</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>plus G</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio tratados con poli-D-lisina</td><td>Liusheng</td><td>VER_A01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>SRE0005</tr><tr><td>Agua sin RNasa</td><td>HyClone</td><td>SH30538. 02</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de RNasa</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>S. nudus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero de oveja</td><td>Beyotime</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>Tarro de tinción de portaobjetos</td><td>Beyotime</td><td>FG010</td><td></td></tr><tr><td>Caja de almacenamiento de portaobjetos</td><td>Beyotime</td><td>FBX011</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras pequeñas esterilizadas en autoclave</td><td>Espectrofotómetros Shuanglu</td><td>sku_8330</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARN polimerasas</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Taq Mezcla de ADN polimerasa (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10109517001</tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Zhengzhou Gran Muralla Científica Industrial</td><td>HH-S2</td><td></td></tr></tbody></table>

hibridación in situ para sipunculus nudus coelomic fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

La hibridación in situ (ISH) es una técnica muy informativa para presentar patrones de distribución celular de genes específicos (por ejemplo, ARNm y NCRNA) en los tejidos. El gusano sipunculid Sipunculus nudus es un recurso pesquero crucial, ya que tiene altos valores nutricionales y medicinales. Actualmente, la investigación sobre la biología molecular de Sipunculus nudus todavía está en su infancia. El propósito de este artículo es desarrollar un método sensible para localizar un ARNm específico en sipunculus nudus líquido celómico. El protocolo incluye pasos detallados de la ISH, incluyendo la preparación de ribosondas con nombre digoxigenina y de sentido, la recolección de fluidos celómicos y la preparación de secciones, la hibridación ribosondas específicas, la incubación de anticuerpos, la coloración y los tratamientos posteriores a la coloración. Se muestran los resultados representativos obtenidos de un experimento exitoso con este método. El protocolo también debe ser aplicable a otras especies de Sipuncula.

En la Figura 1se ilustra un resumen de los pasos implicados en la ISH. Las ribosondas de sentido antisentido y correspondientes para dmrt1 se sintetizaron a partir de productos PCR amplificados a partir de los cDNA de fluido celómico. La autenticidad de los productos de ITP se verificó mediante la secuenciación directa. Las ribosondas se sintetizaron utilizando polimerasas de ARN T7 de acuerdo con los protocolos del fabricante y un informe anterior4 con algun...

Este protocolo describe un enfoque eficaz de hibridación in situ para detectar los niveles de expresión de ARNm y los patrones espaciales de los genes diana en el líquido celómico Sipunculus nudus.

Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

La hibridación in situ es una técnica muy informativa para presentar patrones de expresión de ARNm e IncRNA de genes específicos en tejidos. Nuestro propósito en este artículo es desarrollar un método sensible para detectar la localización específica del ARNm en el líquido coelomico de Sipunculus nudus, que es un recurso pesquero crucial. Hemos presentado los resultados representativos obtenidos de nuestros experimentos exitosos mediante el uso de este método.Se espera que nuestro método se aplique a otras especies de Sipuncula para identificar los patrones de expresión del ARNm específico y el IncRNA en fluido coelomico. Fije el Nudus de Sipunculus en la tabla de disección. Abra el cuerpo del Nudus Sipunculus con pequeñas tijeras autoclaves.A continuación, recoger y transferir el líquido coelomic con pipeta a diapositivas de microscopio tratadas con poli-D-lisina, se extienden ligeramente. Seque al aire los portaobjetos durante una hora a 37 grados Centígrados. Lave los portaobjetos con DEPC-PBS tres veces, cinco minutos por lavado con agitación suave.Escurrir el PBS, añadir la solución de proteinasa K en los portaobjetos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Escurra la solución de proteinasa K. Agregue la solución PFA en los portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente.Escurra la solución PFA. Lave los portaobjetos con DEPC-PBS tres veces, cinco minutos por lavado con agitación suave. Escurra el PBS.Añadir 50 microlitrolidor riboprobe. Agregue un cubreobjetos. Coloque las diapositivas en la caja húmeda y selle bien con película de parafina.Hibridar durante la noche a 60 grados Celsius. Sumerja las diapositivas en el tampón de lavado y déjela reposar hasta que el cubreobjetos se deslice automáticamente. Lave los portaobjetos con el tampón de lavado precalentado dos veces a 65 grados Celsius, 30 minutos por lavado con agitación suave.Lave los portaobjetos con la solución SSC precalentada dos veces a 65 grados Celsius, 30 minutos por lavado con agitación suave. Lave los portaobjetos con la solución MABT dos veces a temperatura ambiente. 30 minutos por lavado con agitación suave.Escurra el MABT. Agregue el búfer de bloqueo. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante tres a cuatro horas.Va drain el búfer de bloqueo. Añadir el anticuerpo, incubar los portaobjetos a cuatro grados Celsius durante la noche. Escurra la solución de anticuerpos.Lave los portaobjetos con la solución MABT durante cuatro veces, 25 minutos por lavado con agitación suave. Escurra el MABT. Agregue el tampón de fosfatasa alcalina tres veces, cinco minutos por incubación.Retire el búfer de fosfatasa alcalina. Agregue la solución de tinción BCIP-NBT. Mantenga las diapositivas en la oscuridad.El tiempo de tinción varía de minutos a horas, incluso durante la noche, lo que depende de la intensidad de la señal. El estado de tinción debe comprobarse con más frecuencia al principio de la tinción. Por ejemplo, con un intervalo de varios minutos, y varias horas a más tardar de la tinción.El tiempo de comprobación debe ser tan corto como puede ser para evitar la introducción de una alta señalización de fondo debido a la exposición a la luz. Se muestran las señales representativas de la hibridación in situ. La hibridación in situ del líquido coelomico Sipunculus nudus con riboprobe antien sentido que se dirige a dmrt1 indica tinción púrpura concentrada en células trofoblastas del espermatozoide, figura 2A y B.Sense riboprobe para dmrt1 no detectó ninguna señal de hibridación, figura 2C.Después de ver este video, usted tendría una muy buena comprensión de cómo visualizar los patrones de expresión del ARNm objetivo o IncRNA en el líquido coelomico de Sipunculus nudus.

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Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid

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