Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans
30 de abril de 2020
Los productos traslacionales no dependientes del ATG asociados a la repetición son características patógenas emergentes de varias enfermedades basadas en la expansión repetida. El objetivo del protocolo descrito es evaluar la toxicidad causada por estos péptidos utilizando ensayos conductuales y celulares en el sistema modelo C. elegans.
Los péptidos RAN son una característica de los trastornos neurodegenerativos de expansión repetida como la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la demencia frontotemporal. Estos protocolos proporcionan un enfoque estandarizado importante para cuantificar la toxicidad del péptido RAN en el sistema modelo C.elegans. Las técnicas descritas son fáciles de aprender y económicas, se pueden realizar rápidamente y aprovechan las características reproducibles del sistema C.elegans, como el movimiento y la reproducción.
Al intentar este protocolo, el principal desafío es obtener toxicidad y expresión constantes de péptidos RAN. Los principales factores a controlar incluyen la temperatura de las drogas, el momento de los cambios de temperatura y la preparación de las placas de ensayo. Es importante que los experimentadores clasiquen constantemente los fenotipos de los animales en este ensayo de proceso dependiente de la edad.
La demostración visual de esta técnica muestra sus criterios de clasificación. Comience por verter el medio de crecimiento de nematodos estándar con un IPTG milimotor y 25 microgramos por mililitro de carbenicillina en placas de 24 pozos. Estratete los clones de alimentación de ARNi en bacterias HT115 en el agar lb carbenicillina y creció a 37 grados centígrados durante 24 horas.
Al día siguiente, escoge una sola colonia en un mililitro de medios líquidos de carbenicillina LB y haz crecer las bacterias durante 18 horas a 37 grados centígrados mientras tiemblas a 250 rpm. Detecte cuatro pozos individuales de la placa NGM RNAi de 24 pozos con 20 microlitros de cultivos bacterianos durante la noche como se describe en el manuscrito de texto y permita que las bacterias RNAi induzcan la producción de ARN de doble cadena durante la noche. Utilice el método estándar de hipoclorito para aislar los óvulos del primer día C.elegans adultos que expresan el transgén péptido RAN integrado.
Luego sembra unos 30 huevos en cada pozo de la placa de 24 pozos e incubar el plato a 20 grados Celsius durante siete días. Para realizar análisis de velocidad de vídeo, adquiera dos vídeos de dos pozos separados para cada condición de ARNi utilizando un microscopio de disección estéreo equipado con una cámara monocroma. Asegúrese de utilizar la configuración de adquisición coherente entre pozos.
Para cada vídeo, establezca la duración de 10 segundos y el intervalo de tiempo en 76 milisegundos. Establezca el tiempo de exposición de la imagen en cuatro milisegundos y utilice el ajuste de zoom 1.49. A continuación, seleccione dos por dos binning.
Compruebe que la resolución es de 800 por 600 píxeles e inicie la grabación. Después de la adquisición, etiqueta cada video inmediatamente con la cepa, la condición de ARNi y el número de pozo. A continuación, medir la distancia recorrida y la longitud de cada animal para 20 animales diferentes por vídeo, examinando un total de unos 40 gusanos para cada condición de ARNi.
En el software, seleccione el botón de herramientas de anotación. A continuación, la herramienta de dibujo de texto. Haga clic en un punto en el centro del gusano que se mide en el primer fotograma del vídeo y márquelo con un número.
Avance el vídeo hasta el final mientras rastrea visualmente el gusano. A continuación, haga clic en él y márquelo con el siguiente número correspondiente. Utilice la herramienta de barra de escala de dibujo para dibujar una línea desde el primer número hasta el segundo número y registrar la distancia recorrida en una hoja de cálculo.
Repita esta medición para otros 19 gusanos en el vídeo conservando cada medida individual en la ventana de análisis. Una vez completadas las mediciones, tome una instantánea del marco de vídeo final que ilustra todas las líneas de medición para que los datos puedan rastrearse hasta el animal del que se originaron. A continuación, analice los datos utilizando una hoja de cálculo de cuatro columnas donde la columna uno es el identificador de gusano y la columna dos es la velocidad.
La hora de cada vídeo se puede encontrar haciendo clic con el botón derecho en el vídeo bajo el experimento yendo a las propiedades. Para normalizar la medición de velocidad, encuentre la longitud de cada animal. Utilice la herramienta de polilínea de dibujo para trazar libremente los C.elegans desde la punta de la cabeza hasta la punta de la cola.
A continuación, tome una instantánea del fotograma de vídeo final que ilustra todas las polilíneas. La longitud de las líneas se registrará en las estadísticas. Agregue dos columnas a la hoja de cálculo, una para la longitud del animal y otra para la velocidad normalizada.
Por último, analice los datos de velocidad normalizados utilizando un ANOVA unidireccional con pruebas post-hoc frente a RNI vectoriales vacíos. Coloque de cuatro a seis L4 C.elegans transgénicos que expresen la GFP de péptido RAN en una placa GFP RNAi de seis centímetros y los escríen a 20 grados centígrados. Si el experimento utiliza ARNi para detectar efectos genéticos sobre la toxicidad del péptido RAN, mueva 10 adultos gravídicos transgénicos a cada uno de dos vectores vacíos RNAi RNAi o placas RNAi específicas del gen.
Si se utilizan mutantes para analizar los efectos genéticos sobre la toxicidad del péptido RAN, coloque 10 animales salvajes gravidos o animales mutantes que expresen el mismo transgén RAN en cada una de las dos placas vectoriales vacías RNAi o RNAi GFP. Cultivarlos a 20 grados centígrados durante 48 horas. Escoja 10 juegos de 10 L4 transgénicos de las placas RNAi y coloque cada juego en una placa de ARNi de tres centímetros.
Asegúrese de que todos los gusanos seleccionados para el ensayo tengan motilidad superficialmente normal. Coloque las placas en una bolsa de plástico para retener la humedad e incubarlas a 25 grados centígrados. Después de 24 horas, analice los animales para la movilidad tocando las placas en el microscopio de disección y comprobando si hay movimiento.
Si un gusano se mueve más de una longitud corporal, cuéntalo como móvil y transfiéralo a una nueva placa RNAi de tres centímetros. Utilice una selección de platino para tocar los gusanos restantes en la cabeza y la cola. Si el animal se mueve más de una longitud corporal, cuente el animal como móvil y transfiéralo a una nueva placa de ARNi de tres centímetros.
Si no se observa una parálisis significativa en el control vectorial vacío para el día dos, termine el ensayo y comience de nuevo. Agrupe todos los gusanos no de movimiento para que el movimiento de más de una longitud corporal pueda detectarse fácilmente. Cuente todos los gusanos paralizantes, embolsados o muertos y deseche la placa.
Continúe anotando a los animales para la parálisis todos los días durante cinco a siete días. El ensayo de crecimiento se utilizó para medir el efecto de las inhibiciones genéticas en la toxicidad de los dipéptidos RAN que se encuentran en pacientes con ELA con una expansión de repetición de G4C2. La expresión de PR50 GFP por sí sola resultó en un arresto de crecimiento completo, pero la eliminación de varios genes suprimió la toxicidad del desarrollo.
El efecto de los derribos genéticos específicos en la motilidad del desarrollo de los animales que expresan PR50 se midió utilizando el método de análisis de la velocidad del vídeo. Como era de esperar, la inhibición de la expresión de PR50 GFP dio lugar a un gran aumento de la motilidad en comparación con el vector vacío RNAi. Además, el ARNi contra la subunidad proteasoma RPN7 dio lugar al aumento significativo de la motilidad PR50.
Cuando se analizaron los fenotipos adultos con el ensayo de parálisis dependiente de la edad, pr50 GFP exhibió hasta un 80% de parálisis a los cinco días de edad. Sin embargo, el ARNi se dirigió al gen cul-6 de la parálisis significativamente retrasada, lo que sugiere que se requiere cul-6 para la toxicidad de la PFN PR50. Para determinar si las proteínas RAN causan neuropatología cuando se expresan en las neuronas C.elegans, se examinó la toxicidad específica de la neurona utilizando el ensayo de commissure.
En el día dos adultos, PR50 GFP expresión en las neuronas motoras condujo a un aumento significativo en el sangrado de la neurona motora. Esta neuropatología fue suprimida significativamente por una mutación en el gen receptor de insulina IGF homólogo DAF-2 que retrasa las propiedades tóxicas de varias proteínas neurodegenerativas. Para el ensayo conductual, es importante que los péptidos RAN produzcan un fenotipo altamente penetrante.
Estos genes o fármacos podrían proporcionar nuevos biomarcadores u opciones terapéuticas para las enfermedades de los péptidos RAN. Utilizando estos ensayos, hemos realizado una pantalla de ARNI en todo el genoma para los supresores del péptido RAN asociado C9ORF72 prolina-arginina. Los genes identificados en esta pantalla incluyen muchos genes nuevos y conservados que serán objeto de futuros estudios mecánicos.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Visión general
Este estudio investiga la toxicidad de los péptidos no dependientes de ATG asociados a repeticiones (RAN), que están relacionados con trastornos neurodegenerativos, utilizando el organismo modelo C. elegans. La investigación describe un protocolo para cuantificar la toxicidad de los péptidos RAN a través de ensayos conductuales y celulares.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Trastornos neurodegenerativos
- Toxicidad de péptidos RAN
- Uso de C. elegans como sistema modelo
Fundamentos
- Los péptidos RAN están implicados en enfermedades como la enfermedad de Huntington, la ELA y la demencia frontotemporal.
- El estudio tiene como objetivo estandarizar los enfoques para cuantificar la toxicidad de los péptidos.
- Comprender los mecanismos de toxicidad es crucial para posibles estrategias terapéuticas.
Métodos utilizados
- Ensayos conductuales para medir la movilidad y reproducción en C. elegans
- Ensayos celulares para evaluar la expresión y toxicidad de los péptidos RAN
- Análisis de velocidad de video para medir el movimiento de los gusanos
Resultados principales
- Caracterizaron los fenotipos de C. elegans en respuesta a los péptidos RAN
- Identificaron variables clave que afectan la toxicidad de los péptidos RAN
- Validaron métodos de ensayo para asegurar la consistencia en las observaciones
Conclusiones
- El estudio presenta metodologías robustas para investigar la toxicidad de los péptidos RAN.
- Los hallazgos contribuyen a una comprensión más profunda de las enfermedades neurodegenerativas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans provides a scalable, cost-effective platform for early-stage target validation in repeat expansion neurodegenerative diseases. The assay suite enables mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological interventions to quantifiable phenotypic outputs such as motility, growth, and neuronal morphology. This supports predictive confidence in lead identification and portfolio triage for ALS, Huntington’s disease, and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking gene knockdowns to suppression of RAN peptide-induced developmental toxicity and motility defects.
- Operational Value: Uses standardized RNAi feeding in C. elegans to systematically assess genetic modifiers of peptide toxicity across the genome.
- Predictive Value: Identifies suppressors of RAN peptide toxicity (e.g., cul-6, DAF-2) that inform target prioritization and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, normalized speed and length metrics from video analysis to enable reproducible, high-content assessment of compound or genetic effects on RAN peptide toxicity.
- Operational Value: Leverages the reproducibility of C. elegans locomotion and reproduction for low-cost, rapid screening in 24-well plate formats compatible with automation.
- Assay Readiness: Establishes Z-score–compatible readouts (e.g., normalized speed) suitable for large-scale genetic or small molecule screens to identify disease-modifying targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses neuron-specific commissure assay to model RAN peptide-induced neuropathology (e.g., motor neuron blebbing) in a disease-relevant system.
- Mechanistic De-risking: Links toxicity modulation to conserved pathways (e.g., insulin/IGF signaling via DAF-2) with known relevance to human neurodegenerative disease mechanisms.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating targets across developmental, age-dependent, and cellular toxicity assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing phenotypic validation of targets identified from human genetics or CRISPR screens in repeat expansion disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how genetic perturbations affect RAN peptide toxicity in a multicellular organism.
- Screening: Enables assay standardization and quantitative outputs via video-based motility analysis, facilitating reproducible compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Generates normalized speed and length data suitable for statistical comparison (e.g., one-way ANOVA with post-hoc testing) to evaluate hit significance.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through neuron morphology assays that model subcellular neuropathology relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target validation across multiple RAN peptide diseases (e.g., ALS, Huntington’s) using the same transgenic readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing toxic RAN peptide species and linking them to specific genetic or environmental modifiers.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined RNAi induction, temperature control, and blinded phenotypic scoring protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, in vivo evidence of target modulation on peptide toxicity, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concordance across developmental, age-dependent, and neurotoxicity assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi feeding, and transgenic strain maintenance.
- Dependent on standardized instrumentation for video acquisition (stereo dissecting microscope, monochrome camera) and analysis software for motion tracking.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions (e.g., temperature shifts, plate preparation, worm staging) to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending assays to different RAN peptide sequences or neuronal subtypes beyond motor neurons.
- Limited by the need for consistent RAN peptide expression and toxicity, which depends on precise control of induction timing and bacterial RNAi quality.
