Ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) para la detección específica y rápida del virus del lago Tilapia
18 de mayo de 2020
Presentamos un ensayo RT-LAMP para la detección de TiLV en peces de tilapia utilizando instrumentos simples durante un período de tiempo relativamente corto en comparación con las técnicas convencionales rt-PCR. Este protocolo puede ayudar a controlar la propagación epidémica de TiLVD, especialmente en los países en desarrollo.
El virus del lago Tilapia es un virus emergente y patógenos contagiosos, que causan una alta mortalidad en la tilapia y sus especies híbridas. Como la tilapia es una fuente de proteínas principal para muchos países en desarrollo, la nueva infección por virus tiene un gran impacto en la acuicultura de tilapia, y también amenaza la seguridad alimentaria mundial. El desarrollo de un método rápido, preciso y sensible para detectar el virus en el tejido de los peces, ayudará a la enfermedad a controlar y reducirá el impacto del virus.
En este video, mostraremos la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa, o ensayo RT-LAMP, para la detección rápida del virus del lago tilapia en muestras de peces. Segunda parte, extracción de ARN. En primer lugar, añadir 3250 miligramos de tejido hepático en un tubo estéril de 1,5 mililitros de microcentrífuga, que contiene 600 a 1000 microlitros ácido guanidinio-fenol base reactivo, y picar hasta que sea homogéneo.
Centrifugar a 10.000 RCF durante 30 segundos, y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue un volumen igual de 95% de etanol al tubo y mezcle bien. Transfiera la solución a una columna de centrifugado, colocada en un tubo de recogida, luego centrifugar a 10.000 RCF durante 30 segundos.
Deseche el flujo y transfiera la columna a un nuevo tubo de recogida. Agregue 400 microlitros de RNA PreWash a la columna y centrifugar a 10.000 RCF durante 30 segundos. Deseche el flujo a través y repita este paso.
Agregue 700 microlitr RNA Wash Buffer en la columna y centrifugar a 10.000 RCF durante dos minutos. Después, transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Por último, eluda el ARN en la matriz de columnas con un 100 microlitro, agua sin nucleasas y centrífuga a 10.000 RCF durante 30 segundos.
Tercera parte, diseño de imprimación. La PrimeraExplorer Versión 4 es la herramienta bioinformática más común para diseñar imprimaciones LAMP, o RT-LAMP eficientes, en las que se encuentran en su página web buenos manuales para el software. En este caso, cuatro imprimaciones específicas, compuestas por dos imprimaciones internas y dos externas, fueron diseñadas para reconocer seis regiones distintas en el segmento 3 de TiLV, originarias de Tailandia.
Después de entrar en el sitio web, donde se muestra el enlace en el vídeo, haga clic en PrimerExplorer V4. Elija el archivo que contiene la secuencia del segmento 3 de TiLV, en formato FASTA, recuperado del número al que se accede a GenBank, KX631923, o tilapia lake virus TV1 segmento 3, y luego haga clic primer Design botón. Una vez que haga clic en el botón Generar, el software se procesará, y los resultados se mostrarán. Después de optimizar las secuencias para la amplificación LAMP, en total, se seleccionó un par de imprimaciones externas, y dos pares de imprimaciones internas, para este estudio, para detectar la infección TiLV.
Este conjunto de imprimaciones se muestra aquí. Cuarta parte, demostración de RT-LAMP. La mezcla maestra para RT-LAMP específica para el virus del lago tilapia, consta de los siguientes productos químicos.
Prepare una mezcla maestra utilizando los productos químicos que se muestran en la tabla. Dispensar 22 microlitros de mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. A continuación, agregue tres microlitros de plantilla de ARN en el tubo de reacción.
Para el control negativo, utilice agua destilada en lugar de materiales de ARN, y mezcle bien. Incubar las reacciones a 65 grados centígrados durante 60 minutos, seguido de 80 grados Celsius durante 10 minutos. Después de la incubación durante 30 minutos, los cambios calorimétricos son observados visualmente por los ojos desnudos.
Cuando proceda, podemos confirmar los resultados del ensayo RT-LAMP, realizando electroforesis de gel en gel de 1,5% de agarosa, con una constante de 100 voltios, durante 40 minutos, mediante la cual se carga una escalera de ADN de tamaño molecular de un par de kilobases como marcador para determinar el tamaño del fragmento. Parte cinco, resultados representativos e interpretación. Después de la incubación durante 30 minutos, la reacción de fluorescencia de grano que sugiere la amplificación positiva de TiLV en los tejidos de peces, obviamente se observaron en muestras infectadas bajo luz UV a una longitud de onda de 365 nanómetros, mientras que las de control negativo tenían una solución clara y ligeramente incolora.
En consecuencia, se confirmó la amplificación de los productos RT-LAMP en la electroforesis de gel de agarosa, mostrando varios tamaños de las múltiples amplificaciones de repeticiones de ADN invertidas, formando estructuras de bucle de tallo bajo lámpara UV en muestras infectadas por TiLV, mientras que no se mostraron bandas en los pozos del control negativo, donde los resultados se ajustaron a los del ensayo RT-LAMP. Por lo tanto, para reducir la propagación del virus del lago tilapia, un cribado inmediato de estos peces infectados, utilizando un método de diagnóstico eficaz, es una de las claves importantes. Por lo tanto, el nuevo ensayo RT-LAMP debería ofrecer una herramienta de diagnóstico rápida y sensible que se aplicará en el proceso de medida de bioseguridad.
El ensayo podría utilizarse en el laboratorio o en las instalaciones in situ. Esperamos que el método se aplique para examinar la población de peces infectados que podría conducir a la reducción de la propagación del virus del lago tilapia.
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Descripción general
Este artículo presenta un ensayo RT-LAMP rápido para detectar el virus del lago de la tilapia (TiLV) en peces tilapia, ofreciendo una alternativa más rápida a los métodos convencionales de RT-PCR. El protocolo tiene como objetivo ayudar a controlar la propagación del TiLV, particularmente en países en desarrollo donde la tilapia es una fuente vital de proteína.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Acuicultura
- Detección de patógenos
Antecedentes
- El virus del lago de la tilapia es un patógeno contagioso que causa una alta mortalidad en la tilapia.
- El virus representa una amenaza significativa para la acuicultura de tilapia y la seguridad alimentaria mundial.
- Los métodos actuales de detección suelen ser lentos y complejos.
- Un método de detección rápida es esencial para un control eficaz de la enfermedad.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rápido y sensible para detectar TiLV en tejido de peces.
- Reducir el impacto de TiLV en la acuicultura de tilapia.
- Proporcionar una solución práctica para el manejo de enfermedades en países en desarrollo.
Métodos Utilizados
- Ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP).
- Extracción de ARN de tejido hepático de tilapia.
- Uso de instrumentos sencillos para pruebas rápidas.
- Comparación con técnicas convencionales de RT-PCR.
Resultados principales
- El ensayo RT-LAMP proporciona una detección rápida y precisa del TiLV.
- Este método es más sencillo y rápido que la RT-PCR tradicional.
- Puede implementarse en entornos con recursos limitados.
- El protocolo podría ayudar a mitigar la propagación del TiLV en poblaciones de tilapia.
Conclusiones
- El ensayo RT-LAMP es una herramienta prometedora para la detección del TiLV.
- Apoya los esfuerzos de control de enfermedades en acuicultura.
- Estudios futuros podrían mejorar su aplicación en diversos entornos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección rápida y específica de patógenos virales emergentes como el virus del lago de la tilapia (TiLV) es fundamental para proteger la producción acuícola y la seguridad alimentaria global. El ensayo RT-LAMP permite la identificación oportuna de la infección por TiLV en tejido de peces, favoreciendo intervenciones tempranas y medidas de bioseguridad. Este enfoque reduce la dependencia de métodos moleculares intensivos en mano de obra y facilita el cribado a gran escala en entornos con recursos limitados.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la detección específica del ARN del TiLV, lo que apoya la confirmación del objetivo viral en tejidos del huésped infectados.
- Valor operativo: Proporciona un método rápido de amplificación isotérmica que no requiere equipos de ciclado térmico.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados visuales o fluorométricos en menos de 60 minutos, lo que permite una evaluación rápida de la presencia viral.
- Valor operativo: Requiere un instrumental mínimo y puede implementarse en entornos de campo o de laboratorio para cribado de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra aplicabilidad a tipos de muestras no letales, como el moco, lo que permite el monitoreo longitudinal de la carga viral.
- Valor operativo: Facilita estudios longitudinales en modelos animales sin sacrificar sujetos, mejorando el diseño experimental y reduciendo la variabilidad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo RT-LAMP se integra en el continuo del descubrimiento al proporcionar una herramienta de detección implementable tras la generación de hipótesis y antes de los estudios de intervención terapéutica o profiláctica.
- Biología del descubrimiento: Facilita la validación de la presencia viral en muestras biológicas, apoyando estudios mecanicistas sobre la patogénesis del TiLV.
- Detección: Permite la evaluación rápida del estado de infección en cohortes de muestras, mejorando la preparación del ensayo para la evaluación de compuestos antivirales.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos o semicuantitativos mediante turbidez visual, fluorescencia o electroforesis en gel, facilitando el análisis comparativo.
- Investigación traslacional: Asegura la continuidad desde la detección inicial hasta la evaluación preclínica de estrategias de intervención en modelos relevantes de enfermedad.
- Reutilización empresarial: Representa una plataforma modular de detección de ácidos nucleicos adaptable a otros patógenos emergentes en sistemas acuícolas o ganaderos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del blanco mediante la detección específica y sensible de ARN viral.
- Valor operativo: Ofrece compatibilidad con diagnóstico en el punto de atención sin necesidad de equipos, con resultados legibles a simple vista o mediante un transiluminador sencillo.
- Valor estratégico: Reduce el tiempo hasta el resultado en el cribado de infecciones, permitiendo decisiones más rápidas de avance o interrupción en la progresión del estudio.
- Impacto en el portafolio: Mejora la evaluación de riesgos en programas preclínicos al proporcionar datos fiables sobre el estado de infección, reduciendo variables de confusión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular y diseño de cebadores para ensayos basados en LAMP.
- Necesita acceso a kits de extracción de ARN, baño de agua o bloque térmico y herramientas de visualización (por ejemplo, luz UV o electroforesis en gel).
- Exige la estandarización de los protocolos de preparación de muestras entre diferentes tipos de tejidos (por ejemplo, hígado, moco) para obtener resultados reproducibles.
- Implica la validación de la especificidad del ensayo frente a patógenos relacionados para evitar falsos positivos.
- Está limitado por la necesidad de conjuntos de cebadores optimizados y la posible inhibición por matrices biológicas complejas.
