Métodos estandarizados para medir la inducción de la respuesta de choque térmico en Caenorhabditis elegans

Aquí, se presentan protocolos estandarizados para evaluar la inducción de la respuesta de choque térmico (HSR) en Caenorhabditis elegans usando RT-qPCR a nivel molecular, reporteros fluorescentes a nivel celular y termorecovery a nivel de organismo.

La respuesta de choque térmico es una vía esencial de respuesta al estrés celular que mantiene la proteostasis citoplasmático y se puede caracterizar a los niveles moleculares, celulares y del organismo en elegans marinos. Presentamos una serie de protocolos estandarizados y mejores prácticas que generan una sólida inducción de la respuesta de choque térmico en elegans marinos con el fin de ayudar a mejorar la reproducibilidad en el campo de la respuesta de choque térmico. Mostramos que la tolerancia térmica, un ensayo organismal de uso común, no depende de la respuesta de choque térmico.

En su lugar, recomendamos usar la recuperación térmica, un ensayo de microorganismo que depende de la respuesta a los golpes de calor. La respuesta de choque térmico se atenúa con la aparición de huevos. Por lo tanto, el tiempo de desarrollo es una variable crítica que debe tenerse en cuenta en los experimentos de respuesta a choques térmicos.

Comience creando una población de gusanos sincronizada. Utilice una selección de alambre de platino para transferir aproximadamente 10 gusanos adultos gravid a un plato nuevo. Asegúrese de eliminar los huevos o larvas que puedan haber sido transferidos con los adultos.

Deje que los gusanos pongan huevos durante una hora, luego retire a los adultos del plato. Mantener los gusanos sincronizados a 20 grados celsius hasta la etapa de desarrollo deseada, teniendo en cuenta que la sincronización del desarrollo varía con cada cepa y la temperatura a la que se elevan los gusanos. Cuando los gusanos estén listos para el choque térmico, envuelva las placas con película de parafina y utilice un portatubos de ensayo con un peso de plomo para sumergirlos en un baño de agua circulante a 33 grados centígrados durante una hora.

Recuperar las placas del baño de agua y secarlas con una toalla de papel. Retire la película de parafina y permita que los gusanos se recuperen a 20 grados centígrados durante seis a 24 horas, lo que será un tiempo suficiente para la síntesis de GFP. Para preparar diapositivas para la toma de imágenes, coloque una diapositiva de microscopio entre otras dos diapositivas que tengan una tira de cinta de laboratorio en ellas.

Hacer una solución de 3% de agarosa en agua y calentarla en el microondas hasta que las agarosas se disuelvan. A continuación, utilice una pipeta de un mililitro para colocar unos 150 microlitros de la agarosa en el centro de la diapositiva. Cubra inmediatamente la diapositiva con una diapositiva en blanco, colocándola perpendicularmente para que quede sobre la cinta de laboratorio y, a continuación, retírela cuidadosamente.

Para inmovilizar los gusanos, agregue una pequeña gota de un levalojo mil millilolar, un tampón M9, al centro de la almohadilla de agarosa y transfiera 10 gusanos a la gota usando una selección de alambre de platino. Opcionalmente, esparza el levamisol en el exterior de la almohadilla de agarosa y alinea los gusanos con la selección cuando se paralicen. Cubra los gusanos con un resbalón de cubierta e ijeándolos lo antes posible usando un microscopio de fluorescencia.

Para realizar un ensayo de termorecovery, sincronice los gusanos y mantenlos en 20 grados Celsius hasta la etapa de desarrollo deseada. Luego los impacta durante seis horas. Retire las placas del baño de agua y deje que se recuperen a 20 grados centígrados durante 48 horas.

Después de la recuperación, cuente el número de gusanos que pueden desencandarse inmediatamente después de la estimulación mecánica sin movimiento brusco o parálisis. Para visualizar la inducción de la respuesta a los golpes de calor a nivel celular, se analizaron dos cepas fluorescentes de elegans marinos. En las muestras de control negativo sin choque de calor, el reportero hsp-16.2 mostró fluorescencia automática normal, pero el reportero hsp-70 tenía fluorescencia constitutiva en el músculo del depresor anal.

Después de una hora de choque de calor, se observó una fluorescencia robusta en ambos reporteros cuando se utilizó el ARNi para derribar hsf-1 antes de medir la inducción del reportero. La fluorescencia de ambas cepas se redujo severamente, lo que indica que estos reporteros dependen de hsf-1. Para cuantificar la inducción de la respuesta de choque térmico a nivel molecular, se midieron dos proteínas de choque térmico autóctonas con PCR clave rt.

Se encontró que un choque de calor de una hora y 33 grados Celsius da como resultado un aumento de más de 2.000 veces en la expresión relativa de los dos genes de choque térmico. Un ensayo de termorecoveryo demostró que la exposición a un choque de calor de seis horas condujo a una disminución del 20% en los gusanos con movimiento normal después de una recuperación de 48 horas. El derribo de hsf-1 causó una disminución dramática en el movimiento normal, con más del 95% de los gusanos mostrando movimiento brusco o parálisis después de ser empujados.

Por el contrario, el derribo de hsf-1 no tuvo un efecto significativo en los resultados de un ensayo de tolerancia termoeléctrica, en el que los gusanos están expuestos a una temperatura continua de 35 grados Celsius y el porcentaje de gusanos vivos se mide en varios puntos de tiempo. Al realizar esta técnica por primera vez, asegúrese de envolver las placas con película de parafina dos veces para evitar que el agua entre en las placas y arruine el experimento. Los ensayos moleculares pueden extenderse a análisis genómicos utilizando ARN-seq.

Se pueden incluir otros ensayos de organismos afectados por la respuesta a los golpes de calor, como la vida útil. La capacidad única de correlacionar ensayos de respuesta a choques térmicos moleculares, celulares y del organismo en elegans marinos ha demostrado ser invaluable para la comprensión del papel de esta vía en el desarrollo y la enfermedad.