Name: Medición de la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a medir la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico. Este método permite el cribado de medicamentos con alto rendimiento en muestras derivadas de pacientes.

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Este trabajo fue apoyado por la NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] y Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Nos gustaría agradecer a la Dra. Alana Welm (Universidad de Utah) por proporcionar el tumor PDX de cáncer de mama. También nos gustaría agradecer al personal de Medicina Comparada, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) por el mantenimiento del modelo PDX y a los miembros del laboratorio Gujral por sus útiles discusiones. N.N.A cuenta con el apoyo de la Beca de Investigación en el Extranjero JSPS y la Beca de Capacitación Interdisciplinaria de FHCRC. A.J.B. es apoyado por la Beca de Metabolismo De cromosomas y Entrenamiento del Cáncer de FHCRC.

Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Ley de Bienestar Animal y las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales en la investigación biomédica.
1. Preparación de rodajas de tejido tumoral
<ol><li>Preparar el medio de cultivo de rebanadas de tejido (TSC) siguiendo la receta de la Tabla 1. Filtrar el medio con una unidad de filtro de vacío de 0,45 m para esterilizar.</li>
	<li>Aliquot 250 l de medio TSC por pocto para una placa de 24 pocillos, o 1 ml de medio por pocto para una placa de 6 pocillos. Mantener la placa en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO2 hasta su uso. NOTA: El medio y los suplementos se pueden optimizar dependiendo de los tipos de tejido y los objetivos experimentales. La cantidad de medio debe ser suficiente para empapar la membrana porosa de un inserto de cultivo. No exceda el nivel de la membrana. Ajuste el volumen medio si el nivel medio es demasiado bajo o demasiado alto. Si los investigadores están probando agentes inmunomoduladores, recomendamos la suplementación del medio con IL-210.</li>
	<li>Si utiliza tejido tumoral derivado de ratones, eutanasia ratones con un procedimiento recomendado, desinfecte la piel expuesta de los ratones pulverizando 70% etanol y diseccionando tumores con técnicas asépticas. Almacene el tejido tumoral en un tubo que contenga la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) helada.</li>
	<li>Si utiliza tejidos tumorales de pacientes frescos, guárdelo en HBSS helado a corto plazo, o en la solución de la Universidad Belzer de Wisconsin (UW) para un almacenamiento a largo plazo (hasta 24 h) para preservar la viabilidad del tejido. NOTA: Los cortes de un tejido PDX enviados durante la noche en una solución UW helada se han preparado con éxito.</li>
	<li>Transfiera el tejido tumoral a una placa de cultivo de 10 cm que contenga HBSS helado. Corta el tumor en mitades con un bisturí mientras estás sumergido en HBSS helado. Forma los tejidos tumorales en cilindros usando un punzón de biopsia de 6 mm de diámetro y recorta un lado para crear una superficie plana. Almacene los tejidos en HBSS helado hasta su uso. NOTA: Evite incluir la zona necrótica del tejido, que generalmente está en el centro y tiene un aspecto opaco y frágil.</li>
	<li>Configure el vibratome. Desinfectar todo el equipo con 70% de etanol. Coloque la bandeja tampón de vibratome cubierta con una tapa de vidrio acrílico en el centro del baño de hielo vibratome. Agregue hielo al baño de hielo y llene la bandeja tampón con HBSS enfriado para mantener el tejido fresco mientras corta. Coloque una cuchilla de afeitar en el soporte de la cuchilla. NOTA: Aunque mantener los vibratomes en un entorno semiestéril no ha afectado a experimentos previos, se recomienda almacenar el vibratomo bajo un gabinete de bioseguridad si está disponible.</li>
	<li>Levante cuidadosamente un tejido tumoral perforado con biopsia del HBSS usando fórceps dentados y elimine el exceso de tampón examinando el tejido con una toalla de papel sin pelusas.</li>
	<li>Coloque una gota de pegamento de cianoacrilato de grado médico en la placa de la muestra y coloque el tejido en esta gota. Seque al aire el pegamento durante 2-3 minutos y coloque la placa en la bandeja tampón. Suplementar con un poco de HBSS hasta que el tejido esté completamente sumergido en el tampón. NOTA: El montaje de los tejidos en una posición vertical y estable es fundamental para generar rodajas cortadas uniformemente. Si los tejidos montados son inestables, agregue más pegamento al tejido circundante para conservar una posición vertical o descargue el tejido, aplane la parte inferior y vuelva a pegarlo. Los tejidos elásticos tienden a ser empujados y doblados más fácilmente durante el corte, en cuyo caso las longitudes más cortas (&lt;5 mm) y múltiples corridas pueden ser apropiadas. Para los tejidos extremadamente frágiles, las toallas de papel pueden destruir el tejido. En este caso, el tejido se puede colocar en una superficie de plástico para eliminar el exceso de HBSS.</li>
	<li>Ajuste los ajustes del vibratome. Se utilizan los siguientes ajustes: espesor de corte a 250 m, amplitud de 3,00 mm, velocidad de corte a 0,01–0,25 mm/s y ángulo de la hoja de 15o–21o. NOTA: Optimice los ajustes de corte en función de la rigidez del tejido. Los tejidos más blandos se cortan más fácilmente con un ángulo de hoja más profundo a menor velocidad. Un ángulo de la hoja de 18o, una velocidad de corte entre 0,10–0,18 mm/s y una amplitud de 3,00 mm funciona bien para los tumores de ratón 4T1 y PDX HCI010. El tejido más rígido se puede cortar con una velocidad de cuchilla más rápida.</li>
	<li>Establezca las ubicaciones inicial y final de la hoja y ajuste la altura del escenario. Ejecute el instrumento con modo continuo para cortar rodajas durante varios ciclos hasta que los tejidos se corten uniformemente.</li>
	<li>Continúe cortando el tejido. Transfiera las rebanadas junto con una pequeña cantidad de búfer de HBSS a la plaquita de cultivo celular con un medio con una pipeta de transferencia de punta ancha, utilizando la succión para levantar toda la rebanada. Coloque una rebanada por plaquita en un plato de 24 pocillos. Un inserto para 6 placas de pozo spuede acomodar hasta cuatro rodajas para un ensayo de réplica. NOTA: Si el último borde de la rebanada de tejido todavía está unido al tejido sin cortar, detenga el vibratome y separe la rebanada de tejido con dos pares de fórceps de punta fina sin tocar ni pinchar las rodajas de tejido. Una cuchilla de afeitar separada puede ser útil para eliminar el tejido colgante.</li>
	<li>Retire el exceso de tampón con una pipeta de transferencia de punta fina.</li>
	<li>Cuando la hoja se acerque a los tejidos pegados, detenga el instrumento, baje el escenario, retire el tejido rígido con una hoja separada y monte un tejido nuevo. Continúe cortando hasta que se hayan recogido suficientes rodajas.</li>
	<li>Cultivo de las placas en una incubadora humidificada a 37oC, 5% CO2. Las rodajas de tejido se cultivan en la interfase aire-líquido en el inserto de cultivo celular. Las rodajas de tejido están listas para experimentos de 24 a 48 h después de la preparación inicial de la rebanada. Para el cultivo a largo plazo, cambie el medio cada 2-3 días.</li>
</ol>2. Medición de viabilidad
<ol><li>Para la medición de viabilidad de la rebanada de tejido, cambie el medio con un reactivo de medición de viabilidad basado en luminiscencia que contenga luciferasa y prosustrato a 1:1,000 de dilución en el medio TSC siguiendo las instrucciones del fabricante. El reactivo mide la actividad de reducción de las células vivas de prosustrato metabolizado a luciferina11. Transfiera 50 ml de mezcla enzima-sustrato encima de cada rebanada de tejido.</li>
	<li>Incubar con agitación suave en un agitador orbital situado dentro de una incubadora humidificada a 37oC con 5% deCO2 durante la noche.</li>
	<li>Las señales luminosas se pueden medir utilizando un lector de microplacas o un instrumento de imagen in vivo para tejidos cultivados en una placa de 24 pocillos. Para medir la viabilidad individual de múltiples tejidos en una placa de 6 pocillos, se debe utilizar un sistema de imágenes in vivo.<ol>
<li>Cuando utilice un lector de microplacas, ajuste la microplaca sin la tapa. Cualquier tipo de lector de microplacas capaz de medir la intensidad luminiscente debe ser adecuado para el experimento. Usamos los siguientes ajustes: tiempo de lectura 1 s, medición desde la parte superior, ganancia a 200. NOTA: Para una mayor precisión, utilice una microplaca de pared blanca para configurar el experimento. Se han probado 24 placas de pozo de pared blanca y fondo transparente, y en la mayoría de los casos, las placas de pozo transparente no comprometen los resultados.</li>
		<li>Cuando utilice un sistema de imágenes in vivo para medir la viabilidad, coloque la placa en el centro del escenario y retire la tapa. Adquiera imágenes fotográficas normales seguidas de imágenes luminiscentes con un ajuste de campo de escenario en C, tiempo de exposición automática, f-stop 1, ajuste objetivo como microplaca con altura de sujeto a 0,0 cm.</li>
		<li>Cuantifique la intensidad luminiscente utilizando el software de imágenes acompañado con el sistema de imágenes in vivo. Dibuje regiones consistentes de interés (ROI) alrededor de cada rebanada de tejido. Este protocolo utiliza un círculo de 1 cm de diámetro como ROI (consulte la figura 1). Mida el flujo total (p/s) del área.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Evaluación del efecto farmacológico en las rodajas de tejido
<ol><li>Mida la viabilidad basal antes del tratamiento utilizando el reactivo de medición de viabilidad basado en luminiscencia, como se explica en la sección 2. NOTA: Si varios tejidos tienen una viabilidad significativamente menor en comparación con otros, omita los tejidos del ensayo.</li>
	<li>Disolver fármacos en dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer soluciones de stock. Preparar una solución de fármaco 10x con TSC u otro medio de cultivo (25 l/bien para una placa de 24 pocillos que contenga 250 ml de medio) a las concentraciones deseadas. Para el control del vehículo, prepare un medio que contenga un volumen equivalente de DMSO.</li>
	<li>Complemente la solución de fármaco10x al medio de cultivo en la parte inferior del pozo. Mezclar pipeteando y transferir 50 l del medio en la parte superior de los tejidos. NOTA: Si hay varias rebanadas de tejido disponibles, el examen duplica o triplica para cada afección.</li>
	<li>Incubar durante la noche con suave temblor en un agitador orbital en una incubadora humidificada de 37oC, 5% CO2.</li>
	<li>Retirar la placa de la coctelera e incubar estáticamente en la incubadora humidificada de 37oC, 5%CO2,humidificado.</li>
	<li>En los momentos deseados, mida la intensidad luminiscente de los tejidos utilizando un lector de microplacas o un sistema de imágenes in vivo. Por lo general, los efectos farmacológicos se vuelven detectables después de 1–6 días de tratamiento. NOTA: El reactivo de viabilidad basado en luminiscencia es estable durante al menos 3 días en condiciones de cultivo. Sin embargo, el sustrato puede agotarse durante el ensayo dependiendo de la actividad metabólica del tejido. Si se observa una caída significativa de la señal en los tejidos con señales previamente altas, complementar el sustrato en todos los pozos.</li>
	<li>Calcular la viabilidad restante de los tejidos tumorales tratados utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg"> La viabilidad del tejido tratado se normaliza por su viabilidad basal y el cambio de viabilidad de los tejidos tumorales de control.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, demostramos una plataforma para estudios cuantitativos y en tiempo real de eficacia de fármacos en rodajas de tejido tumoral organotípico. El sistema de cultivo de rebanadas de tejido proporciona ventajas distintas sobre los métodos in vitro tradicionales basados en células mediante la captura de la heterogeneidad celular y las características fisiológicas del microambiente tumoral nativo. Esta plataforma también permite un mayor rendimiento para las pruebas de eficacia de fármacos, ayudando a cerrar l...

Las interacciones de las células cancerosas con las propiedades físicas y bioquímicas del tejido estromal circundante forman el TME. TME puede estimular el crecimiento del tumor, metástasis, y modular la respuesta tumoral a la terapia1. En el desarrollo de fármacos preclínicos convencionales, los candidatos a medicamentos suelen ser examinados por primera vez utilizando líneas celulares de cáncer cultivadas, una plataforma de ensayo que carece críticamente del TME2. Esta falta de TME fisiológico en las etapas de preselección basadas en células puede limitar el descubrimiento de agentes eficaces en modelos animales portadores de tumores y puede contribuir a la alta tasa de desgaste de muchos fármacos oncológicos prometedores en etapas clínicas posteriores del desarrollo3.
A pesar de la importancia de la TME en la modulación de las respuestas a los fármacos tumorales, las limitaciones experimentales limitan la aplicación de sistemas más relevantes desde el punto de vista fisiológico durante las primeras etapas del descubrimiento y desarrollo de fármacos. No es práctico examinar cientos de agentes terapéuticos en tumores de modelos animales o muestras de tumores de pacientes. De hecho, los especímenes quirúrgicos son recursos escasos con orígenes genéticos variados y el cribado de miles de moléculas candidatas en modelos animales no es factible debido a la escala experimental, el costo y el bienestar animal.
El cultivo de rebanadas de tejido tumoral, donde se cultivan con precisión secciones de tumores delgados ex vivo, puede abordar la limitación de la TME fisiológica en los ensayos de detección de drogas. Históricamente, el campo de la neurociencia fue pionero e hizo extensas optimizaciones del cultivo de rebanadas para el tejido cerebral4. Recientemente, muchos estudios han demostrado la preparación de rodajas de varios tipos de tejido tumoral, incluyendo tumores derivados de líneas celulares, modelos tumorales espontáneos, xenoinjertos derivados del paciente (PDX) y tumores primarios de pacientes. El cultivo de rebanadas de tejido ex vivo integra beneficios tanto del cultivo in vivo como del in vitro5. Las rebanadas de tejido tumoral conservan la arquitectura intacta del tejido y la composición celular variable, lo que permite el estudio de las células cancerosas dentro del contexto TME.
Este protocolo introduce un sistema de cultivo de rebanadas de tejido tumoral organotípico combinado con un ensayo de viabilidad altamente sensible en tiempo real para evaluar las respuestas de los medicamentos. Las pruebas de eficacia de fármacos en rodajas de tejido tumoral organotípico en protocolos introducidos anteriormente se basan en la medición de los cambios en la viabilidad celular mediante la incorporación de tintes fluorescentes, inmunohistoquímica (IHC), o MTT ((3- [4, 5-dimetiltiazol-2-yl]-2, 5 bromuro de tetrazolio difenil) ensayo6,7,8,9. Sin embargo, todos estos métodos son ensayos de punto final y sufren de baja sensibilidad, largo tiempo de procesamiento, análisis de datos complejos, rango de señal estrecho y alto error experimental. Nuestro reactivo compatible con células vivas basado en luminiscencia mejora estos ensayos al proporcionar un amplio rango de señal y una medición instantánea (5 min) sin procesamiento previo y postprocesamiento mínimo. Este reactivo es altamente sensible y puede coexistir en los medios de cultivo celular, permitiendo la medición continua y de tiempo de viabilidad celular. Este sistema de ensayo es aplicable a la detección de alto rendimiento de los candidatos a fármacos en rebanadas de tejido en el desarrollo de fármacos preclínicos.

<table><tbody><tr><td>Plato de 10 cm</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>plato de 24 pocillos</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>6 mm de diámetro Punzón de biopsia</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td>para TSC medio</td></tr><tr><td>Belzer UW solcución de almacenamiento en frío (solución UW)</td><td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrane Mix</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de corte de acero inoxidable de doble filo</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td><td>para cortar</td></tr><tr><td>Doxorrubicina (clorhidrato)</td><td>Cayman Chemical</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de punta fina</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de punta fina</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td>Para TSC medio</td></tr><tr><td>HBSS sin Calcio, Magnesio o Fenol Rojo</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dra. Alana Welm, Universidad de Utah</td><td>Cáncer de mama PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Solución tampón</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>para medio TSC</td></tr><tr><td>ITS + Premezcla</td><td>Fisher Scientific</td><td>354352</td><td>Para medio TSC</td></tr><tr><td>Espectro IVIS</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratomo</td><td>Leica VT1200S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Para el medio TSC</td></tr><tr><td>Inserto de cultivo celular Millicell, 12 mm, PTFE hidrófilo, 0,4 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Inserto de cultivo celular Millicell, 30 mm, PTFE hidrófilo, 0,4 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>Para medio TSC</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 Adhesivo tisular</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>Pluma de pegamento</td></tr><tr><td>Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140163</td><td>para el medio TSC</td></tr><tr><td>RealTime-Glo MT Ensayo de viabilidad celular</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>Para TSC mediano</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar industriales de un solo filo</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Para eliminar tejidos pegados</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>para medio TSC</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>de sodio Fisher Scientific</td><td>BW13115E</td><td>Para medio TSC</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>de mano ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Punta ancha</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>Punta fina</td></tr><tr><td>William's medium E, sin glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific 12551032</td><td></td><td>para medio TSC</td></tr></tbody></table>

medición de la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Los tejidos tumorales se componen de células cancerosas, células inmunitarias infiltradas, células endoteliales, fibroblastos y matriz extracelular. Este ambiente complejo constituye el microambiente tumoral (TME) y puede modular la respuesta al tratamiento in vivo o respuesta farmacológica ex vivo. Las pantallas convencionales de descubrimiento de fármacos contra el cáncer se llevan a cabo en células cultivadas en una monocapa, un sistema que carece críticamente de la influencia de la TME. Por lo tanto, los sistemas experimentales que integran ensayos sensibles y de alto rendimiento con TME fisiológico fortalecerán el proceso de descubrimiento de fármacos preclínicos. Aquí, introducimos el cultivo de rebanadas de tejido tumoral ex vivo como una plataforma para la detección de fármacos de alto rendimiento medio-alto. El cultivo de rebanadas de tejido organotípico constituye secciones tumorales delgadas y cortadas con precisión que se mantienen con el apoyo de una membrana porosa en una interfaz líquido-aire. En este protocolo, describimos la preparación y el mantenimiento de rebanadas de tejido preparadas a partir de tumores de ratón y tumores a partir de modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX). Para evaluar los cambios en la viabilidad de los tejidos en respuesta al tratamiento farmacológico, aprovechamos un ensayo biocompatible basado en la luminiscencia que permite la medición en tiempo real, rápida y sensible de células viables en el tejido. Usando esta plataforma, evaluamos las respuestas dependientes de la dosis de las rodajas de tejido al inhibidor de la multiquinasa, la estaurosporina y el agente citotóxico, la doxorubicina. Además, demostramos la aplicación de rodajas de tejido para farmacología ex vivo mediante la detección de 17 fármacos clínicos y preclínicos en rodajas de tejido preparadas a partir de un único tumor PDX. Nuestra plataforma de cribado ex vivo, fisiológicamente relevante, altamente sensible y robusta, fortalecerá en gran medida el descubrimiento de fármacos oncológicos preclínicos y la toma de decisiones sobre el tratamiento.

Aquí, demostramos un protocolo de evaluación de eficacia de múltiples fármacos de curso de tiempo para las rodajas de tejido tumoral preparadas a partir de tejidos tumorales de mama 4T1 de ratón y un modelo PDX de cáncer de mama, HCI01012. Preparamos con éxito rebanadas de tejido de varios tumores derivados del ratón, PDX, y tumores de pacientes frescos10. El flujo de trabajo general de la preparación del tejido tumoral y la prueba de eficacia del fármaco se describe en <st...

Introducimos un protocolo para medir la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral orgatípico. La estrategia experimental descrita aquí proporciona una plataforma para llevar a cabo pantallas de fármacos de rendimiento medio-alto en rodajas de tejido derivadas de tumores clínicos o de ratón en condiciones ex vivo.

Medición de la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Nuestro protocolo es compatible con otros métodos de análisis molecular y permite evaluar cómo los fármacos afectan la viabilidad de las rebanadas de tejido en tacto y el rendimiento del cribado de rendimiento medio. La principal ventaja de esta técnica es que podemos medir la viabilidad de una rebanada de tejido entera en tiempo real con muy poco pre-o post-procesamiento. Esta técnica acelera el desarrollo de fármacos preclínicos y la oncología mediante la prueba de los candidatos a medicamentos o las rebanadas de tejidos adquiridas directamente a partir de muestras de tejido tumoral del paciente.Nuestro método de evaluación de la viabilidad tisular en tiempo real es bastante versátil y se puede aplicar a la biología del cáncer, la neurociencia y los estudios de biología del desarrollo. Preparar rebanadas de tejido viables en el tacto es la clave para el éxito del procedimiento. Los ajustes de Vibratome en composición media deben ajustarse de acuerdo con el tipo de tejido y la firmeza.El día de la adquisición de la rebanada de tejido tumoral, aliquot 250 microlitros de medio de cultivo de corte de tejido por pozo en una placa de 24 pozos y colocar un inserto de cultivo de tejido e

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Fuente: Ciraku, L., et. al. Un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento de tumores metastásicos cerebrales de cáncer de mama. J. vis. exp. (2021). Este video muestra la imagen de células tumorales que expresan luciferasa en un corte de cerebro de ratón organotípico. Se añade luciferina al medio y la placa se coloca dentro de la cámara del sistema de imágenes in vivo. Se ajustan los parámetros para la captura de imágenes y se definen la forma y el tamaño del tumor.

Imágenes de bioluminiscencia para evaluar el crecimiento tumoral en un corte de cerebro de ratón organotípico

El cocultivo de cortes de cerebro organotípicos con células de carcinoma permite visualizar cambios morfológicos por fluorescencia, así como de campo brillante (vídeo) microscopía durante el proceso de la invasión de células de carcinoma de tejido cerebral. Este sistema modelo también permite enfoques de cambio de células y de reposición y ofrece una amplia variedad de manipulaciones y análisis.

Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma

Muchos tipos de tumores cerebrales humanos se localizan en regiones específicas dentro del cerebro y son difíciles de cultivar en cultivo. Este protocolo aborda el papel del microambiente tumoral e investiga nuevos tratamientos farmacológicos mediante el análisis de células tumorales cerebrales primarias fluorescentes que crecen en un corte de cerebro de ratón organotípico.

Un tumor cerebral / organotípicos rebanada Co-cultura del sistema para estudiar microambiente tumoral y dirigida Medicamentos Terapias

Los modelos ex vivo actuales de glioblastoma (GBM) no están optimizados para el estudio fisiológicamente relevante de la invasión tumoral humana. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y mantenimiento de cultivos de corte organotípico de tejido humano GBM fresco. Se proporciona una descripción de microscopía de lapso de tiempo y técnicas de análisis de migración celular cuantitativa.

Un Modelo de Cultura de Rebanadas Organotípicas de Glioblastoma Humano para el Estudio de la Migración de las Células Tumorales y los Efectos Específicos para el Paciente de los Medicamentos Anti-Invasivos

Nos proporcionan un método para la generación, cultivo y análisis sistemático de rebanadas organotypic derivadas de tumores de pulmón murino. También se describe cómo optimizar el grosor de corte y cómo seleccionar las concentraciones de la droga para el tratamiento de rodajas de tumor.

Establecimiento y análisis de segmento de Tumor explantes como prerrequisito para la prueba de diagnóstico

Este protocolo describe la preparación de cultivos organotípicos de cortes (OTSC). Esta técnica facilita el cultivo ex vivo de tejido multicelular intacto. Las OTSC se pueden utilizar inmediatamente para probar su respectiva respuesta a los fármacos en un entorno multicelular.

Cultivos de cortes organotípicos como modelos preclínicos del microambiente tumoral en cáncer de páncreas primario y metástasis

Este protocolo describe un método semiautomatizado para exámenes de detección de fármacos con organoides de rendimiento medio a alto y software de análisis de imágenes automatizado e independiente del microscopio para cuantificar y visualizar las respuestas multiparamétricas a fármacos de un solo organoide para capturar la heterogeneidad intratumoral.

Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

Describimos un protocolo para la producción, cultivo y visualización de cánceres humanos, que han hecho metástasis a las superficies peritoneales. Las muestras tumorales resecadas se cortan con un vibratomo y se cultivan en insertos permeables para aumentar la oxigenación y la viabilidad, seguidas de imágenes y análisis posteriores mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Cultivo e imágenes de cortes tumorales organotípicos ex vivo de pseudomixoma peritonei a partir de muestras tumorales humanas resecadas

Los organoides tumorales derivados de pacientes son un sistema modelo sofisticado para la investigación básica y traslacional. Este artículo de métodos detalla el uso de imágenes fluorescentes multiplexadas de células vivas para la evaluación cinética simultánea de diferentes fenotipos de organoides.

Imágenes multiplexadas de células vivas para las respuestas a los medicamentos en modelos de organoides derivados de pacientes de cáncer

Presentamos un protocolo paso a paso para imágenes tridimensionales, sin etiquetas y de alta resolución de organoides mediante holotomografía de baja coherencia. Este protocolo detalla la preparación del cultivo de organoides, la adquisición de imágenes y el análisis computacional de imágenes, lo que permite la visualización en tiempo real de la dinámica estructural y las respuestas a los fármacos en organoides vivos.

Imágenes 3D de alta resolución y análisis de aprendizaje automático sin etiquetas de organoides intestinales mediante holotomografía de baja coherencia

Aprenda a medir la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico. Este método permite el cribado de medicamentos con alto rendimiento en muestras derivadas de pacientes.

Medición de la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico

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