Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular
1 de mayo de 2020
Este protocolo describe el uso de aglomeración macromolecular para crear un modelo de tejido cicatricial humano in vitro que se asemeja a condiciones in vivo. Cuando se cultivan en un ambiente macromolecular lleno de gente, los fibroblastos de la piel humana exhiben fenotipos, bioquímica, fisiología y características funcionales que se asemejan al tejido cicatricial.
Creamos un modelo individual rico en colágeno para imitar el entorno que las células experimentan in vivo utilizando la técnica de aglomeración macromolecular. La piel es un ambiente lleno de gente, a diferencia del ambiente líquido que ya utilizamos para cultivar células in vitro. En comparación con el sistema tradicional de cultivo celular monocapa, este modelo recrea el ambiente molecular abarrotado que las células experimentan in vivo, especialmente en los tejidos cicatriciales donde abundante matriz extracelular desplaza el agua líquida.
Además de las cicatrices hipertróficas, esta técnica de hacinamiento macromolecular se puede utilizar para estudios donde la matriz extracelular es abundante, como la fibrosis pulmonar. Cultivar fibroblastos normales y derivados de cicatrices de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego sembrarlas en 24 placas de pozo a 50.000 células por pozo en un mililitro de medio.
Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Prepare el hacinamiento macromolecular o los medios MMC mezclando Ficoll 70, Ficoll 400 y ácido ascórbico en 10%FCS DMEM. Incubar los medios en un baño de agua para dispersar a los hacinadores en la solución.
A continuación, esterilizarlo con un filtro de 0,2 micrómetros. Aspirar los medios gastados de los fibroblastos y reemplazarlos por medios MMC recién hechos. Incubar las células a 37 grados centígrados durante seis días, cambiando los medios de MMC cada tres días.
Preparar una solución Sirius Red disolviendo 0,2 gramos de polvo Direct Red 80 en 200 mililitros de agua desionizada destilada con un mililitro de ácido acético. Aspirar los medios MMC de las células y añadir 300 microlitros de la solución Sirius Red a cada pozo. Luego devuelva las células a la incubadora durante 90 minutos.
Después de la incubación, enjuague suavemente la solución Sirius Red con agua del grifo y deje que la placa se seque al aire durante la noche. Al día siguiente, extraiga el Sirius Red añadiendo 200 microlitros de 0,1 molar de hidróxido de sodio en cada pozo y agitando la placa durante cinco a 10 minutos. Transfiera 100 microlitros de la mancha extraída a una placa transparente de 96 pozos y mida la absorbancia a 620 nanómetros con un lector de microplamas.
Lave cada pozo con 200 microlitros de PBS y fije las células con metanol a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, añadir 3%BSA a los pozos e incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aspirar la solución de bloqueo y añadir 200 microlitros de anti-colágeno un anticuerpo a cada pozo.
Incubar el plato durante 90 minutos. A continuación, aspirar el anticuerpo y lavar los pozos tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Añadir 200 microlitros de Goat Anti-Rabbit-FITC Secondary Anticuerpo y DAPI a cada pozo.
Cubra la placa con papel de aluminio e incubarlo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Deseche el anticuerpo secundario y el DAPI y repita los lavados con PBS. A continuación, visualice la fluorescencia directamente bajo un microscopio.
Después de lavar las células dos veces con PBS, agregue 40 microlitros de tampón de lysis en cada pozo y raspe la capa celular con una punta de pipeta. A continuación, transfiera el izado proteico a tubos de micro centrífuga para medir la concentración de proteínas. Cargue 10 microgramos de proteína en cada pozo de un gel proteico de cuatro a 12%Bis-Tris y realice SDS-PAGE a 200 voltios durante 30 minutos.
Cuando haya terminado, transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa ejecutando una mancha occidental a 90 voltios durante 90 minutos, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas entre el gel y la membrana. Bloquee la membrana con 10 mililitros de tampón de bloqueo. Luego incubarlo con anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, lave la membrana cinco veces con 0.1 por ciento de TBS Tween 20 durante cinco minutos por lavado. A continuación, incubar la membrana con un anticuerpo secundario apropiado para la especie durante una hora a temperatura ambiente. Repita los lavados y visualice la fluorescencia con un sistema de imágenes.
Después de purificar el ARN total con un kit comercial de extracción de ARN, mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de micro volumen. A continuación, utilice un kit de síntesis de ADNc para realizar una síntesis de ADN de primera hebra. Mezcle el ADNc con 10 microlitros de SYBR Green Supermix y transfiera las muestras a una placa personalizada de 96 pozos pre-recubierta con imprimadores de oligonucleótidos.
Ajuste el volumen total a 20 microlitros por pozo con agua y ejecute RT-PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. La densidad celular de los fibroblastos de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas aumentó significativamente después del cultivo con Ficoll en comparación con el uso de PVP o el control. El hacinamiento macromolecular con Ficoll a una ocupación de volumen de 9% fraccionado mejoró significativamente la deposición de colágeno, incluido el colágeno, en comparación con otras formulaciones.
Esto se demostró aún más con el análisis cuantitativo. Se encontró fibroblastos derivados de cicatrices y fibroblastos dérmicos normales cultivados en ambientes de MMC para regular la expresión de especies de ECM además de colágeno. En particular, se encontró que una expresión elevada de metaloproteinasas de matriz o MMP se acumulaba en tejidos cicatriciales hipertróficos en comparación con los tejidos nativos.
Se observó que la expresión de MMP2, nueve y 13 estaba significativamente regulada en ambos cultivos celulares cultivados en condiciones de hacinamiento macromolecular. Los MMP desempeñan un papel importante durante la cicatrización de heridas y la formación de cicatrices, regulando el montaje y la remodelación de ECM. La síntesis de interleucina seis y el factor de crecimiento endotelial vascular era indetectable en una mancha occidental.
Pero el análisis de RT-PCR reveló que la expresión de la interleucina seis estaba significativamente regulada hacia arriba, mientras que la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular estaba regulada hacia abajo en fibroblastos cultivados en condiciones de MMC. Al intentar este protocolo, es muy importante elegir fibroblastos dérmicos que tengan muy pocos patógenos de CO. También tenemos que tener en cuenta que el ácido ascórbico es un ingrediente esencial en el medio MMC.
Estamos particularmente interesados en detectar aún más la deposición y alineación del colágeno en este modelo MMC. Planeamos utilizar técnicas microscópicas avanzadas para comparar este modelo in vitro con los tejidos cicatriciales nativos in vivo. Animamos a otros a utilizar esta técnica de hacinamiento macromolecular para mejorar la autenticidad in vitro de los tejidos modales auxiliares.
Por supuesto, el hacinamiento macromolecular también se puede utilizar para recalcular modelos de enfermedad y patología in vitro.
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Descripción general
Este protocolo describe el uso del hacinamiento macromolecular para crear un modelo de tejido de cicatriz hipertrófica humana in vitro que se asemeja a las condiciones in vivo. Cuando se cultivan en un entorno macromolecular congestionado, los fibroblastos dérmicos humanos exhiben fenotipos, bioquímica, fisiología y características funcionales similares al tejido cicatricial.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- La piel es un entorno con alta concentración macromolecular, a diferencia de los cultivos celulares líquidos tradicionales.
- Las cicatrices hipertróficas presentan características celulares únicas.
- La concentración macromolecular puede imitar las condiciones in vivo para los fibroblastos.
- Esta técnica también podría aplicarse a otras afecciones como la fibrosis pulmonar.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo que refleje con precisión el entorno in vivo del tejido cicatricial.
- Estudiar el comportamiento de los fibroblastos en una matriz extracelular congestionada.
- Mejorar la comprensión de la formación del tejido cicatricial y de las afecciones relacionadas.
Métodos Utilizados
- Creación de un modelo rico en colágeno utilizando el enriquecimiento macromolecular.
- Comparación con sistemas tradicionales de cultivo celular en monocapa.
- Siembra de fibroblastos derivados de cicatrices y fibroblastos normales en placas de 24 pocillos.
- Uso de condiciones de crecimiento específicas según las indicaciones del manuscrito.
Resultados principales
- Los fibroblastos en un entorno congestionado exhiben características similares a las de una cicatriz.
- El modelo imita con éxito la matriz extracelular del tejido cicatricial.
- Los hallazgos sugieren aplicaciones potenciales en el estudio de otras afecciones fibróticas.
- Se demostró la importancia de los factores ambientales en el comportamiento celular.
Conclusiones
- La técnica de concentración macromolecular es eficaz para modelar cicatrices hipertróficas.
- Este enfoque puede proporcionar información sobre el comportamiento de los fibroblastos en enfermedades fibróticas.
- Estudios futuros podrían ampliar este modelo para diversas aplicaciones en ingeniería de tejidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El empaquetamiento macromolecular (MMC) permite la creación de modelos in vitro que imitan de cerca el entorno de la matriz extracelular de las cicatrices hipertróficas humanas, abordando una brecha crítica en la investigación traslacional de la fibrosis. Este enfoque mejora la confianza predictiva para la validación temprana de dianas y apoya la reducción de riesgos mecanicistas en las líneas de investigación de enfermedades fibróticas. La relevancia fisiológica y la escalabilidad del modelo lo posicionan como una plataforma reutilizable para estudios de fibrosis y remodelación de la matriz extracelular en toda la cartera de proyectos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías fibróticas y los mecanismos de remodelación de la matriz extracelular en un contexto fisiológicamente relevante.
- Apoya la validación funcional de dianas implicadas en la deposición de colágeno y en la regulación de las metaloproteinasas de la matriz.
- Facilita una mayor confianza predictiva para el avance de candidatos anti-fibróticos al reproducir características del tejido cicatricial similares a las in vivo.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona un sistema estandarizado y reproducible para la evaluación cuantitativa del depósito de colágeno y proteínas de la matriz extracelular.
- Permite un cribado robusto de compuestos dirigidos a la formación de cicatrices y al remodelado de la matriz.
- Facilita la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma para el análisis de alto contenido de las respuestas fibróticas.
Investigación Translacional y Preclínica
- Correlaciona hallazgos in vitro con biomarcadores relevantes para la enfermedad, como la expresión de colágeno I, MMP2, MMP9 y MMP13.
- Conecta el descubrimiento y la validación preclínica mediante la modelización de la biología del tejido cicatricial humano sin recurrir a modelos animales.
- Reduce los riesgos en el avance traslacional al proporcionar información mecanicista sobre la dinámica de la matriz extracelular y la señalización fibrotica.
Integración de la Secuencia y Flujo de Trabajo
Este modelo basado en MMC se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico para programas de fibrosis y cicatrización de heridas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la regulación de la matriz extracelular y la activación de vías fibróticas en fibroblastos humanos.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas del depósito de colágeno y la expresión de proteínas matriciales para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la expresión génica y proteica relacionada con la matriz extracelular en diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Brinda continuidad para la alineación de biomarcadores y estudios mecanicistas relevantes a la patología humana.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una alternativa escalable y éticamente preferible a los modelos animales para la investigación de diversas enfermedades fibróticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas contra la fibrosis.
- Valor operativo: Estandariza la modelización in vitro de tejidos ricos en matriz extracelular mediante protocolos reproducibles y escalables.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en estrategias anti-fibróticas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos contra la fibrosis y en procesos de cicatrización.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el cultivo primario de fibroblastos humanos y en el análisis de la MEC.
- Necesita acceso a microscopía de fluorescencia, lectores de placas e instrumentación de biología molecular.
- Exige la estandarización entre equipos en la preparación del medio MMC y en los protocolos de ensayos cuantitativos.
- Adaptable a otros modelos de enfermedades ricas en MEC, como la fibrosis pulmonar, con optimización del protocolo.
- Depende de fuentes de fibroblastos de alta calidad y bajo contenido de contaminantes, así como de un manejo preciso de los reactivos.
