Producción y caracterización de macrófagos humanos a partir de células madre pluripotentes
16 de abril de 2020
Este protocolo describe la robusta generación de macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas por el hombre, y métodos para su posterior caracterización. La expresión del marcador de superficie celular, la expresión génica y los ensayos funcionales se utilizan para evaluar el fenotipo y la función de estos macrófagos derivados de iPSC.
La investigación de la biología de los macrófagos humanos ha sido limitada porque se basa en la recolección de células de donantes. Este protocolo muestra un método en el que podemos producir macrófagos humanos a partir de células madre pluripotentes en el laboratorio. Este es un protocolo robusto que se puede ampliar para producir macrófagos en grandes cantidades para terapias celulares o investigación.
Las células madre pluripotentes pueden ser manipuladas genéticamente. Así que en este protocolo, podemos generar macrófagos con un fenotipo específico, etiquetas fluorescentes, y también macrófagos para modelar estados de enfermedad. La demostración visual de este protocolo es útil porque el uso de la herramienta de paso fácil no será familiar para muchos investigadores.
Además, el nivel de cuidado necesario al reponer los medios y las células de recolección es difícil de poner en palabras. Cuando las células cultivadas hayan alcanzado el 80% de confluencia, reemplace el medio de cultivo gastado por 1,5 mililitros de medio fresco. Sosteniendo el recipiente de cultivo en una mano, enrolle una herramienta de paso de celda desechable a través de la placa en una dirección.
Todas las cuchillas del rodillo deben tocar la placa. Mantenga una presión uniforme mientras rueda. Repita el balanceo en la misma dirección hasta que todo el pozo haya sido cubierto.
Gire el recipiente de cultivo 90 grados y repita la rodadura. Con una pipeta estéril, utilice medios en el pozo para desalojar las colonias cortadas. Aspirar CELLstart y reemplazar medios.
Transfiera las células en una proporción de uno a cuatro a pozos pre-recubiertos preparados como se describe en el manuscrito. Para comenzar el proceso de diferenciación en el día cero, agregue 2,25 mililitros de medios de la primera etapa en dos pozos de una placa de seis pozos de fijación ultra baja. Luego, para un pozo 80%confluente de iPSCs en una placa de seis pocillos, reemplace el medio de mantenimiento con 1,5 mililitros de medios de la primera etapa.
Corte colonias utilizando una nueva herramienta de paso de celdas. Usando una pipeta, transfiera las colonias cortadas a los dos pozos de la placa de seis pozos de fijación ultra baja. En el segundo día, ajuste las concentraciones de citoquinas añadiendo 0,5 mililitros de medios HESC SFM a la placa de seis pozos que contiene el día dos cuerpos embrionados.
En el cuarto día, cubra cuatro pozos de una placa de cultivo de tejido de seis pozos con 0,1% de gelatina. Después de incubar durante al menos 10 minutos, retire la gelatina y agregue 2,5 mililitros de medios de la segunda etapa. Recoger los cuerpos embrionados formados de los dos pozos de una placa de seis pozos y colocarlos en un tubo centrífugo de 50 mililitros.
Permita que se asienten en la parte inferior del tubo por gravedad. A continuación, aspirar cuidadosamente los medios del tubo y resuspender los cuerpos embrionados en dos mililitros de medios de la etapa dos. Transfiera de 10 a 15 cuerpos embrionados a un pozo recubierto de gelatina que contenga 2,5 mililitros de medios de la segunda etapa e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
De dos a tres semanas, cambie los medios cada tres o cuatro días. El revestimiento de los EBs es crucial. Tener menos de 10 o más de 15 EBs o tenerlos distribuidos de manera desigual puede conducir a bajos rendimientos de macrófagos.
Después de dos a tres semanas, los cuerpos embrionados comienzan a liberar células hematopoyéticas no adherentes en suspensión. Usando un colador de 40 micrómetros, recoja estas células en un tubo de 50 mililitros y luego reponer los medios. Centrifugar la suspensión de células hematopoyéticas a 200 veces g durante tres minutos.
Resuspender las células hematopoyéticas en la etapa tres medios. Luego plancha las células a una densidad de 0,2 veces 10 a las sextas células por mililitro. Cambie la etapa tres medios cada cinco días.
Después de nueve a 11 días, los macrófagos serán completamente diferenciados y completamente funcionales. Agregue ocho veces 10 a los cuartos macrófagos derivados de iPSC en 200 microlitros de medios de etapa tres a cada pocótulo de una placa de 96 pocillos. Añadir 100 microlitros de solución de perlas a cada pozo que contenga macrófagos derivados de iPSC.
Utilice un sistema de imágenes de alto contenido para crear imágenes de la placa. Adquiera tres o más campos a través de cada pozo para obtener una buena representación. Las colonias iPSC, los cuerpos embrionados, las células de suspensión hematopoyéticas y los macrófagos maduros eran morfológicamente distintos.
Los macrófagos derivados de iPSC eran grandes, tenían pequeños núcleos ovalados y tenían abundante citoplasma que contenía muchas vesículas. El fenotipo de macrófago se evaluó mediante citometría de flujo. Los macrófagos maduros derivados de iPSC expresaron el marcador de linaje CD45 y el marcador de maduración de macrófagos 25F9 y fueron negativos para el marcador de macrófagos inmaduras monocitos CD93.
Los macrófagos derivados de iPSC expresaron varios marcadores mieloide de linaje y fueron positivos para el marcador de modulación inmune CD86. Una pequeña proporción de los macrófagos expresó receptores de quimiocina CX3CR1, CCR2, CCR5 y CCR8. La capacidad fagocítica iPSC-DM se evaluó utilizando biopartículas y un sistema de imágenes de alto contenido.
Las biopartículas no eran fluorescentes cuando se añadieron a los cultivos de macrófagos, pero después de la fagocitosis fluoresced verde brillante en el pH ácido intracelular. La fracción fagocítica representa la proporción de macrófagos que las biopartículas fagocitosias y el índice fagocítico es la medida del número de biopartículas que ingirió cada macrófago. Los macrófagos pueden cambiar el fenotipo en respuesta a las señales ambientales.
RT-PCR se utilizó para cuantificar la expresión de ARNm regulada por los genes. Los macrófagos tratados con LPS y la gamma de interferón o IL4 mostraron un porcentaje significativamente menor de células fagocíticas en comparación con los macrófagos ingenuos. Los macrófagos tratados con IL10 mostraron un mayor porcentaje de células fagocíticas y un mayor índice fagocítico.
Este protocolo podría utilizarse para proporcionar una fuente de células lista para usar para tratar enfermedades como la enfermedad hepática crónica, donde se ha demostrado que los macrófagos son terapéuticos en modelos animales. Los macrófagos derivados del iPSC se pueden utilizar para estudiar los macrófagos asociados con varios estados de la enfermedad. Por ejemplo, utilizamos estas células para estudiar los macrófagos asociados con tumores en el cáncer de mama.
Hemos modificado el fenotipo de los macrófagos derivados de iPSC mediante programación genética utilizando un único factor de transcripción llamado KLF1. Con esto, producimos macrófagos que parecen macrófagos isleños eritroides y han proporcionado información sobre la producción y maduración de los glóbulos rojos.
Resumen
Este protocolo describe la generación de macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y su caracterización mediante diversos ensayos. Proporciona un método escalable para producir macrófagos con aplicaciones en investigación y terapéuticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Inmunología
- Terapia Celular
Antecedentes
- La investigación sobre macrófagos humanos ha estado limitada debido a la dependencia de células donantes.
- Las iPSC pueden manipularse genéticamente para crear macrófagos con fenotipos específicos.
- Este protocolo permite la producción de macrófagos para modelar estados de enfermedades.
- Las demostraciones visuales ayudan a investigadores que no están familiarizados con las técnicas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para generar macrófagos humanos a partir de iPSC.
- Caracterizar el fenotipo y la funcionalidad de estos macrófagos.
- Proporcionar una fuente de macrófagos para estudiar diversas enfermedades.
Métodos Utilizados
- Cultivo y diferenciación de iPSC en cuerpos embrionarios.
- Uso de citoquinas para promover la diferenciación en macrófagos.
- Citometría de flujo para evaluar marcadores de superficie celular y funcionalidad.
- Ensayos de fagocitosis para evaluar la actividad de los macrófagos.
Resultados Principales
- Los macrófagos derivados de iPSC mostraron características morfológicas distintas.
- Los ensayos funcionales confirmaron la capacidad de los macrófagos para fagocitar partículas.
- Los macrófagos exhibieron marcadores específicos de linaje y maduración.
- La programación genética permitió la modificación de los fenotipos de los macrófagos.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método escalable para generar macrófagos para la investigación.
- Los macrófagos derivados de iPSC pueden utilizarse para estudiar los mecanismos de las enfermedades.
- Las aplicaciones potenciales incluyen terapias celulares para enfermedades crónicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los macrófagos derivados de iPSC humanas proporcionan una plataforma escalable y genéticamente manipulable para investigar la biología de los macrófagos y los mecanismos de las enfermedades en las fases iniciales del descubrimiento. Este sistema permite una validación sólida de objetivos y una reducción mecanicista de riesgos para carteras de inmunología y terapia celular, superando las limitaciones de las células primarias derivadas de donantes. El enfoque respalda una confianza predictiva y una continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la investigación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la manipulación genética de macrófagos para la validación funcional de dianas y el análisis de vías metabólicas.
- Apoya la modelización de enfermedades mediante la generación de macrófagos con fenotipos específicos o alteraciones genéticas.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al permitir la exploración de vías inmunitarias complejas.
- Mejora la confianza predictiva en la selección de dianas y la clasificación de carteras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona una fuente estandarizada y renovable de macrófagos humanos para el desarrollo de ensayos.
- Permite ensayos cuantitativos reproducibles de fagocitosis mediante imágenes de alto contenido.
- Facilita la selección de compuestos en estados de macrófagos relevantes para enfermedades.
- Permite la reutilización de la plataforma en múltiples modelos de enfermedades y campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea fenotipos de macrófagos in vitro con estados relevantes para la enfermedad, en estudios traslacionales de biomarcadores.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento genético hasta la validación preclínica en enfermedades inmunitarias e inflamatorias.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la modelización de respuestas terapéuticas en macrófagos modificados.
- Proporciona información sobre el potencial de la terapia celular en modelos de enfermedades crónicas y cáncer.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Esta plataforma de macrófagos derivados de iPSC integra desde el descubrimiento temprano hasta la identificación de compuestos prometedores y la investigación preclínica, apoyando la verificación de hipótesis, el desarrollo de ensayos y la modelización traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la interrogación genética y la aclaración de vías en macrófagos humanos.
- Selección: Ofrece ensayos cuantitativos y reproducibles de fagocitosis y fenotipo para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Proporciona resultados basados en citometría de flujo y en imágenes para comparaciones robustas entre condiciones.
- Investigación Traducional: Modela estados de macrófagos relevantes para enfermedades, destinados a estudios de biomarcadores y terapias.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma celular reutilizable y escalable para diversos programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas inmunitarias.
- Valor operativo: Estandariza la producción de macrófagos y los flujos de trabajo de ensayos para lograr reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Permite tomar mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo y una mayor eficiencia del capital al reducir los riesgos de las dianas inmunitarias en fases tempranas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en inmunología y terapia celular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de iPSC, diferenciación y manipulación genética.
- Necesita acceso a infraestructura de imagen de alto contenido, citometría de flujo y biología molecular.
- Exige estandarización entre equipos para protocolos de ensayos y análisis de datos.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes modelos de enfermedad o fenotipos de macrófagos.
- La consistencia del rendimiento y del fenotipo depende de la ejecución precisa del protocolo y del control de calidad.
