Name: Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende a detectar osteoartritis temprana mediante microscopía de fuerza atómica en cartílago articular. Este método cuantifica cambios degenerativos sin dañar las muestras y con alta resolución.

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Agradecemos a nuestros coautores de la publicación original por su ayuda y apoyo.

Las muestras de cartílago humano se obtuvieron de pacientes sometidos a artroplastia total de rodilla en el Departamento de Cirugía Ortopédica del Hospital Universitario de Tuebingen, Alemania, y del Winghofer-hospital, Rottenburg a.N., Alemania, para la etapa final de la OA de la rodilla. Se obtuvo la aprobación completa del comité ético local, institucional y local antes del inicio del estudio (número de proyecto 674/2016BO2). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la participación. Los métodos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices aprobadas.
1. Preparación de la muestra
<ol><li>Preparación del cartílago para la sección del criotome<ol>
<li>Para evaluar los cambios degenerativos en la articulación de la rodilla, tomar muestras de cartílago articular obtenidas de la zona de carga de los cóndilos femorales después de la resección tisular de los pacientes. NOTA: Las muestras que se investigan deben contener al menos una capa delgada de hueso subcondral para permitir una identificación clara de la orientación del tejido con respecto a la superficie interna y externa, permitiendo así también una cosecha de tejido estandarizada de la capa de cartílago superior. El cartílago se puede utilizar para mediciones de AFM hasta 24 horas después de la cirugía. El tejido se puede almacenar en el medio de águila modificado de Dulbecco sin suero (DMEM) con un 2% (v/v) de penicilina-estreptomicina y 1,2% (v/v) de anfotericina B antes de su uso. Sin embargo, almacenar las muestras durante más de 24 horas puede causar artefactos en las mediciones de AFM debido a la hinchazón del tejido.</li>
		<li>Cortar el cartílago articular en su conjunto del hueso subcondral con la ayuda de un bisturí y luego incrustar la muestra de cartílago en medio de incrustación soluble en agua en la perilla criotoma que se congela a baja temperatura en el dispositivo de criotoma. NOTA: El medio congelado estabiliza el tejido que envuelve. También resulta en la congelación de la muestra de cartílago junto con el medio de incrustación. Al cortar el cartílago del hueso, realice un seguimiento de la orientación del tejido. El tejido incrustado para las criosecciones debe colocarse de tal manera que la capa superior (es decir, la superficie articular) del cartílago se dirija a la hoja. Tenga en cuenta que el tejido debe estar completamente cubierto por el medio de incrustación.</li>
	</ol></li>
	<li>Seccionamiento del criotome del cartílago<ol>
<li>Usando un criotomo estándar, seccione el tejido a un espesor de 35 m de la capa superior (es decir, la superficie articular) del cartílago articular que está incrustado en el medio de incrustación soluble en agua congelado. NOTA: En total, se pueden seccionar y utilizar hasta 300 m (que corresponden a unas nueve secciones) para los análisis. El límite propuesto de 300 m corresponde a la profundidad de penetración visual que generalmente se puede obtener con microscopía de fluorescencia en cartílago hialino como cartílago articular. Por lo tanto, es posible clasificar el cartílago de acuerdo con el patrón espacial local predominante y luego medir estos patrones en las secciones correspondientes.</li>
		<li>Recoger las secciones en una diapositiva de vidrio y enjuagar las secciones 3x con solución salina con fosfato (PBS) para eliminar el medio de incrustación soluble en agua.</li>
	</ol></li>
	<li>Pegado de secciones de cartílago en una placa Petri compatible con AFM NOTA: Debido a que el AFM recopila datos por sangría mecánica en la muestra, las secciones deben fijarse en su lugar para permitir mediciones precisas.<ol>
<li>Pegue suavemente las secciones de 35 m de espesor con pegamento de muestra biocompatible en platos de cultivo de tejidos que sean compatibles con el dispositivo AFM. Para ello, tome 2 x 3 gotas de pegamento y colóquelas en el plato de cultivo de tejido en el lugar donde terminará el borde de la sección. Ahora ponga la sección de cartílago en el pegamento y deje que se pegue firmemente a la superficie del plato de cultivo de tejido. NOTA: Las secciones de 35 m de espesor del cartílago articular hialino no son muy propensas al rizado. Sin embargo, si el rizado se produce al extraer las muestras del medio tampón, asegúrese de que el menor líquido posible se pegue a las muestras. Tan pronto como el exceso de agua se haya secado, extienda directamente el tejido sobre las manchas dispersas de pegamento para que se fije a la superficie del plato de cultivo celular. El pegamento se aplica en una capa delgada sólo en los bordes de la muestra y no en toda la sección. Mida sólo la parte de la muestra que está lejos de la zona encolada para eliminar la posibilidad de que el pegamento interfiera con las mediciones.</li>
		<li>Incubar las secciones a temperatura ambiente (RT) durante 2 min para permitir que el pegamento y el tejido se adhieran correctamente. A continuación, cubra las secciones con el medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina y sin bicarbonato de sodio para que estén completamente sumergidos. NOTA: Los movimientos repentinos de la muestra durante la fijación o la aplicación insuficiente de pegamento son errores comunes que dan lugar al desprendimiento del tejido del plato de cultivo. Además, la aplicación del medio Leibowitz debe hacerse de forma suave, para no separar la muestra de la superficie debido a las "ondas" creadas por el medio.</li>
		<li>Coloque el plato Petri con las secciones pegadas en la incubadora de cultivo celular estándar a 37 oC hasta que se realicen las mediciones. NOTA: Asegúrese de que las secciones de tejido son estables y no se separan de la superficie del plato de cultivo de tejido realizando cada paso lentamente.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación en voladizo (pegado de las microesferas)
<ol><li>Preparación del dispositivo AFM y dilución de las microesferas<ol>
<li>Coloque el voladizo en el bloque de vidrio especificado para las mediciones de aire, fíjelo con el muelle y monte el bloque de vidrio en el cabezal AFM.</li>
		<li>Diluir las microesferas en etanol 100% (100 partículas/10 l) y ultrasonidos durante 10 s, de modo que las microesferas se separan y no se agrupan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la configuración para el encolado<ol>
<li>Limpie un portaobjetos de vidrio con un 70% de etanol y móntelo en el soporte de la muestra en el dispositivo AFM. NOTA: La limpieza de la corredera evita que las manchas de polvo que podrían interferir con el proceso de encolado se acumulen en la superficie de la diapositiva.</li>
		<li>Coloque 2 s de la suspensión de la microesfera en el centro de la corredera y 2 s de pegamento cerca de la suspensión de la microesfera. NOTA: Se recomienda colocar la suspensión de la microesfera y el pegamento cerca uno del otro para permitir una transición rápida del voladizo entre el pegamento y las microesferas. Si la transición entre sumergir el voladizo en el pegamento y hacer contacto con una microesfera es demasiado larga, el pegamento eventualmente se endurecerá, perdiendo así sus propiedades adhesivas.</li>
		<li>Deje que el líquido de etanol en la microesfera suspensión se seque al aire, dejando las microesferas en su lugar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pegar las microesferas en la punta del voladizo<ol>
<li>Sumerja el voladizo manualmente en el pegamento con la ayuda del motor paso a paso en pasos de 10 m hasta que la punta esté cubierta por pegamento. Realice este paso rápidamente, ya que el pegamento se seca rápidamente.</li>
		<li>Retraiga el voladizo de nuevo en 100 m, muévalo hacia las microesferas y coloque la punta del voladizo directamente por encima de una sola microesfera.</li>
		<li>Ejecute una medición de espectroscopia de fuerza para sumergir la punta del voladizo en la microesfera seleccionada con los parámetros que se muestran en la Tabla 1. NOTA: Al ejecutar este paso, se utiliza una medición de la superficie de la microesfera para establecer contacto entre la punta del voladizo y la microesfera. El tiempo de contacto relativamente largo que se muestra en la Tabla 1 permite un amplio tiempo de unión entre el pegamento y la microesfera. La curva de fuerza-distancia obtenida durante este paso se genera como un subproducto del encolado de la microesfera en la punta del voladizo y no se procesa para su posterior análisis.</li>
		<li>Una vez que una microesfera está unida al voladizo, retraiga el bloque de vidrio con el voladizo montado en la parte superior y luego retire la cabeza del AFM del microscopio. Por último, desmonte el bloque de vidrio y el voladizo de la cabeza afm.</li>
		<li>Incubar el voladizo a 65oC durante 2 h y dejar secar durante la noche a RT antes de iniciar las mediciones. NOTA: La incubación del voladizo mejora las propiedades adhesivas del pegamento, haciendo más estable el complejo de microesferas en voladizo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparación del dispositivo AFM para mediciones
<ol><li>Ajuste un bloque de vidrio especificado para medir en un entorno líquido en el soporte AFM de modo que la superficie superior sea recta y paralela al soporte AFM.</li>
	<li>Con la ayuda de pinzas, monte cuidadosamente el voladizo seleccionado en la superficie del bloque de vidrio, de modo que la punta AFM con la microesfera sobresalga sobre el plano óptico pulido. NOTA: La punta del voladizo debe sobresalir sobre el plano pulido para poder reflejar el láser del AFM en el fotodetector. Tenga mucho cuidado al colocar el voladizo en el AFM para no rayar la superficie óptica pulida del bloque de vidrio. Rascar el bloque de vidrio puede resultar en dificultades en el ajuste de la alineación del láser y puede interferir con las mediciones posteriores.</li>
	<li>Debido a que el voladizo estará sujeto a presión mecánica, debe fijarse en su lugar. Estabilice el voladizo en el bloque de vidrio deslizando el resorte metálico en la ranura del bloque y sujetando la parte superior del voladizo con el muelle con la ayuda de pinzas.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente el bloque de vidrio con el voladizo en el cabezal AFM y fíjelo con el mecanismo de bloqueo integrado. Asegúrese de que el muelle esté orientado hacia el lado izquierdo para que el voladizo se coloque en la orientación correcta. A continuación, monte el cabezal AFM con el voladizo en el dispositivo AFM.</li>
</ol>4. Carga de la muestra y calibración del voladizo
NOTA: Aquí, la calibración del dispositivo se realiza ejecutando una curva de fuerza en la superficie limpia de la placa Petri llena de medio de Leibovitz sin ningún tejido de muestra. La calibración también se puede realizar utilizando una placa AFM de control independiente llena solo con el medio AFM sin la muestra.
<ol><li>Montaje de la muestra en el dispositivo AFM<ol>
<li>Coloque el plato Petri preparado en el paso 1.3.3 en el portamuestras AFM.</li>
		<li>Encienda el calentador de platos Petri y póntelo a 37 oC. Permita que el plato de cultivo de tejido alcance una temperatura óptima (es decir, 20 min).</li>
		<li>Coloque una lámina protectora en la base del conjunto del voladizo para evitar la condensación de medio en el cabezal AFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibración del dispositivo<ol>
<li>Abra el software(Tabla de materiales), seguido de la ventana de alineación láser, y la ventana que representa la configuración del parámetro de aproximación. A continuación, encienda el motor paso a paso, la luz láser y la cámara CCD.</li>
		<li>Utilice la cámara CCD del microscopio para visualizar e identificar el voladizo. Usando la función de motor paso a paso, baje el voladizo en pasos de 100 m hasta que el voladizo esté completamente sumergido en el medio. NOTA: La sumergición del voladizo en el líquido es identificable visualmente a través de la cámara CCD. Cuando rompe la superficie del agua, la punta en voladizo crea reflejos circulares fácilmente perceptibles en el agua.</li>
		<li>Dirija el láser en la parte superior del voladizo utilizando los tornillos de ajuste. NOTA: No sobrefuerce los tornillos, ya que esto dañará el mecanismo de alineación láser. El voladizo se ve desde abajo y el rayo láser viene desde arriba.</li>
		<li>Una vez que el láser se coloca en el voladizo, ajuste el rayo láser con la ayuda de tornillos en el dispositivo AFM para que el haz reflejado caiga sobre el centro del fotodetector. Mantenga monitoreando la posición del rayo láser utilizando la función de alineación láser. NOTA: El detector capta la desviación del rayo láser reflejado por el voladizo y lo convierte en una señal eléctrica.</li>
		<li>Después del ajuste láser-cantilever, la señal Sum tiene que ser de 1 V o superior, mientras que las desviaciones laterales y verticales tienen que estar cerca de 0. Si no se obtienen estos valores, ajuste el fotodetector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtención de la curva de fuerza de calibración<ol>
<li>Para llegar a la superficie de la antena AFM para iniciar las mediciones, ejecute un enfoque de escáner con los parámetros de aproximación indicados en la Tabla 2. Una vez que se alcanza la parte inferior del plato de cultivo de tejido, retraiga el voladizo en 100 m. NOTA: En este punto, la sonda está exactamente a 100 m por encima de la parte inferior de la placa de cultivo de tejido.</li>
		<li>Configure los parámetros RUN y ajuste los parámetros mostrados en la Tabla 3. Haga clic en el botón RUN para iniciar una medición y obtener una curva de fuerza-distancia de calibración. NOTA: La curva de fuerza obtenida aquí se muestra en la Figura 1.</li>
		<li>En la curva de fuerza-distancia de calibración, seleccione la región para un ajuste lineal de la curva retraída en el software. NOTA: El ajuste lineal se realiza para medir la sensibilidad del voladizo. Una vez que el ajuste lineal está en su lugar, los valores serán guardados por el software. La medición constante del resorte o el ruido térmico del voladizo es calculado por el software después.</li>
		<li>Como las mediciones se realizan en medio a una temperatura de 37 oC, ajuste la variable de temperatura a 37 oC en el software para imitar las condiciones fisiológicas lo más cerca posible. NOTA: Al final de la calibración, la desviación vertical se guarda y se muestra en la unidad de fuerza, la Newton (N), en lugar de voltios (V), que es la unidad del registro original por el detector de fotodiodo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caracterización biomecánica del ECM y PCM mediante la realización de mediciones de elasticidad a través de AFM
<ol><li>Identificación de los patrones de condrocitos en la sección del cartílago<ol>
<li>Observar la sección del cartílago bajo un microscopio de contraste de fase integrado en el sistema AFM e identificar los patrones celulares específicos10 del cartílago articular de la rodilla osteoartrítica: cuerdas simples (áreas de tejido sano), cuerdas dobles (degeneración del tejido inicial), racimos pequeños y grandes (ambos degeneración avanzada del tejido). Vea la Figura 2A–D.</li>
		<li>Una vez identificado el patrón deseado específico, mida dos sitios por patrón elegido por tipo de matriz (PCM o ECM) y realice nueve repeticiones de medición en cada sitio de medición(Figura 2E,F). Asegúrese de que un tamaño de muestra sea lo suficientemente grande como para tener en cuenta posibles imprecisiones. NOTA: Para las mediciones de PCM, coloque el voladizo cerca de las celdas (como se muestra en los círculos rojos de la Figura 2E,F). Para realizar las mediciones del ECM, seleccione una región sin ninguna célula (mostrada por el área azul en el cuadro 2E,F)y realice la sangría como se describe en el paso 5.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sangría del sitio objetivo<ol>
<li>Realizar un enfoque seguido de una retracción para que el voladizo se coloque 100 m por encima del tejido, que será la posición inicial para las mediciones posteriores.</li>
		<li>Concéntrese en el PCM o ECM del patrón que se va a medir y fije el ratón del ordenador en ese punto. NOTA: El ratón servirá como marcador visual para el sitio de destino de sangría. Una vez que el enfoque cambia a la punta del voladizo, las estructuras tisulares se volverán indistinguibles o borrosas.</li>
		<li>Ahora concéntrese en la sonda y mueva la punta de la sonda al punto previamente fijado por la flecha del ordenador. A continuación, inicie las mediciones con RUN, utilizando el parámetro de punto de ajuste obtenido mediante la calibración del voladizo. NOTA: En la Figura Suplementaria 1se muestra una curva de fuerza ejemplar obtenida al medir el PCM de una sola cadena.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Procesamiento de datos
NOTA: El análisis de datos o la determinación del módulo elástico se realiza utilizando un modelo Hertz como se describió anteriormente11,12. La forma del indentador era esférica debido al uso de microesferas en la punta y la proporción de Poisson se mantuvo en 0.5 basado en la literatura anterior13,14,15.
<ol><li>Abra el software de procesamiento de datos(Tabla de materiales)compatible con los datos obtenidos del dispositivo AFM.</li>
	<li>Seleccione el modelo Hertz en el software para procesar las curvas de fuerza-distancia. Establezca la relación de Poisson en 0,5 y seleccione la forma de la punta como esférica y un radio de punta de 12,5 m.</li>
	<li>Una vez ajustados todos los parámetros, se ajustan los resultados y el software calcula y muestra el módulo del Joven.</li>
</ol>

<ol><li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pericellular+matrix+as+a+transducer+of+biomechanical+and+biochemical+signals+in+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Utilizando AFM como una técnica novedosa y poderosa para medir las propiedades biomecánicas de los materiales biológicos a un nivel nanoescala, medimos las propiedades elásticas del ECM y pcM en el cartílago articular osteoartrítico humano. Las muestras de cartílago se seleccionaron de acuerdo con su patrón espacial predominante de organización de condrocitos como un biomarcador basado en imágenes para la degeneración del tejido local. Como era de esperar, se observó una fuerte disminución en los valores de elasticidad d...

El cartílago articular es un tejido avascular y aneural. Los condrocitos escasamente dispersos producen, organizan y mantienen una matriz extracelular expansiva (ECM) en la que están incrustados. Como parte distinta y especializada del ECM, los condrocitos están rodeados por una fina capa de matriz especializada conocida como matriz pericelular (PCM). El PCM actúa como una interfaz de matriz celular sensible al mecanosensible 1 que protege los condrocitos2 y modula su respuesta biosintética3. Como se describió anteriormente4, en cartílago sano, los condrocitos están dispuestos en patrones espaciales específicos y distintos que son específicos para cada capa de tejido y articulación4,5 y dependen de los mecanismos de carga mecánica específicos de la articulación6. Estos patrones cambian de pares y cuerdas en cartílago sano a cuerdas dobles con la aparición de osteoartritis (OA). Con una mayor progresión de la enfermedad, los condrocitos forman pequeños racimos, aumentando gradualmente en tamaño a grandes racimos en OA avanzado. Una pérdida completa de cualquier estructura organizativa e inducción de la apoptosis se observa en la etapa final OA. Por lo tanto, la disposición celular de condrocitos se puede utilizar como un biomarcador basado en imágenes para la progresión de OA4.
Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos no sólo regulan su forma y función, sino que también son cruciales para mantener su vitalidad. Los cambios en la elasticidad pueden propagar o desencadenar la aparición de enfermedades importantes como el cáncer o la OA. La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una poderosa herramienta para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades biomecánicas de estructuras biológicas específicas a escala microscópica, midiendo una amplia gama de fuerza, desde piconewton hasta la micronewton. La principal aplicación de AFM es medir la topografía superficial y las propiedades mecánicas de las muestras a la resolución del subnómetro7. El dispositivo de medición consta de tres componentes principales: 1) Una sonda AFM, que es una punta afilada montada en un voladizo y se utiliza para la interacción directa con la superficie de la muestra. Cuando se aplica la fuerza al voladizo, la deformación de este último se produce de acuerdo con las propiedades del tejido medido. 2) Un sistema óptico que proyecta un rayo láser en el voladizo, que luego se refleja en una unidad detectora. 3) Un detector de fotodiodo que capta la luz desviada del voladizo. Convierte la información recibida sobre la desviación láser por el voladizo en una curva de fuerza que se puede analizar.
Por lo tanto, el principio principal de AFM es la detección de la fuerza que actúa entre la sonda AFM y la estructura objetivo de la muestra. Las curvas de fuerza obtenidas describen las propiedades mecánicas de las estructuras objetivo en la superficie de la muestra como elasticidad, distribución de carga, magnetización, tensión de rendimiento y dinámica de deformación plástica elástica8. Una ventaja importante de La AFM sobre otras técnicas de diagnóstico por imágenes es que el AFM se puede utilizar para medir las propiedades mecánicas de las células vivas en medios o tejidos en un estado nativo sin dañar el tejido. AFM puede funcionar tanto en condiciones líquidas como secas. No hay ningún requisito para la preparación de la muestra. AFM ofrece la posibilidad de tomar imágenes de una muestra y medir sus propiedades mecánicas simultáneamente en especímenes que están cerca de condiciones fisiológicas. En el presente estudio describimos un enfoque novedoso para evaluar la progresión de la OA midiendo la elasticidad del PCM y el ECM en el cartílago articular nativo. La correlación de la organización espacial de los condrocitos con el grado de degeneración del tejido local proporciona una perspectiva completamente nueva para la detección temprana de OA. Sin embargo, la relevancia funcional de estos patrones no se ha evaluado hasta ahora. Debido a que la función principal del cartílago articular es la carga que tiene una fricción baja, el tejido debe poseer propiedades elásticas. AFM permite medir no sólo la elasticidad del ECM, sino también de los patrones celulares espaciales incrustados en su PCM. La correlación observada de elasticidad con el cambio de patrón espacial de los condrocitos es tan fuerte que la medición de la elasticidad por sí sola puede permitir la estratificación de la degeneración del tejido local.
Los módulos elásticos del PCM y el ECM se evaluaron en secciones de 35 m de grosor utilizando un sistema AFM integrado en un microscopio de contraste de fase invertido que permitía la visualización simultánea de la muestra de cartílago. Este protocolo se basa en un estudio ya publicado en nuestro laboratorio9 y describe específicamente cómo caracterizar la disposición espacial de los condrocitos y cómo medir la elasticidad de su PCM y ECM asociados. Con cada cambio de patrón de los condrocitos, también se pueden observar cambios significativos en la elasticidad tanto para el PCM como para el ECM, permitiendo que esta técnica se utilice para medir directamente la etapa de degeneración del cartílago.
Este enfoque validado abre una nueva manera de evaluar la progresión de la OA y los efectos terapéuticos en las primeras etapas antes de que la degradación del tejido macroscópico realmente comience a aparecer. Realizar mediciones de AFM consistentemente es un proceso arduo. En el siguiente protocolo describimos cómo preparar la muestra a medir por AFM, cómo realizar las mediciones reales de AFM comenzando con la preparación del voladizo, cómo calibrar el AFM, y luego cómo realizar las mediciones. Las instrucciones paso a paso proporcionan un enfoque claro y conciso para obtener datos confiables y proporcionar estrategias básicas para procesarlos e interpretarlos. La sección de discusión también describe los escollos más comunes de este método riguroso y proporciona consejos útiles para la solución de problemas.

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de Fuerza Atómica (AFM)</td><td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlín, Alemania</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal AFM</td> <td>(CellHesion 200) JPK</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de muestra biocompatible</td><td>JPK Instruments AG, Berlín, Alemania</td><td>H000033</td><td></td></tr><tr><td>Voladizo</td><td>punta C, k y frac14; 7,4 N/m, All-In-One-AleTl, Sensores económicos, Sofía, Bulgaria</td><td>AIO-TL-10</td><td></td></tr><tr><td>Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase invertida (integrado con AFM)</td><td>AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemania</td><td>L201306_03</td><td></td></tr><tr><td>Medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina</td><td>(Merck KGaA, Darmstadt, Alemania)</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas</td><td>Polysciences</td><td>07313-5</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de placa de Petri asociado con AFM</td><td>JPK Instruments AG, Berlín, Alemania</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>2023-01</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiza</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Países Bajos</td><td>SA6255012</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos no sólo regulan su forma y función, sino que también son cruciales para mantener su vitalidad. Los cambios en la elasticidad pueden propagar o desencadenar la aparición de enfermedades importantes como el cáncer u osteoartritis (OA). La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha surgido como una herramienta fuerte para caracterizar cualitativa y cuantitativamente las propiedades biomecánicas de estructuras biológicas específicas a escala microscópica, midiendo fuerzas en un rango tan pequeño como el piconewton hasta el micronewton. Las propiedades biomecánicas son de especial importancia en los tejidos musculoesqueléticos, que están sometidos a altos niveles de tensión. OA como una enfermedad degenerativa del cartílago resulta en la interrupción de la matriz pericelular (PCM) y la reorganización espacial de los condrocitos incrustados en su matriz extracelular (ECM). La interrupción en PCM y ECM se ha asociado con cambios en las propiedades biomecánicas del cartílago. En el presente estudio utilizamos AFM para cuantificar estos cambios en relación con los cambios específicos del patrón espacial de los condrocitos. Con cada cambio de patrón, se observaron cambios significativos en la elasticidad para el PCM y el ECM. La medición de la elasticidad local permite sacar conclusiones directas sobre el grado de degeneración del tejido local en OA.

A lo largo del modelo fisiopatológico de cadenas a cuerdas dobles, a pequeños y finalmente a clústeres grandes, tanto ECM(Figura 3A)como módulos elásticos PCM(Figura 3B)disminuyeron significativamente entre cada cambio de patrón. La única excepción fue la diferencia en ECM entre cadenas y cadenas dobles (p - 0.072). Los resultados muestran que la relación ECM/PCM(Figura 4B) no cambió significativamente, mientras que se observó una m...

Presentamos un método para investigar los cambios osteoartríticos tempranos a nivel celular en el cartílago articular mediante el uso de microscopía de fuerza atómica (AFM).

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Las propiedades biomecánicas de las células y tejidos regulan su función y vitalidad. AFM permite la cuantificación temprana de la osteoartritis a nivel celular basada en mediciones de elasticidad. AFM permite la adquisición de mediciones a nivel celular sin dañar la muestra y con una alta resolución, fiabilidad y sensibilidad.Los cambios biomecánicos de la propiedad ocurren temprano en la osteoartritis. La medición de la elasticidad local del cartílago articular permite extraer conclusiones válidas sobre el grado de degeneración del tejido local. Para evaluar los cambios degenerativos dentro de la articulación de la rodilla humana, primero utilice un bisturí para cortar el cartílago articular como un todo del hueso subcondral e incrustar la muestra de cartílago en medio de incrustación soluble en agua en la perilla De Cryotome que se congela a baja temperatura en el dispositivo Cryotome.Cuando la muestra se haya congelado, utilice un Cryotome estándar para adquirir secciones de tejido de 35 micrómetros de espesor de la capa superior del cartílago articular, recogiendo cada sección en diapositivas de vidrio individuales. Una vez obtenidas todas las secciones, enjuague las muestras tres veces en PBS fresco durante cinco minutos por lavado para retirar el medio de incrustación soluble en agua. Retire la primera diapositiva del lavado.Después de esto, agregue dos o tres gotas de pegamento de muestra biocompatible por sección en platos Petri individuales compatibles con AFM. Retire cualquier exceso de solución de la muestra y presione suavemente los bordes de la sección seca sobre las manchas de pegamento. Después de dos minutos, cubra cuidadosamente los tejidos unidos con el medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina y coloque los platos en una incubadora de cultivo celular hasta que se analicen las muestras.Para preparar el dispositivo AFM, ajuste un bloque de gas para medir en un entorno líquido en el soporte AFM a que la superficie superior sea paralela al soporte, y utilice pinzas para montar cuidadosamente el voladizo seleccionado en la superficie del bloque de vidrio de modo que la punta AFM con la microesfera sobresalga sobre el plano óptico pulido. Para estabilizar el voladizo en el bloque de vidrio, deslice el resorte metálico en la ranura del bloque y utilice pinzas para sujetar la parte superior del voladizo con el resorte. Coloque cuidadosamente el bloque de vidrio con el voladizo en el cabezal AFM y fije el bloque con el mecanismo de bloqueo integrado.A continuación, monte el cabezal AFM con el voladizo en el dispositivo AFM con el resorte orientado hacia la izquierda. Para montar la muestra en el dispositivo AFM, coloque la muestra de placa Petri en el portacuchillas AFM y ajuste el calentador de platos Petri a 37 grados Centígrados. Después de unos 20 minutos, abra el software del dispositivo y las ventanas de configuración de parámetros de aproximación y alineación láser.A continuación, encienda el motor paso a paso, la luz láser y la cámara CCD y utilice la función de motor paso a paso para bajar el voladizo en pasos de 100 micrómetros hasta que el voladizo esté completamente sumergido en el medio. Utilice los tornillos de ajuste para dirigir el láser en la parte superior del voladizo y utilice los tornillos del dispositivo AFM para ajustar el rayo láser de modo que el haz reflejado caiga en el centro del fotodetector. Una vez ajustado el voladizo láser, ajuste el fotodetector según sea necesario para ajustar la señal de suma a un voltio o superior y las desviaciones laterales y verticales a cerca de cero.Para obtener la curva de fuerza de calibración, ejecute un enfoque de escáner con los parámetros de aproximación indicados en la tabla. Una vez que se alcance la parte inferior de la planta de cultivo de tejido, retraiga el voladizo en 100 micrómetros. Configure los parámetros de ejecución como se indica en la tabla.Y haga clic en ejecutar para iniciar una medición y obtener una curva de distancia de fuerza de calibración. La curva de fuerza se obtiene como se ilustra en la figura. En la curva de distancia de fuerza de calibración, seleccione la región para un ajuste lineal de la curva retraída.Una vez que el ajuste lineal está en su lugar, los valores serán guardados por el software. A continuación, a medida que las mediciones se realizan en medio a 37 grados Celsius temperatura, establezca la variable de temperatura en el software en 37 grados para imitar las condiciones fisiológicas lo más estrechamente posible. Para identificar los patrones de conversita en las secciones de la muestra de cartílago, localice e identifique los patrones celulares específicos del cartílago articular a partir de la rodilla osteoartrítica en el microscopio de contraste de fase, que pueden incluir cadenas simples indicativas de áreas de tejido sano, doble cadena indicativa del comienzo de la degeneración tisular, pequeños racimos, que son signos de degeneración avanzada del tejido, y grandes racimos, indicativos de la destrucción del tejido final.Una vez que se ha identificado un patrón deseado específico, para mediciones de matriz pericelular, coloque el voladizo cerca de las celdas y mida dos sitios por patrón elegido por tipo de matriz, nueve veces por sitio de medición, incluyendo un tamaño de muestra lo suficientemente grande como para tener en cuenta posibles inexactitudes. Concéntrese en la matriz celular del patrón a medir y fije el ratón de la computadora en ese punto. A continuación, concéntrese en la sonda y mueva la punta de la sonda al punto previamente fijado por la flecha del equipo.Para realizar mediciones de la matriz extracelular, seleccione una región sin células y realice un enfoque seguido de una retracción para que el voladizo se coloque 100 micrómetros por encima del tejido. A continuación, haga clic en Ejecutar para iniciar las mediciones, utilizando el parámetro de consigna obtenido mediante la calibración del voladizo. Para procesar los datos obtenidos, abra el software de procesamiento de datos compatible con los datos obtenidos del dispositivo AFM y seleccione el modelo Hearst en el software para procesar las curvas de distancia de fuerza.Establezca la relación de Poisson en 0,5, la forma de la punta como esférica y el radio de la punta en 12,5 micrómetros. Una vez ajustados todos los parámetros, se ajustarán los resultados y el programa de Young's Modulus será calculado por el software. A lo largo del modelo fisiopatológico de cuerdas a cadenas dobles y de racimos pequeños a grandes, los módulos elásticos de matriz extracelular y pericelular disminuyen significativamente entre cada cambio de patrón, excepto entre cadenas y cadenas dobles.Además, la relación de matriz extracelular-pericelular no cambia significativamente, mientras que se observa una marcada disminución en las diferencias absolutas de elasticidad entre las matrices extracelulares y pericelulares. Los valores de elasticidad dependen de varias condiciones, como la profundidad de sangría o las propiedades de punta en voladizo. Por lo tanto, AFM es el más adecuado para comparar diferentes condiciones dentro de la misma configuración experimental.Como el AFM mide la elasticidad local de la muestra, las secciones deben fijarse en su lugar para permitir mediciones precisas y evitar daños en voladizo. Para analizar más a fondo los procesos responsables de los cambios de elasticidad tisular, la cuantificación bioquímica de la estructura de las proteínas de interés se puede realizar a través de manchas occidentales o ELISAs.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

La rigidez de la matriz extracelular influye fuertemente en múltiples conductas de las células adherentes. Matriz de rigidez varía espacialmente a lo largo de un tejido, y sufre modificaciones en las condiciones de diversas enfermedades. Aquí desarrollamos métodos para caracterizar las variaciones espaciales en la rigidez de los tejidos del ratón normal de los pulmones y fibrosis con microindentation microscopia de fuerza atómica.

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La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

El protocolo actual establece un método riguroso y reproducible para la cuantificación de los cambios morfológicos articulares que acompañan a la osteoartritis. La aplicación de este protocolo puede ser valiosa para monitorear la progresión de la enfermedad y evaluar las intervenciones terapéuticas en la osteoartritis.

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Este artículo de metodología presenta un protocolo de medición cuantitativa asistido por software para cuantificar el grosor óseo subcondral histológico en articulaciones de rodilla osteoartríticas murinas y articulaciones normales de rodilla como controles. Este protocolo es altamente sensible al engrosamiento sutil y es adecuado para detectar cambios óseos subcondrales osteoartríticos tempranos.

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El protocolo de indentación de microscopía de fuerza atómica ofrece la posibilidad de diseccionar el papel de las propiedades físicas de la pared celular de una célula particular de un tejido u órgano durante el crecimiento normal o restringido (es decir, bajo déficit de agua).

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El presente protocolo describe los arañazos controlados de microcuchilla en la superficie del cartílago articular después de desestabilizar la rodilla del ratón cortando el ligamento miniescotibial medial. Este modelo animal presenta una forma acelerada de osteoartritis (OA) adecuada para estudiar la formación de osteofitos, la osteosclerosis y el dolor en etapa temprana.

Desestabilización del menisco medial y el cartílago rasguño modelo murino de osteoartritis acelerada

El análisis del líquido sinovial bajo microscopía de luz transmitida, polarizada y compensada se utiliza para evaluar la naturaleza inflamatoria o no inflamatoria de una muestra a través de pasos simples. Es particularmente útil en la osteoartritis para detectar cristales de calcio e identificar un subconjunto más grave de osteoartritis.

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Abordaje de cuestiones prácticas en la microindentación basada en microscopía de fuerza atómica en explantes de cartílago articular humano

Las erosiones óseas son una característica patológica importante de la artritis reumatoide. El propósito de este trabajo es presentar una herramienta de capacitación para proporcionar a los usuarios orientación sobre la identificación de roturas corticales patológicas en imágenes de tomografía computarizada cuantitativa periférica de alta resolución para el análisis de erosión.

Identificación de la erosión en las articulaciones metacarpofalángicas en la artritis reumatoide mediante tomografía computarizada cuantitativa periférica de alta resolución

En este protocolo, mostramos cómo preparar tejido de ajolote para microscopía de fuerza atómica (AFM) y realizar mediciones de indentación en cartílago de extremidades intacto y en regeneración.

Mediciones de microscopía de fuerza atómica de cartílago en extremidades de ajolote intactas y en regeneración

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Aprende a detectar osteoartritis temprana mediante microscopía de fuerza atómica en cartílago articular. Este método cuantifica cambios degenerativos sin dañar las muestras y con alta resolución.

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

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