Name: Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende la doble electroporación in utero para estudiar interacciones neuronales en corticogénesis mamífera usando embriones de ratón. Este método permite visualizar poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente.

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Los autores agradecen a Cristina Andrés Carbonell y a los miembros de las instalaciones de Cuidado animal de la Universidad de Valencia por su asistencia técnica. También queremos agradecer a Isabel Fariñas y Sacramento R. Ferrón por los reactivos y compartir sus equipos con nosotros. I.M.W está financiado por un contrato de Garantía Juvenil de la Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D está financiado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz posee una Beca Ramón y Cajal (RYC-2015-19058) del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Esta obra fue financiada RYC-2015-19058 y SAF2017-82880-R (MICINN).

El procedimiento aquí descrito ha sido aprobado por el comité ético encargado de la experimentación, el bienestar animal de la Universidad de Valencia y la Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia y Transición Ecológica de la Comunidad Valenciana, y se adhiere a las directrices del Consejo Internacional de Ciencias Animales de Laboratorio (ICLAS) revisado en el Real Decreto 53/2013 de la legislación española, así como en la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo.
NOTA: Este protocolo implica dos propósitos diferentes: 1) el primer estudio, conocido como "estrategia A", permite el análisis de las interacciones entre las células de Cajal-Retzius (células CR) y las neuronas de proyección cortical nacidas tempranas dentro del mismo hemisferio cerebral; 2) el segundo estudio, "estrategia B", se lleva a cabo con el fin de examinar la inervación de las neuronas de proyección callosal de capa superior al lado contralateral del neocórtex.
1. Preparación de precirugía
<ol><li>Preparación del ADN<ol>
<li>Transformar químicamente o electrocompetentes células E. coli DH5 con los plásmidos de interés, placarlas en placas de agar LB con el antibiótico adecuado, e incubarlas durante la noche a 37 oC. NOTA: Todos los plásmidos utilizados aquí contienen el promotor general para el pollo -actina (CAG) que impulsa la expresión de una proteína fluorescente-reportera (CAG-mCherry y CAG-EGFP para la estrategia A y CAG-BFP y CAG-nFPFP-2A-mtdTomato para la estrategia B). Todos ellos contienen resistencia a la ampicilina (AMP).</li>
		<li>Escoge colonias individuales de cada transformación de plásmido e inicia un cultivo líquido de arranque en 2 ml de caldo de Luria + ampicilina (LB+AMP) en tubos de cultivo bacteriano durante 3 x 4 h a 37 oC con temblor vigoroso (200 rpm). Después, establecer un cultivo bacteriano más grande en un matraz Erlenmeyer de 500 ml añadiendo 200 ml de LB+AMP y 1 ml del cultivo de arranque. Incubar durante la noche a 37oC en el agitador orbital a 200 rpm.</li>
		<li>Utilice un kit de maxi-prep libre de endotoxinas (Tabla de Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante para obtener ADN plásmido puro y concentrado de los cultivos líquidos. Resuspender el ADN en 50-100 l de tampón Tris-EDTA (TE) libre de endotoxinas para obtener concentraciones de al menos 5 g/L.</li>
		<li>Para cada cirugía, preparar una solución con un volumen final de 10 l que contenga 1 l de tinte verde rápido, solución de ADN plásmido de interés para una concentración final de 1 g/L para cada plásmido, y tampón TE libre de endotoxinas. Por ejemplo, mezcle 1 l de tinte verde rápido, 2 ml de una solución de ADN plásmido de 5 g/L y 7 ml de tampón temís.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tirar de pipetas<ol>
<li>Tire de los capilares de vidrio borosilicato (1/0,58 mm de diámetro exterior/interior) en un tirador de micropipeta vertical hasta que la punta alcance una longitud de 1 x 1,5 cm y úsela con fórceps diseccionadoras en un ángulo de aproximadamente 30o bajo un alcance disección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuración de la sala de cirugía<ol>
<li>Coloque todo el equipo en la mesa de operaciones (es decir, pinzas, tijeras, fórceps, micropipetas, agujas y soporte para agujas). Encienda la almohadilla de calentamiento y cúbrala con una almohadilla absorbente quirúrgica estéril. Asegúrese de que el depósito de la máquina para la anestesia por inhalación esté lleno de isoflurano, que el tanque de oxígeno contenga suficiente oxígeno y que el sistema funcione correctamente. NOTA: La sala de cirugía y el material resistente deben mantenerse lo más estériles posible (es decir, todo el material debe ser autoclavizado antes de la cirugía y las superficies deben desinfectarse con 70% de etanol). Los electrodos de platino deben desinfectarse cuidadosamente primero con jabón germicida y segundo con un 70% de etanol antes de la cirugía.</li>
		<li>Preparar 100 ml de solución salina estéril al 0,9% (p/v) que contenga penicilina-estreptomicina 1:100 y llenar un plato de Petri de 10 cm. Coloque la placa encima de la almohadilla calentada para calentar la solución.</li>
		<li>Llene una jeringa de 1 ml con 150 ml de una solución analgésica (p. ej., 0,1 mg/kg de buprenorfina).</li>
		<li>Cargue la pipeta tirada con 5 ml de la solución final de ADN plásmido preparada en el paso 1.1.4. Conecte el capilar a un tubo aspirador controlado por la boca.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Primero en cirugía de electroporación del útero
<ol><li>Coloque un ratón embarazada E11.5 (estrategia A) o E13.5 (estrategia B) C57BL/6 dentro de una cámara de inducción cerrada con isoflurano del 2,5% (v/v) a 0,8 L/min y espere hasta que se anestesice. Transfiera el ratón a la almohadilla de calentamiento y coloque su nariz en una máscara para la entrega constante de isoflurano. Compruebe la ausencia de un reflejo de pedal como indicador de la anestesia adecuada. NOTA: Laedad mbónica se determina en función del día en que se observa el tapón vaginal (E0.5).</li>
	<li>Inyectar a la hembra embarazada con la solución analgésica (0,1 mg/kg de buprenorfina) por vía subcutánea. Para evitar que los ojos se sequen durante el procedimiento, aplique una gota de pomada en cada ojo con un hisopo de algodón.</li>
	<li>Afeitar la zona abdominal del ratón con una maquinilla de afeitar eléctrica y lavar 2x con toallitas de etanol 70% (v/v), una vez con toallitas de yodo, y una última vez con una toallita de etanol.</li>
	<li>Use tijeras para hacer una incisión de 30 mm de largo a través de la piel en el lado derecho del animal y separar cuidadosamente la piel adyacente del músculo con una espátula contundente. Después, haga una segunda incisión en la pared abdominal.</li>
	<li>Cubra el abdomen con un pedazo de papel de tejido plegado previamente desinfectado con un 70% de etanol que contenga una hendidura de 40 mm de largo en su centro. Saque con cuidado el útero de la cavidad abdominal con fórceps de anillo. NOTA: El útero debe mantenerse húmedo con la solución salina caliente preparada en el paso 1.3.2 durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Precargar las pipetas extraídas con la solución de ADN preparada en el paso 1.1.4. Inyectar 0,5 l de la solución de ADN por embrión en el ventrículo lateral del hemisferio seleccionado utilizando el tubo aspirador controlado por la boca hasta que el tinte verde rápido se note dentro del ventrículo.</li>
	<li>Coloque los electrodos de platino tipo fórceps lateralmente alrededor de la cabeza del embrión inyectado (como se muestra en la Figura 1A y la Figura 2A). Orientar los electrodos para apuntar a la región cerebral deseada. Dirija el polo positivo hacia la pared medial para electroporar el dobladillo cortical (estrategia A) o hacia la corteza lateral (estrategia B) para etiquetar las células generadas en esa área. NOTA: En todos los casos, el corazón y la placenta deben evitarse para garantizar la supervivencia embrionaria.</li>
	<li>Aplicar la secuencia específica de pulsos eléctricos con un electroporador de onda cuadrada siguiendo las indicaciones que se muestran en la Tabla 1 (estrategia A E11.5 embriones: cuatro pulsos de 25 V y 40 ms, separados por intervalos de 950 ms; embriones de estrategia B E13.5: cinco pulsos de 35 V y 60 ms, con intervalos de 950 ms).</li>
	<li>Coloque cuidadosamente el útero de nuevo en la cavidad abdominal con fórceps, llénelo con solución salina caliente y cierre la pared abdominal con una sutura de aguja 6-0. Unir los dos lados de la incisión inicial realizada en la piel, ya sea usando una aguja 6-0 de sutura o clips de sutura.</li>
	<li>Mantener el animal en la almohadilla de calentamiento y controlarlo hasta su recuperación de la anestesia. Proporcione una dosis extra de analgesia (150 l)   en una solución de hidrogel colocada en su jaula doméstica.</li>
	<li>24 horas después de la cirugía, administrar una dosis extra de analgesia (150 l). Continúe la monitorización diaria mediante inspección visual para posibles dolores y angustia. Observar el comportamiento del animal, probar sus reflejos normales de las extremidades traseras e inspeccionar la sutura en busca de posibles signos de daño debido a lamer o rascarse de la herida.</li>
</ol>3. Segundo en electroporación del útero
<ol><li>Dos días después de la cirugía inicial, repita los pasos 2.1 a 2.3. Aunque la recuperación de las hembras embarazadas después de la cirugía es muy buena, compruebe que muestran un comportamiento normal y no presentan signos de dolor o angustia antes de realizar la segunda cirugía (E13.5 embriones para la estrategia A y E15.5 para la estrategia B).</li>
	<li>Haga una incisión de 30 mm de largo a través de la piel como en el paso 2.4 y una segunda incisión en la pared abdominal, esta vez en el lado izquierdo del animal. Exponga cuidadosamente el útero encima de un tejido desinfectado como se describe en el paso 2.5. NOTA: Tenga cuidado de no interferir con la incisión realizada anteriormente en el otro lado.</li>
	<li>Inyectar alrededor de 0,5 l por embrión de la solución de ADN en el ventrículo cerebral lateral del hemisferio previamente electroporado en el caso de la estrategia A y en el ventrículo cerebral lateral del hemisferio contralateral para la estrategia B. NOTA: Utilice únicamente embriones que muestren un desarrollo normal y que no se aparecen signos de reabsorción.</li>
	<li>Coloque los electrodos alrededor de la cabeza del embrión como se describe en el paso 2.7, dirigir el electrodo positivo hacia la corteza lateral y aplicar los pulsos apropiados siguiendo las indicaciones indicadas en la Tabla 1 (estrategia A E13.5 embriones: cinco pulsos de 35 V y 60 ms separados por intervalos de 950 ms; embriones de estrategia B E15.5: cinco pulsos de 50 V y 80 ms separados por intervalos de 950 ms).</li>
	<li>Continúe y termine la cirugía como se describe en los pasos 2.8 a 2.10.</li>
</ol>4. Recolección y seccionamiento de tejidos
<ol><li>Estrategia A<ol>
<li>Cuatro días después de la segunda electroporación (E17.5), realizar la luxación cervical de la hembra embarazada y colocarlo en una posición supina.</li>
		<li>Usando tijeras, haga una incisión ventral para extraer los cuernos uterinos y con fórceps colóquelos en un plato de Petri lleno de 1x solución salina tamponada por fosfato (PBS) colocada sobre hielo. NOTA: La baja temperatura hace posible la anestesia de los embriones.</li>
		<li>Usando pinzas, extrae los embriones del saco amniótico y transfiéralos con fórceps a un nuevo plato de Petri lleno de PBS bajo un alcance diseccionado. Sostenga cuidadosamente la cabeza de los embriones usando fórceps y lleve a cabo la disección cerebral con pinzas para primero extraer la piel sobre la cabeza y luego el cráneo. Usa una espátula para extraer los cerebros expuestos.</li>
		<li>Recoger los cerebros con una cuchara y depositarlos en un plato de 48 pozos lleno con la solución fijadora (4% [p/v] paraformaldehído [PFA] en 1x PBS). Pruebe inmediatamente el resultado exitoso de ambas electroporaciones examinando los cerebros utilizando un microscopio de epifluorescencia invertido, por ejemplo.</li>
		<li>Fijar los cerebros embrionarios durante la noche a 4 oC en un agitador orbital. Lavar con 1x PBS para eliminar trazas de PFA. Luego transfiéralos a PBS con conservantes antifúngicos (1x PBS-0.05% (p/v) de azida sódica). ADVERTENCIA: PFA y azida sódica son compuestos citotóxicos que requieren precaución especial durante su utilización.</li>
		<li>Incruste los cerebros fijados en un punto de fusión bajo del 4% (p/v) en 1 veces PBS y espere 10 min hasta que se solidifique. Pegarlos al soporte de tejido vibratomo usando pegamento de cianoacrilato con las bombillas olfativas mirando hacia arriba para obtener secciones coronales.</li>
		<li>Inicie el vibratomo y seleccione los parámetros deseados: 100 m de ancho, 0,60 m/s de velocidad y 0,60 mm de amplitud.</li>
		<li>Asegure el cerebro dentro del recipiente del vibratoma, llénelo con 1 solución PBS y comience a recolectar secciones seriales coronales con la ayuda de un cepillo en una placa de 48 pozos llena de 1x PBS-0.05% (p/v) azida sódica para tener una representación completa del cerebro (por ejemplo, alrededor de siete secciones por pozo y seis pozos por embrión).</li>
		<li>Monte las secciones deseadas en diapositivas de vidrio del microscopio con un cepillo fino. Cúbralos con cubreobjetos de vidrio. Para el almacenamiento a largo plazo añadir medio de montaje, que evita el fotoblanse y fotooxidación. Observe las diapositivas bajo un microscopio de epifluorescencia vertical para evaluar la eficacia de la electroporación.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrategia B<ol>
<li>Deje que los cachorros previamente electrocalados en E13.5 y E15.5 nazcan y esperen hasta que P15 realice la perfusión transcardial utilizando la misma solución fijadora utilizada en el paso 4.1.4.</li>
		<li>Justo antes de la perfusión, administrar por vía intraperitoneal una dosis de 75/1 mg/kg de ketamina/medetomidina. Cuando se pierda el reflejo del pedal, fije el ratón en una posición supina y haga una incisión ventral después de la línea media usando tijeras para exponer tanto la caja torácica como el diafragma.</li>
		<li>Corta el diafragma y abre la caja torácica para acceder al corazón. Sostenga la caja torácica usando un hemostat y haga una incisión en la aurícula derecha con tijeras finas.</li>
		<li>Penetre el ventrículo izquierdo con una aguja conectada con un tubo flexible a una bomba de perfusión peristáltica. Iniciar la perfusión transcardial, suministrando al menos 25 ml de 4% de PFA a un flujo constante de 5,5 ml/min (tiempo total de 5 min).</li>
		<li>Disecciona el cerebro de los animales perfundidos. Primero, retire la piel sobre la cabeza con tijeras y fórceps. Comience a cortar el cráneo con tijeras y retire cuidadosamente las secciones de los huesos del cráneo hasta que se retiren por completo. Finalmente, extrae el cerebro con la ayuda de una espátula.</li>
		<li>Transfiera los cerebros a una placa de 24 pozos y fijelos con un 4% de PFA durante la noche a 4 oC en un agitador orbital. Detenga la fijación reemplazando la PFA por un azida sódica del 0,05% (p/v) en PBS. NOTA: Como se indica en el paso 4.1.5, es aconsejable realizar un lavado intermedio con 1x PBS.</li>
		<li>Repita los pasos 4.1.6 a 4.1.9, cambiando los parámetros del vibratomo para los cerebros postnatales (40 m de ancho, 1,20 m/s de velocidad y 0,5 mm de amplitud). NOTA: La inmunohistoquímica o la inmunofluorescencia se pueden llevar a cabo para detectar marcadores celulares específicos o mejorar la señal de proteínas fluorescentes utilizadas en la electroporación.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Imágenes y análisis de fluorescencia confocal
<ol><li>Encienda el microscopio confocal, coloque las diapositivas del microscopio que contienen las secciones cerebrales montadas en el soporte de las diapositivas del microscopio y seleccione los canales a los que se tomarán las imágenes de fluorescencia (es decir, 420-460 nm para BFP, 490-540 nm para GFP y 570-620 nm para mCherry y tTomato).</li>
	<li>Realice el escaneo de muestras para obtener imágenes de mapa de cada sección cerebral en dos longitudes de onda diferentes para obtener una vista general de la salida de electroporación doble. Una vez terminado, seleccione la lente 10x y el modo de observación multi-area-Z-stack-timelapse. Esto permitirá programar la adquisición automática de imágenes de fluorescencia en diferentes localizaciones XYZ dentro de las secciones cerebrales.</li>
	<li>En cada una de las regiones elegidas (XY), establezca los parámetros de imagen adecuados (es decir, intensidad del láser, sensibilidad fotomultiplicalier y una resolución mínima de 1.024 x 1.024), así como la profundidad del escaneo (Z) según los planos de la muestra donde la fluorescencia es visible.</li>
	<li>Obtenga imágenes de bajo aumento (10x) de todas las regiones elegidas y expórtelas de OIF al formato TIFF utilizando el software del visor del microscopio.</li>
	<li>Cambie a la lente 60x, repita el paso 5.3 y capture imágenes de alto aumento para observar las interacciones celda-célula de una manera más detallada. Expórtelos como se indica en el paso 5.4.</li>
	<li>Abra las imágenes adquiridas con cualquier software de imágenes (por ejemplo, Fiji) para su posterior análisis.</li>
</ol>

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<li>Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+loss+of+Cajal-Retzius+cells+does+not+disrupt+neocortical+layer+order%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order.</a> Development. 133, 537-545 (2006).</li>
<li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+specification%2C+and+diversity+of+callosal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Development, specification, and diversity of callosal projection neurons.</a> Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).</li>
<li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li>
<li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li>
<li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).</li>
<li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+brain%2C+the+human+nature+of+cortical+circuits%2C+and+intellectual+creativity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).</li>
<li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics+identifies+cell+type%E2%80%93specific+molecular+changes+in+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El estudio de las interacciones célula-célula in vivo en regiones con alta densidad celular como la corteza cerebral es una tarea compleja. Los enfoques tradicionales, incluido el uso de anticuerpos para etiquetar las neuritas, no son adecuados debido a la falta de marcadores específicos para diferentes poblaciones celulares. El uso de modelos murino transgénicos, donde un tipo de célula particular expresa una proteína fluorescente, es útil para visualizar los procesos neuronales, pero esto depende de la disponibilidad d...

La corteza cerebral es una estructura muy compleja e intrincadamente organizada. Para lograr tal grado de organización, las neuronas de proyección cortical pasan por complejos procesos de desarrollo que requieren su generación temporal, la migración a su destino final en la placa cortical, y el establecimiento de conexiones de corto y largo alcance1,,2. Durante mucho tiempo, la forma clásica de estudiar la corticogénesis se basó en el uso de modelos murinos knockout o knock-in de genes de interés. Sin embargo, esta estrategia, y en particular el uso de ratones noqueadores condicionales, consume mucho tiempo y es costosa, y a veces presenta problemas adicionales con respecto a la existencia de redundancia genética o la falta de controladores CRE específicos, entre otras cuestiones. Uno de los enfoques que surgieron para tratar de abordar esos problemas y que hoy en día se utiliza ampliamente para estudiar el desarrollo cortical es en la electroporación del útero3,,4. En electroporación del útero es una técnica utilizada para la transgénesis somática, permitiendo la focalización in vivo de las células madre neurales y su progenie. Este método se puede utilizar para etiquetar las célulasmediantela expresión de proteínas fluorescentes 5,6, para la manipulación de genes in vivo (es decir, ensayos de ganancia o pérdida de función)7,8,9, para aislar cortices electroporados in vitro y células de cultivo8,10. Además, en la electroporación del útero permite el control temporal y regional de la zona objetivo. Esta técnica tiene numerosas aplicaciones y ha sido ampliamente utilizada para estudiar la migración neuronal, división de células madre, conectividad neuronal, y otros sujetos8,9,11,12.
El manuscrito actual describe el uso de una variante de electroporación in utero, llamado double in utero electroporation, para analizar las interacciones de las células en la corteza cerebral con diferentes orígenes temporales y espaciales. Estos estudios son extremadamente complejos de completar al emplear modelos murinos porque requieren el uso combinado de varias líneas transgénicas. Algunas de las aplicaciones del protocolo descrito en este documento incluyen el estudio de interacciones cercanas entre las células vecinas, así como las interacciones entre células distantes a través de proyecciones de largo alcance. El método requiere realizar dos cirugías independientes en electroporación del útero, separadas temporal y espacialmente, en los mismos embriones para dirigirse a diferentes poblaciones celulares de interés. La ventaja de este enfoque es la posibilidad de manipular la función génica en uno o ambos tipos de neuronas que utilizan animales de tipo salvaje. Además, estos experimentos funcionales se pueden combinar con la expresión de proteínas fluorescentes citoplasmáticas o etiquetadas por membrana para visualizar la morfología fina de las células objetivo, incluidas las dendritas y los axones, y analizar posibles diferencias en las interacciones celulares en comparación con un control (es decir, células etiquetadas únicamente con la proteína fluorescente).
El protocolo delineado aquí se centra en el estudio de las interacciones celulares dentro del neocortex, pero esta estrategia también podría utilizarse para examinar las interacciones con áreas extracorticales que se pueden apuntar utilizando la electroporación del útero, como el subpallium o el thalamus13,,14,o interacciones célula-célula en otras estructuras, como el cerlumín15. La focalización de diferentes áreas se basa en la orientación de los electrodos y en el ventrículo donde se inyecta el ADN (lateral, tercero o cuarto). Con la estrategia descrita aquí, podemos etiquetar un número sustancial de celdas, lo que es útil para evaluar los cambios generales en la conectividad/inervación en experimentos funcionales. Sin embargo, para estudiar los cambios finos en la conectividad, se pueden utilizar versiones modificadas de la electroporación en el útero para obtener el etiquetado más escaso e identificar celdas individuales16. En resumen, la electroporación doble en el útero es un método versátil que permite apuntar temporal y espacialmente a las poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente y estudiar sus interacciones en detalle, ya sea en condiciones de control o combinadas con experimentos funcionales, reduciendo considerablemente los costos temporales y económicos.

<table><tbody><tr><td>Ampicilina sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tubo aspirador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Hemostático mezclador para bebés (perfusión)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato</td><td>WPI</td><td>1B100-6</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (BUPREX 0,3 mg/ml)</td><td>Rb Pharmaceuticals Limited</td><td></td><td></td>921425</tr><tr><td>plásmido CAG-BFP</td><td>Amablemente proporcionado por U.M&uuml; plásmido ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-EGFP</td><td>Amablemente proporcionado por U.M&uuml; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mPlásmido de cereza</td><td>Amablemente proporcionado por U.M&uuml; llü Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP plásmido</td><td>Amablemente proporcionado por U.M&uuml; ller Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de algodón</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>B. Braun Surgical 1050044</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visor de disección</td><td>Zeiss</td><td>stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzas #5 Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Square Electroporador de ondas</td><td>BTX</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Maquinilla de afeitar eléctrica</td><td>Oster</td><td>76998</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TE sin endotoxinas</td><td>QIAGEN</td><td>1018499</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas de etanol</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Graefe Extra Finas</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para los ojos</td><td>Alcon</td><td>682542.6</td><td></td></tr><tr><td>Tinte verde rápido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14069-09</td><td></td></tr><tr><td>LEDs de fluorescencia</td><td>CoolLED</td><td>pE-300-W</td><td></td></tr><tr><td>Genopure Plasmid Maxi Kit</td><td></td> Roche <td>3143422001</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostáticos (sutura)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>UFESA</td><td>AL5514</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia invertida</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas de yodo</td><td>Lorsoul</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isofluorano</td><td>Caudalímetro</td><td>A15B5001</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Karizoo</td><td>586259</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Anastemine)</td><td>Fatro Ib&eacute; rica SL</td><td>583889-2</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas de precisión Kimtech</td><td>Kimberly-Clark</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Agar GEN</td><td>Labkem</td><td>AGLB-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) caldo GEN</td><td>Labkem</td><td>LBBR-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidina (Sedante)</td><td>Dechra</td><td>573749.2</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos para microscopio</td><td>Menel-Gl&auml; ser</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio</td><td>Labbox</td><td>SLIB-F10-050</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Microscopía electrónica Ciencias 17984-25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas Mutiwell (24)</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32024</td><td></td></tr><tr><td>Placas Mutiwell (48)</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (para solución salina)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 25 g (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora orbital S150</td><td>Stuart Scientific</td><td>5133</td><td></td></tr><tr><td>P Selecta Incubadora</td><td>J. P. Selecta, s.a.</td><td></td><td></td>0485472</tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusión peristáltica</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de platino, 5 mm de diámetro</td><td>Btx</td><td>45-0489</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cierre de piel Reflex - Clips de 7 mm, caja de 100</td><td>AgnThos</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cierre cutáneo Reflex - Aplicador de clip, 7 mm</td><td>AgnThos</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de anillo</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>122712-1608</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla absorbente quirúrgica (estéril)</td><td>HK Sutura</td><td>quirúrgica PD-M</td><td></td></tr><tr><td>(Surgicryl PGA 6-0)Materiales de</td> <td>sutura SMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa BYD11071512 1ml (BD plastipak)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas verticales</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

En la electroporación del útero es una técnica de transferencia de ADN in vivo ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la corticogénesis de los mamíferos. Este procedimiento aprovecha los ventrículos cerebrales para permitir la introducción del ADN de interés y utiliza un par de electrodos para dirigir la entrada del material genético hacia las células que recubren el ventrículo, las células madre neurales. Este método permite a los investigadores etiquetar las células deseadas y/o manipular la expresión de genes de interés en esas células. Tiene múltiples aplicaciones, incluyendo ensayos dirigidos a la migración neuronal, rastreo de linaje y búsqueda de rutas axonales. Una característica importante de este método es su control temporal y regional, permitiendo la elusión de posibles problemas relacionados con la letalidad embrionaria o la falta de ratones conductores de CRE específicos. Otro aspecto relevante de esta técnica es que ayuda a reducir considerablemente las limitaciones económicas y temporales que implican la generación de nuevas líneas de ratón, que se vuelven particularmente importantes en el estudio de las interacciones entre los tipos celulares que se originan en áreas distantes del cerebro a diferentes edades de desarrollo. Aquí describimos una estrategia de electroporación doble que permite la focalización de poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Con este enfoque podemos etiquetar diferentes subtipos de células en diferentes ubicaciones con proteínas fluorescentes seleccionadas para visualizarlas, y/o podemos manipular genes de interés expresados por estas diferentes células en los momentos adecuados. Esta estrategia mejora el potencial de la electroporación del útero y proporciona una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento de las poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente que migran para establecer contactos cercanos, así como las interacciones de largo alcance a través de proyecciones axonales, reduciendo los costos temporales y económicos.

Las interacciones entre las células vecinas se originaron en lugares distales y en diferentes momentos: células De cajal-retzius (células CR) y neuronas de proyección cortical migratorias tempranas (estrategia A)
La interacción de las células CR y las neuronas de proyección cortical temprana se describió previamente como necesaria para regular la translocación somal a través de moléculas de adhesión a nectina y cadherina utilizando una estrategia de doble electroporación<sup c...

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

La electroporación doble en el útero es un método potente para estudiar los aspectos importantes de la corticogénesis de los mamíferos, como la interacción entre las células de las neuronas, generada en diferentes lugares y edades de desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de examinar las interacciones no perturbadas entre estas diferentes poblaciones celulares de una manera rápida, detallada y económica. Una implicación sorprendente de nuestro método es que facilita una mejor comprensión de lo similar que se altera nuestro cableado en trastornos neuronales como el autismo y la esquizofrenia.Este estudio no se limita al neocórtex, pero también se puede emplear para analizar las interacciones de células a células, en áreas excorticos como el sepalium o el cerebelo. Uno de los pasos más desafiantes es la inyección de ADN en los ventrículos laterales de los embriones tempranos. El uso de una fuente de luz brillante es esencial para inyecciones exitosas.Para cada cirugía primero preparar una solución de 10 microlitros que contenga un microlitro de tinte verde rápido, una solución de ADN de plásmido de un microgramo por microlitros de interés para cada plásmido,

double-utero-electroporation-to-target-temporally-spatially-separated

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de ratón E15

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

Este video demuestra la entrega de ADN plasmídico en células neuronales cerebelosas de embriones murinos utilizando electroporación en el útero. Este método es útil para comprender la función in vivo de los genes en el desarrollo normal del cerebro y los cambios en la expresión génica de las células neuronales durante la progresión tumoral.

Entrega de genes basada en electroporación en el útero: una técnica para inyectar ADN plasmídico en células cerebelosas embrionarias de embriones murinos

Este procedimiento muestra cómo dirigirse a las interneuronas en el prosencéfalo del ratón en desarrollo mediante electroporación en el útero. Esta técnica fue particularmente eficiente para lograr la expresión génica selectiva en subtipos de interneuronas destinadas a las capas superficiales de la corteza.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

Demostramos un método para injertar células cultivadas en sitios definidos de embriones tempranos de ratón para determinar su potencial in vivo. También introducimos un método de electroporación optimizado que utiliza capilares de vidrio de diámetro conocido, lo que permite la entrega precisa de ADN exógeno a unas pocas células en los embriones.

Los métodos para la transferencia Precisamente localizada de células o ADN en Early postimplantación embriones de ratón

Este protocolo describe en detalle cómo transfectar específicamente diferentes regiones en el sistema nervioso central C57BL/6 a través de la electroporación en el útero. En este protocolo se incluyen instrucciones detalladas para las transfecciones de regiones que se desarrollan en la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el núcleo septal lateral y el cuerpo estriado.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

Aquí se presenta un protocolo para realizar la manipulación genética en el cerebro de hurón embrionario utilizando en la electroporación del útero. Este método permite la focalización de células progenitoras neuronales en el neocórtex in vivo.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Aprende la doble electroporación in utero para estudiar interacciones neuronales en corticogénesis mamífera usando embriones de ratón. Este método permite visualizar poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

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