Cuantificación de partículas similares al virus del norovirus humanos que se unen a bacterias comensales mediante citometría de flujo

El objetivo de este protocolo es cuantificar la unión del norovirus humano del patógeno eucariota a las bacterias. Después de realizar un ensayo inicial de apego a la bacteria del virus, la citometría de flujo se utiliza para detectar bacterias ligadas viralmente dentro de la población.

Las interacciones virus-bacterianas pueden ser importantes para una infección viral exitosa y la estimulación de una respuesta inmunitaria del huésped. Pero actualmente, las existencias altamente concentradas y purificadas de norovirus humano no se pueden producir en el laboratorio. Esta técnica se puede utilizar con cualquier virus que se une a las bacterias, para los cuales hay partículas similares a virus o virus vivos.

Nos permite cuantificar las interacciones entre estos virus y bacterias. Inocular cinco mililitros de medio líquido con una sola colonia aislada de Enterobacter cloacae de una placa de agar directamente de un caldo de glicerol congelado. Crecer las bacterias de la noche a la mañana.

Al día siguiente, transfiera 1,3 mililitros alícuotas del cultivo a dos tubos separados de centrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante cinco minutos. Retire los sobrenadantes y, a continuación, lave las muestras dos veces con un mililitro de 1 PBS estéril para cada lavado.

Centrifugar las muestras de nuevo a 10.000 x g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 1,3 mililitros de 1X PBS estéril. A partir de 0,5 mililitros de cultivo lavado, diluir en serie las bacterias en 1X PBS de 10 a menos uno a 10 a menos cuatro.

Usando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica del cultivo lavado sin diluir y cada una de las cuatro diluciones a 600 nanómetros. Realice diluciones seriales de 10 veces en 1X PBS para cada una de las diluciones anteriores. Esparza 100 microlitros de las últimas tres diluciones para cada serie en placas de agar para determinar el número de unidades formadoras de colonias por mililitro para cada muestra.

Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente durante cinco minutos. Invierta las placas e incubarlas en la incubadora. Después de preparar los reactivos, anticuerpos y bacterias como se describe en el manuscrito, ensamble todos los materiales en un gabinete de bioseguridad BSL-2.

Las partículas similares a virus para el norovirus humano se enumeran como patógenos BSL-2 y todo el trabajo realizado con VLP debe llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad certificado. Añadir 10 microgramos de VLFP de norovirus humanos a cada tubo de bacterias y mezclar a fondo por pipeteo. Incubar los tubos durante una hora a 37 grados Celsius con rotación constante.

Después de la incubación, centrifugar los tubos a 10.000 x g durante cinco minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano en un mililitro de PBS. Después de repetir los pasos de lavado una vez, centrifugar los tubos de nuevo a 10.000 X g durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet de bacterias VLP en 150 microlitros de 5% tampón de bloqueo. Un error común que ocurre es que los tubos se intercambian y se agrega el tratamiento incorrecto. Para evitarlo, organizar todos los tubos en líneas que correspondan al tratamiento correcto y añadir un tratamiento a la vez a los tubos.

Para cada muestra bacteriana, prepare 50 microlitros de anticuerpos iGE de norovirus humano diluido. Usando un tampón de bloqueo del 5%, diluya el anticuerpo del uno al 125 para las muestras de E.cloacae. Preparar 50 microlitros de anticuerpos isotipos diluidos para cada muestra bacteriana utilizando las mismas proporciones de dilución.

Divida cada muestra de ensayo de unión en alícuotas de 350 microlitros transfiriéndolas a tubos limpios de centrífuga de 1,5 mililitros. Para crear controles no manchados, añada 50 microlitros de tampón de bloqueo a la primera alícuota de cada muestra bacteriana. Para las muestras manchadas, añada 50 microlitros de la dilución de anticuerpos INDICE al segundo conjunto de alícuotas.

Cree los controles isotipos añadiendo 50 microlitros del anticuerpo isotipo diluido al tercer conjunto de alícuotas. Incubar todas las muestras sobre hielo y en la oscuridad durante 30 minutos. Luego centrifuga todas las muestras a 10.000 X g durante cinco minutos.

Desechar los sobrenadantes y resuspender cada muestra en 150 microlitros de FCSB. Una vez más, centrifugar todas las muestras a 10.000 X g durante cinco minutos. Una vez más, desechar los sobrenadantes y resuspender las muestras en 100 microlitros de FCSB.

Después de centrifugar las muestras una última vez y descartar los sobrenadantes, resuspender las muestras en 150 microlitros de FCSB. Transfiera cada muestra a un tubo que contenga 400 microlitros de FCSB para un volumen total de 550 microlitros. Almacene las muestras en 4 grados Celsius hasta que sean analizadas por citometría de flujo.

La fijación de VLP se midió utilizando citometría de flujo. En primer lugar, se utilizaron parcelas de densidad para eliminar los desechos celulares, seguidos de la posterior parcela de puntos para eliminar dobletes bacterianos y grumos celulares. Los histogramas representativos demuestran la falta de señal de PE en muestras bacterianas solamente y un cambio en la intensidad de la señal de PE en las muestras VLP:bacterium en comparación con los controles no manchados e isotipos.

Después de una hora de incubación con 10 microgramos de VLP, la citometría de flujo detectó la unión de partículas a E.colacae y L.gasseri. Para determinar el límite de cuantificación vinculante para este ensayo, se generó una serie de dilución de los VMP antes de agregar a las bacterias. Las reducciones en la cantidad de VLP resultaron en reducciones correspondientes al porcentaje de bacterias unidas por VLP.

Conocer la relación virus:bacterium y mantener la relación consistente entre los experimentos es importante para interpretar los resultados. Se pueden generar mutantes bacterianos y virales para determinar específicamente las estructuras de superficie microbiana que median esta interacción. Esta técnica permite a los investigadores responder preguntas sobre circunstancias y condiciones que afectan las interacciones norovirus-bacterianas, incluyendo cómo los cambios en el genotipo del virus, las condiciones de crecimiento bacteriano y los cambios en las estructuras superficiales bacterianas alteran la unión viral.