Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

El protocolo que presentamos aquí nos será útil para entender cómo los linfocitos están involucrados en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del sistema nervioso central. Con este método, los linfocitos en el cerebro se pueden estudiar en una célula por base celular. Este protocolo también se puede aplicar a otros modelos y enfermedades del sistema nervioso central que necesitaban analizar las características y funciones de las células inmunitarias.

En este video, el protocolo puede demostrar fácilmente cómo inducir el modelo y aislar células individuales en el cerebro. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, utilice una jeringa de un mililitro para inyectar por vía subcutánea a ratones C57BL/6 anestesiados con 100 microgramos de MOG emulsionado 35-55 en 100 microlitros del adyuvante completo de Freund en dos sitios diferentes de la espalda cerca del cuello. El mismo día y el día dos después de la inmunización, inyectar por vía intraperitoneal a los ratones 200 microlitros de un nanogramos por solución de trabajo de toxina microlitrolitro por microlitro.

Después de la segunda inyección, transfiera los ratones de vuelta a su jaula de origen con una almohadilla de calentamiento y monitoreo hasta la recumbencia completa. Al día siguiente y a lo largo del curso de la enfermedad, examinar y calificar a todos los ratones de una manera cegada para los signos neurológicos descritos en la tabla y para cualquier cambio en el peso. En el punto final experimental apropiado, corte el cráneo cuidadosamente de la nariz al cuello y transfiera el cerebro de cada animal de la caja craneal a tubos individuales de 50 mililitros que contengan 10 mililitros de medio RPMI.

Mezclar bien los tubos para eliminar los glóbulos rojos adherentes y eliminar el medio por aspiración. Añadir 10 mililitros de medio fresco a cada tubo y transferir los cerebros en platos individuales de 100 milímetros. Finalmente corta cada cerebro con una maquinilla de afeitar y usa una pipeta de plástico para transferir tanto tejido de un plato a la vez y seis mililitros de medio en un homogeneizador de vidrio centrado en siete mililitros.

Moler el cerebro usando el émbolo suelto del pestillo antes de usar el émbolo apretado para llevar el tejido hasta que la suspensión sea homogénea. Luego, vierta la suspensión de tejido resultante en un tubo cónico pre-enfriado de 15 mililitros sobre hielo. Cuando todas las muestras hayan sido homogeneizadas, ajuste el volumen en cada tubo a siete mililitros con medio fresco, antes de agregar cada suspensión de tejido a un nuevo tubo refrigerado de 15 mililitros que contiene tres mililitros de matriz de membrana 100% sótano por tubo.

Mezclar por inversión unas cuantas veces y utilizar una pipeta de tres mililitros para agregar cuidadosamente y lentamente un mililitro de solución de gradiente de densidad del 70 por ciento debajo de cada muestra de solución de tejido. Separe las células por centrifugación de gradiente de densidad y elimine casi toda la capa superior, teniendo cuidado de eliminar por completo toda la mielina. Transfiera la interfaz a un nuevo tubo de 15 mililitros y ajuste el volumen a 10 mililitros con medio fresco.

A continuación, centrifugar las muestras de nuevo y retirar el sobrenadante antes de resuspendir los pellets en aproximadamente 100 microlitros de medio por tubo. Para el análisis citométrico de flujo de las células cerebrales cosechadas, asigne aproximadamente dos veces 10 a las seis células en 100 microlitros de medio en pozos individuales de una placa de 96 pozos. Cuando todas las células hayan sido chapadas, agregue 100 microlitros de cóctel de estimulación celular 500X más inhibidores de transporte de proteínas a los pozos y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas.

Al final de la incubación se agrupan las células en la parte inferior de los pozos por centrifugación y resuspend los pellets en 100 microlitros de amortiguación de citometría de flujo por pozo. Pre-incubar las células con tres microlitros de Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block durante 10 minutos a cuatro grados Celsius antes de la tinción. Para bloquear cualquier interacción mediada por Fc no específica.

Al final de la incubación, añadir el cóctel de anticuerpos de interés a cada pozo y colocar la placa a cuatro grados Celsius protegido de la luz. Después de 30 minutos, lavar los pozos con 100 microlitros de citometría de flujo tampón por pozo y sedimentar las células por centrifugación. Después de desechar los sobrenadantes, agregue 200 microlitros de tampón de fijación intracelular a cada pozo.

Después de una incubación de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, recoja las muestras por centrifugación y resusppend los pellets en 200 microlitros de 1X tampón de permeabilidad por pozo. Centrifugar las muestras de nuevo, y después de desechar el sobrenadante, resuspender los pellets en 100 microlitros con tamplia de permeabilización fresca. A continuación, añadir los anticuerpos adecuados para la detección de cualquier antígeno intracelular de interés durante una incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados, protegidos de la luz.

Al final de la incubación, añadir 100 microlitros de 1X tamplización tampinación a cada pocótela y girar las muestras por centrifugación. Luego, resuspender las células de la mancha en 200 microlitros de tampón de tinción de citometría de flujo y analizar las células por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar. Un curso clínico típico de EAE debe resultar en una curva de la enfermedad y cambio en el peso corporal como se ilustra.

Los ratones C57BL/6 inmunizados con MOG 35-55 generalmente comienzan a desarrollar síntomas de la enfermedad alrededor del día 10 a 12 y alcanzan el pico de la enfermedad alrededor del día 15 a 21. Antes de la aparición de la enfermedad, el peso corporal de los ratones inmunizados aumenta gradualmente antes de disminuir en correlación con el aumento de los síntomas de la enfermedad Los ratones demuestran el peso corporal más bajo en el pico de EAE, con pesos corporales recuperándose ligeramente a medida que disminuyen los síntomas clínicos. Sin embargo, los ratones generalmente no se recuperan completamente y, por lo general, desarrollan una patología monofásica de la enfermedad crónica.

Como ilustra este análisis de flujo representativo, las células Th1 y TH17 productoras de interferón gamma se incrementan significativamente en ratones EAE. El paso más importante es 3.10. El operador debe transferir la capa media y la luz, siendo cuidadosamente, tomar el menor número de otras capas como sea posible.

Siguiendo este protocolo, podemos seguir los linfocitos T para un análisis de transcripción adicional para estudiar