Name: Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende inmunostaining de montaje completo de testículos de Drosophila melanogaster para microscopía confocal 3D. Este protocolo optimizado mejora la penetración de anticuerpos y permite cuantificar colocalización de proteínas en espermatocitos grandes.

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Agradecemos a P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura por los anticuerpos y A. Debec, los centros de stock de Bloomington y Viena para las moscas. Gracias a C. Jackson por sus sugerencias y discusiones estimulantes.

1. Colección de testículos de Drosophila
NOTA: Los varones jovenes (0-15 h poste-eclosion) son necesarios para examinar las células de germen diploides (es decir, espermatogonia y spermatocytes).
<ol><li>Seleccione las moscas jóvenes tanto como sea posible para minimizar la interferencia del desarrollo de espezátidas.</li>
	<li>Anestesiar a las moscas por breve exposición al dióxido de carbono y transferir a una almohadilla de mosca14,15.</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección (aumento de 10x), use fórceps para extraer la cabeza.</li>
	<li>Transfiera de 5 a 10 moscas decapitadas a 100 μL del tampón de Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inhibidor completo de proteínas, pH 6.8) en un portaobjetos de vidrio recubierto de silicona sobre un soporte de fondo negro.</li>
	<li>Con el microscopio de disección con un aumento de 40x, use un par de pórceps número 5 para sostener una mosca entre el tórax y el abdomen y, con otros tórceps, aleje el abdomen del tórax. Aísle rápidamente los testículos y los tejidos adyacentes de la canal de la mosca15 y colóquelos en una nueva gota del tampón de Ringer en el mismo portaobjetos.</li>
	<li>Una vez que todos los testículos estén listos, limpie los testículos de los tejidos restantes (glándula accesoria y genitales externos).</li>
	<li>Elimine el exceso de búfer de la gota que contiene los testículos disecados. Por lo general, utilice una pipeta p200 con una punta de 10 μL instalada encima de una punta de 200 μL. Esto permite la eliminación del exceso de líquido a través de una pequeña abertura. Coloque una gota de fijador de paraformadehído al 4% en la parte superior de la gota que contiene los testículos disecados, y luego transfiera rápidamente los testículos a un tubo que contenga una solución fijadora fresca.</li>
</ol>2. Fijación de paraformadehído
<ol><li>Preparar 2 mL de solución fijadora justo antes de su uso: 600 μL de paraformadehído al 4% diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 30 μL de NP40 al 20% más 1200 μL de heptano en un tubo de microcentrífuga siliconado de 2 mL. Utilizar paraformadehído al 4% en PBS preparado en alícuotas de 600 μL y almacenado a -20°C. Precaución: El heptano y el paraformaldehído son tóxicos y deben manipularse en una campana extractora de humos. Disponer de ellos de acuerdo con las regulaciones del instituto anfitrión.</li>
	<li>Transfiera los testículos usando una micropipeta p200 con una punta de apertura amplia a la solución PFA/NP40/heptano. Agite el tubo hacia arriba y hacia abajo durante 30 s a mano. Continuar fijando los testículos en una batidora rotativa a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Detenga la mezcladora rotativa y coloque el tubo en un estante de tubos para permitir la separación de fases y para que los testículos se asienten en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Retire todo el heptano y la solución fijadora y enjuague los testículos rápidamente tres veces con 1x PBS.</li>
	<li>Transferir a un tubo individual limpio de 200 μL. Realizar todas las incubaciones en estos pequeños tubos para minimizar las cantidades de anticuerpos empleadas.</li>
	<li>Retire el exceso de tampón utilizando una micropipeta de 200 μL con una punta P200 y una P10 conectadas. Tenga cuidado de no aspirar testículos.</li>
	<li>Mantenga los testículos en 1x PBS sobre hielo hasta que todas las muestras estén listas.</li>
</ol>3. Tinción de anticuerpos en solución
<ol><li>Deseche el PBS y deje los testículos en PBS-T al 0,3% durante 30 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares.</li>
	<li>Pre-incubar en el mismo almacenador intermediario más el suero normal de la cabra del 5% (NGS) para 1 h.</li>
	<li>Añadir 200 μL del anticuerpo primario diluido en PBS-T al 0,3% más NGS al 5%(Tabla de Materiales).</li>
	<li>Incubar el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C (o temperatura ambiente) con agitación suave en un balancín.</li>
	<li>Lavar 3 veces en PBS-T al 0,3% durante 15 min en un balancín a temperatura ambiente. Permita que los testículos se asienten en la parte inferior del tubo por gravedad.</li>
	<li>Añadir 200 μL de anticuerpo secundario diluido 1:500 de la serie conjugada DyLight.</li>
	<li>Incubar el anticuerpo secundario en una cámara oscura durante 4 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar en PBS-T al 0,3% durante 15 min en un balancín a temperatura ambiente. Después repetir con PBS-T al 0,2% y AL 0,1% PBS-T, cada vez durante 30 min en un balancín a temperatura ambiente. Haga un lavado final en 1x PBS durante 30 min para eliminar el detergente.</li>
	<li>Añadir 180 μL de solución DAPI a 1 μg/mL en 1x PBS durante 15 min. La solución común es de 10 mg/mL enH2O. Evite hacer una solución común en PBS, que puede reducir la señal de tinción dapi en la cromatina difusa en espermatocitos más grandes.</li>
	<li>Lavar 3x durante 5 min cada uno.</li>
	<li>Utilice una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos limpio.</li>
	<li>Aspirar los testículos y ponerlos en la diapositiva. Pre-enjuague de la punta de apertura amplia con 0.1% PBS-T evita que los testículos se peguen a la punta. Elimine el exceso de PBS.</li>
	<li>Añadir una gota (aproximadamente 100 μL) de Citifluor AF1.</li>
	<li>Coloque suavemente una cubierta de vidrio sobre el tejido, teniendo cuidado de evitar atrapar burbujas de aire.</li>
	<li>Selle la cubierta a la diapositiva con esmalte de uñas transparente.</li>
	<li>Observe los portaobjetos en un microscopio.</li>
</ol>4. Análisis de colocalización
<ol><li>Adquirir imágenes confocales. Se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM 710 (aceite apocromático 63x Plan) con una resolución z de 0,5 o 1 μm.</li>
	<li>Seleccione diferentes células de testículos independientes.</li>
	<li>Importe imágenes al software de procesamiento (por ejemplo, Imaris).</li>
	<li>Defina el núcleo por segmentación manual para excluir los núcleos vecinos. Utilice el software Coloc; recoge los coeficientes de correlación de Pearson (PCCs) dentro de todo el volumen entre 2 fluoróforos.</li>
</ol>

<ol><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li>
<li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).</li>
<li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li>
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<li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li>
<li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAD1%3A+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).</li>
<li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li>
<li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).</li>
<li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li>
<li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li>
<li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).</li>
<li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup154%2C+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li>
<li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li>
<li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue%2C+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Immunostaining+of+Drosophila+testes%22">Immunostaining of Drosophila testes</a>. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%22">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes</a>. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li>
<li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li>
<li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona un método para el immunolabeling acertado de los testículos adultos de Drosophila del entero-montaje. Como se informó en otros procedimientos, se deben usar machos jóvenes (incluso se acortó la edad a menos de 20 horas después de la eclosión) para minimizar la presencia de espermatozoides en desarrollo, lo que corre el riesgo de obstruir los espermatocitos. La disección debe ser rápida y la dilución de anticuerpos debe ajustarse para optimizar la relación señal/ruido21,<...

Los testículos de Drosophila son un modelo valioso para el estudio de la arquitectura nuclear. En las células espermatogoniales mitóticas, el volumen nuclear está ocupado en gran medida por la cromatina. Estas células se someten a cuatro rondas de división, produciendo un quiste de 16 espermatocitos primarios. Durante los próximos días, los espermatocitos pasan por 6 etapas de desarrollo (S1-S6), aumentando en gran medida en volumen, aproximadamente 20 veces1,2. También cambian su morfología nuclear. El contorno del núcleo, revelado por la lamina Dm0, se vuelve irregular y muestra profundas invaginaciones1,3. Esto se acompaña de extensos cambios en la expresión génica y modificaciones en la organización de la cromatina1,4,5,6,7. Los cromosomas interfase están bien definidos en la etapa S4-S5, formando tres masas distintas correspondientes a los 2 autosomas bivalentes principales y el par X-Y acoplado con el nucleolo.
Mad1 fue aislado originalmente como un componente clave del punto de control mitótico (revisado en8). En interfase, se describe como situado principalmente en la envoltura nuclear, sino también en el nucleoplasma9,10,11. En el testículo de Drosophila, divulgamos que Mad1 es prominente en el nucleoplasma, asociado íntimo a las dos masas de cromatina de un autosoma principales y en un grado inferior a la cromatina XY. Definimos esta estructura asociada a la cromatina como MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Otras cuatro proteínas se asociaron con MINTs en espermatocitos: la nucleoporina Mtor/Tpr, la SUMO peptidasa Ulp1, la proteína de punto de control mitótico Mad2 y una subunidad de un complejo similar a Polycomb Raf212.
Para terminar la descripción de MINTs, necesitábamos utilizar los anticuerpos y nos enfrentamos con los problemas técnicos encontrados generalmente con immunostaining en testículo: una permeabilidad pobre dando por resultado una no uniformidad significativa de la coloración en la profundidad del testículo, particularmente en los spermatocytes grandes. Slas preparaciones anuladas aumentaron el acceso a los anticuerpos, pero llevaron a imágenes comprimidas, restringiendo los análisis 3D y previniendo la medición de la fluorescencia cuantitativa, incluida la colocalización. El problema de la penetración de anticuerpos también podría abordarse mediante agentes permeabilizantes como el desoxicolato de Na al0,3%,pero este procedimiento no arrojó resultados reproducibles en nuestras manos. Debido a que realizamos muchos experimentos de co-etiquetado, buscamos mejorar el protocolo de permeabilización. La combinación de NP40 del 1% más heptano dio lugar a más reproducibilidad, particularmente en el estudio de los spermatocytes grandes.
Este protocolo realiza la fijación e inmunotensión de los testículos en suspensión, mejorando la calidad de la muestra, así como mejorando la reproducibilidad, y haciéndola adecuada para la microscopía confocal. Utilizamos el protocolo para definir mejor las relaciones espaciales de ciertas proteínas nucleares de la envoltura con las estructuras nucleoplásmicas de espermiocitos grandes. Este método permitirá mejores investigaciones de los cambios que acompañan el desarrollo de los espermatozoides, por ejemplo, los cambios estructurales dinámicos del núcleo, incluyendo la cromatina, el nucleoplasma y los poros nucleares.

<table><tbody><tr><td>Drosophila srains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>Regalo de A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, París, Francia)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 15 de mayo de 2011; 124(Pt 10):1664-71.</td></tr><tr><td>Mtor RNAi&nbsp;</td><td>ID de VDRC</td><td>110218</td><td>Centro de ARNi de Drosophila de Viena</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>La</td> solución madre Thermo <td>D1306</td><td>debe prepararse en H2O</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fine Forseps&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBP Puntas de pipeta de diámetro ancho</td><td>Fisherbrand</td><td>11917744</td><td>Punta de gran apertura</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; 0,2 mL Tubo individual</td><td>Thermo</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2 ml&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA&nbsp;</td><td>Tubo siliconado de 2 ml</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal (NGS)</td><td>Sigma</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 4%</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G&nbsp;</td><td>Paraformaldehído (4%) disuelto en PBS 1X&nbsp;; alícuota en 600 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>14190094</td><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td></tr><tr><td>0,1% (0,2 o 0,3%) PBS-T&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS 1X&nbsp; que contiene 0,1% (0,2 % o 0,3%) Triton X-100</td></tr><tr><td>Triton X-100, para biología molecular,&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td><Anticuerpos fuertes> </refuerzo ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>fuerte Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Ratón anti-Mtor</td><td></td><td></td><td>1/40 regalo de J. Johansen, Universidad Estatal de Iowa</td></tr><tr><td>Rata anti-Nup62</td><td></td><td></td><td>1/200 regalo de H. Ohkura (Universidad de Edimburgo, Reino Unido</td></tr><tr><td>Conejillo de indias anti-Ulp1</td><td></td><td></td><td>Regalo 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidad Erasmus, Róterdam</td></tr><tr><td>Conejo anti-Raf2</td><td></td><td></td><td>Regalo 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidad Erasmus, Róterdam</td></tr><tr><td>Serie conjugada DyLight&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>1/500 Burro anti-(cobaya, ratón, conejo o rata) como segundos anticuerpos</td></tr></tbody></table>

inmunostaining de todo el monte drosophila testículos para el análisis confocal 3d de los espermatocitos grandes

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Los testículos de Drosophila son un poderoso sistema modelo para estudiar procesos biológicos, incluida la biología de células madre, la arquitectura nuclear, la meiosis y el desarrollo de espermatozoides. Sin embargo, el immunolabeling del testículo entero de Drosophila se asocia a menudo a la no uniformidad significativa de la coloración debido a la penetración del anticuerpo. Las preparaciones aplastadas solo superan parcialmente el problema, ya que disminuye la calidad 3D de los análisis. Adjunto, describimos un protocolo del entero-montaje usando NP40 y heptano durante la fijación junto con immunolabeling en medios líquidos. Conserva el volumen adecuado para la microscopía confocal junto con un etiquetado reproducible y fiable. Mostramos diferentes ejemplos de reconstitución 3D de los núcleos de espermatocitos de secciones confocales. La reproducibilidad intra e inter-testículo permite la cuantificación 3D y la comparación de la fluorescencia entre células individuales de diferentes genotipos. Se utilizaron diferentes componentes de la estructura intranuclear MINT (Mad1-que contiene intra territorio nuclear), así como dos componentes asociados con el complejo de poros nucleares para ilustrar este protocolo y sus aplicaciones en las células más grandes del testículo, los espermatocitos S4-S5.

El principal obstáculo para obtener una tinción adecuada de los testículos de Drosophila es la limitada penetrabilidad de los anticuerpos, que se ha resuelto parcialmente mediante el uso de preparaciones aplastadas pero a costa de inducir una restricción de los análisis 3D (por ejemplo, representación 3D o medida de colocalización). El procedimiento permite un etiquetado uniforme y preserva el volumen de todas las células del testículo. Aquí hemos centrado la ilustración del método en la representación 3D de los espermat...

Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.

Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

La tinción de tejidos de Drosophila en todo el monte, como muestras de testículos, suele ser problemática debido a la limitada penetración de los anticuerpos. Nuestro protocolo de fijación con NP40 y heptano permite un etiquetado uniforme y reproducible. Al mantener la forma del tejido y permitir la penetración profunda de los anticuerpos, este procedimiento facilita la adquisición reproducible y cuantificable de inmunotinción en tres dimensiones, tanto individualmente como en estudios de colocalización.Para la evaluación de células germinales diploides, de cero a 15 horas después de la eclosión, anestesiar a las moscas con una breve exposición al dióxido de carbono y transferir las moscas a una almohadilla para moscas. Coloque la almohadilla bajo un microscopio de disección con un aumento de 10X y use pinzas para extraer las cabezas de cinco a 10 moscas macho. Transfiera los cuerpos de las moscas decapitadas a 100 microlitros de tampón de Ringer en un portaobjetos de vidrio recubierto de silicona sobre un soporte de fondo negro, y use el aumento de 40X y un par de pinzas número cinco para agarrar una mosca entre el tórax y el abdomen.A continuación, separe el abdomen del tórax y aísle rápidamente los testículos y los tejidos adyacentes del cadáver de la mosca. Una vez que se hayan recogido todos los testículos, limpie las muestras de cualquier resto de tejido y utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para eliminar el exceso de tampón alrededor de los testículos disecados. A continuación, coloque una gota de paraformaldehído al 4% en los testículos y transfiera rápidamente los tejidos a un tubo que contenga dos mililitros de solución de paraformaldehído al 4% recién preparada suplementada con NP40 al 20% y heptano.Para una fijación completa de las muestras de testículos, agite el tubo verticalmente durante 30 segundos antes de incubar los testículos en un mezclador giratorio a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de la incubación, transfiera el tubo a una rejilla de tubos y deje que los testículos se asienten en el fondo del tubo. Retire todo el heptano y la solución fijadora y enjuague rápidamente los testículos tres veces con PBS.Después del último lavado, transfiera los testículos a un nuevo tubo de 200 microlitros y utilice una pipeta de 200 microlitros equipada con una punta de pipeta de 10 microlitros para eliminar el exceso de tampón. Luego agregue 200 microlitros de PBS-To fresco al tubo y coloque los testículos en hielo. Para el marcaje de anticuerpos de las muestras de testículos, reemplace el PBS con 200 microlitros de 0.3% PBS-T para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.Después de la permeabilización, bloquee cualquier unión inespecífica con 0,3 % de PBS-T más 5 % de suero de cabra normal durante una hora a temperatura ambiente antes de agregar 200 microlitros del anticuerpo primario de interés diluido en 0,3 % de PBS-T más 5 % de suero de cabra normal para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados o temperatura ambiente con balanceo. A la mañana siguiente, lave las muestras con tres lavados de 15 minutos con 0,3%PBS-T fresco y balancee a temperatura ambiente por lavado y deje que los testículos se asienten en el fondo del tubo por gravedad. Agregue 200 microlitros de un anticuerpo secundario apropiado al tubo para una incubación de cuatro horas con balanceo a temperatura ambiente protegido de la luz antes de lavar las muestras con PBS-T fresco al 0,3% por lavado, como se demuestra.Después del lavado al 0,3 % de PBS-T, lave las muestras una vez al 0,2 % de PBS-T y una vez al 0,1 % de PBS-T durante 30 minutos por lavado en el balancín, seguido de un lavado final de 30 minutos solo con PBS. Después del lavado con PBS, etiquete las muestras con 180 microlitros de una solución de DAPI de un microgramo por mililitro en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz, seguido de tres lavados de 5 minutos en PBS fresco por lavado. Después del último lavado, use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos limpio y use una punta de pipeta cebada con 0,1% PBS-T para transferir los testículos al portaobjetos.Aspire el exceso de PBS y agregue 100 microlitros de Citifluor AF1. Coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio sobre el pañuelo, teniendo cuidado de evitar atrapar burbujas de aire, y use esmalte de uñas transparente para sellar el cubreobjetos al portaobjetos antes de observar los portaobjetos mediante microscopía de fluorescencia confocal. Después de adquirir imágenes confocales de las muestras, importe las imágenes a un programa de software de análisis de imágenes adecuado.A continuación, utilice la segmentación manual para definir el núcleo dentro de cada célula y determinar los coeficientes de correlación de Pearson dentro de todo el volumen entre dos fluoróforos. Este protocolo permite la adquisición de imágenes confocales de una calidad suficiente para ser tratadas para la reconstitución 3D. Por ejemplo, en estas cuatro secciones seriadas adyacentes de un espermatocito en estadio S5, se observa un nivel bajo de Mad1 en la envoltura nuclear y se puede visualizar una acumulación de alto nivel de Mad1 junto con la tinción de DAPI dentro del núcleo.en esta imagen reconstituida en 3D, se puede observar la presencia de bajo nivel de Mad1 en la superficie nuclear y la acumulación de alto nivel de Mad1 dentro del núcleo junto con el ADN. En estas reconstituciones 3D se pueden observar espermatocitos S5 de gran tamaño teñidos con Nucleoporina 62 y Mad1 o Importina-beta y DAPI. En ambas reconstrucciones, los componentes asociados a los poros nucleares parecen estar distribuidos de manera no uniforme sobre el borde nuclear como puntos de tamaño irregular.Al tiempo que conserva el volumen 3D de las células, este protocolo también facilita una penetración uniforme de los anticuerpos de interés en la profundidad de cada célula, lo que permite análisis cuantitativos, como la colocalización. Debido a que el protocolo permite una medición confiable de las colocalizaciones de testículos independientes, también se puede utilizar para comparar la tinción en diferentes genotipos de moscas. La cantidad de NP40 utilizada es crítica para una permeabilidad suficiente.Si se sigue el procedimiento al pie de la letra, se puede lograr un etiquetado reproducible y la preservación de la estructura nuclear en 3D. Aunque la tinción de tejidos de montaje completo dentro de Drosophila puede ser complicada, este protocolo se puede adaptar fácilmente para otras muestras.

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Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

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