Name: Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprende a silenciar microARNs en plantas de papa utilizando el sistema VbMS basado en el virus X de la papa. Este método rápido permite la caracterización funcional sin necesidad de transformaciones estables.

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Agradecemos al Dr. Yule Liu de la Universidad de Tsinghua por proporcionar el vector PVX-LIC. Este trabajo fue apoyado por un fondo de puesta en marcha de Texas A&M AgriLife Research y el Proyecto Hatch TEX0-1-9675 del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA a JS.

1. Cultiva plantas de papa.
<ol><li>Propagar plantas de papa in vitro en tubos de cultivo (25 x 150 mm) con medios Murashige y Skoog (MS) más vitamina de Gamborg (mezcla de sal basal de MS, vitamina de Gamborg, sacarosa de 30 g/L, 3,5 g/L de agar, pH = 5,7). Coloque los tubos en la sala de crecimiento por debajo de 20–22 °C, fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de luz y de intensidad de luz de 120 μmol/m2∙s1. NOTA: Los nuevos brotes y raíces normalmente se desarrollan en 1-2 semanas a partir de las plantas. Propague plantas con medios vitamínicos frescos de MS / Gamborg cada mes.</li>
	<li>Cuatro semanas después, trasplante plantas in vitro al suelo y cultivarlas en un invernadero a menos de 20-22 °C, fotoperíodo claro de 16 h/8 h de luz y de intensidad de luz de 120 μmol/m2∙s1. NOTA: Las plantas con raíces y hojas recién desarrolladas son adecuadas para el trasplante. Mantenga la humedad para las plantas recién trasplantadas durante los primeros 3-4 días.</li>
</ol>2. Construir los vectores VbMS.
<ol><li>Diseñar y clonar las moléculas TM en tándem corto (STTM, Figura 1)22,53 para el miRNA de interés. NOTA: Adquiera secuencias de miRNA basadas en datos experimentales o de la base de datos miRbase54,55,56,57,58,59. La secuencia miR166 utilizada en este estudio ha sido descrita anteriormente60.<ol>
<li>Diseñe el módulo TM insertando una secuencia de desajuste, normalmente 5'-CTA-3', en la secuencia inversa del complemento de miRNA en el sitio correspondiente a los nucleótidos 10-11 del miRNA. NOTA: Por ejemplo, la secuencia Stu-miR160 es 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, donde los nucleótidos 10º-11º están en negrita. La secuencia inversa del complemento (en desoxinucleótidos) es 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' y el sitio de inserción de la protuberancia de desajuste se muestra en negrita. La secuencia de la molécula TM (desoxinucleótido) debe ser 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.</li>
		<li>Imprimaciones de diseño para clonar el fragmento STTM (Figura 1). Utilice oligonucleótidos de ADN con la secuencia espaciadora de 48-nt como plantilla para la clonación por PCR. El cebador delantero consiste en un enlazador LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), la secuencia delantera de la molécula TM diseñada anteriormente y la secuencia parcial de 5' del espaciador 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). El cebador inverso consiste en un enlazador LIC2 (5'-gAggAgAgAgCCgT-3'), la secuencia inversa del complemento de la molécula TM, y un complemento inverso parcial a la secuencia 3' del espaciador 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'). NOTA: La secuencia del espaciador de 48 NT es 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Por ejemplo, para STTM-miR160, el cebador delantero debe ser 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; el cebador inverso debe ser 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (Figura 1).</li>
		<li>Amplificar el fragmento STTM en un volumen de 50 μL mediante PCR utilizando el espaciador universal sintetizado de 48-nt como plantilla y una ADN polimerasa de alta fidelidad.<ol>
<li>Configure la reacción de PCR mezclando 0,5 μL de cada cebador (40 μM), 0,5 μL de oligo espaciador de 48 nt (40 μM), 5 μL de tampón de PCR 10x, 1 μL de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 0,1 μL de ADN polimerasa de alta fidelidad (10 U/μL) y 43 μL de ddH2O a un volumen total de 50 μL. Realice la amplificación de PCR estándar de la siguiente manera: 94 °C durante 3 min, 32 ciclos de 94 °C durante 45 s, 60 °C durante 45 s y 72 °C durante 60 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificar el fragmento STTM por precipitación de etanol. Añadir 2,5 volúmenes de etanol y 1/10 de volumen de 3 M de acetato de sodio (pH = 4,0) a los productos de PCR. Mezclar vigorosamente y centrifugar a 14.000 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y enjuague el pellet con 1 ml de etanol al 70%. Secar el pellet y disolverlo en 20 μL de ddH2O. NOTA: Utilice la electroforesis de ADN para comprobar la amplificación de los productos sttm PCR.</li>
		<li>Configure la reacción de la ADN polimerasa T4 en hielo mezclando 2,5 μL de producto purificado de PCR STTM, 0,5 μL de tampón de ADN polimerasa T4 10x, 0,05 μL de 1 M de ditiotreitol (TDT), 0,25 μL de 100 mM de dATP, 0,1 μL de ADN polimerasa T4 (3 U/μL) y 1,6 μL de ddH2O a un volumen total de 5 μL. Incubar la mezcla a 37 °C durante 15 min, y tratar los productos a 75 °C durante 20 min para inactivar la ADN polimerasa T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare la construcción de VbMS basada en PVX.<ol>
<li>Digerir 5 μg de plásmido PVX-LIC38 con 2,5 μL de SmaI (20 U/μL) en un volumen de 100 μL.</li>
		<li>Agregue un volumen igual de fenol: cloroformo: isopropanol (25: 24: 1, pH = 6.7 / 8.0) a los productos PVX-LIC digeridos y mezcle vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Agregue un volumen igual de cloroformo: isopropanol (24: 1) y vórtice vigorosamente. Centrifugadora a 14.000 x g durante 10 min. NOTA: El vector PVX-LIC alberga el casete LIC para la clonación. El casete LIC del vector PVX-LIC contiene un gen ccdB y un gen resistente al cloranfenicol y necesita ser mantenido/propagado en la cepa DB3.1 de E. coli utilizando medio LB que contiene kanamicina (50 μg/L) y cloranfenicol (15 μg/L).</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Agregue 2.5 volúmenes de etanol y 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M (pH = 4.0) y mezcle vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Enjuague el pellet con 1 ml de etanol al 70% y vórtice vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante. Seque el pellet y disuelva el plásmido PVX-LIC digerido con 100 μL de ddH2O.</li>
		<li>Configure la reacción de la ADN polimerasa T4 en hielo mezclando 2,5 μL de ADN vectorial PVX-LIC digerido, 0,5 μL de tampón de ADN polimerasa T4 10x, 0,05 μL de 1 M TDT, 0,25 μL de 100 mM dTTP y 0,1 μL de ADN polimerasa T4 (3 U/μL) en un volumen total de 5 μL. Incubar la mezcla a 37 °C durante 15 min y tratar los productos a 75 °C durante 20 min hasta 20 min inactivar la ADN polimerasa T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonar la secuencia STTM en el vector PVX-LIC utilizando una reacción LIC. Mezcle los productos de PCR STTM tratados con ADN polimerasa T4 (5 μL) y los plásmidos PVX-LIC tratados con ADN polimerasa T4 (5 μL). Incubar a 70 °C durante 5 min, enfriar a 22 °C en una rampa de 0,1 °C/s y mantener a 22 °C durante 30 min utilizando una máquina PCR. NOTA: Extender el tiempo de incubación hasta la noche a 4 °C para lograr una mayor eficiencia de la clonación LIC.</li>
	<li>Transformar 5 μL de los productos de reacción LIC en E. coli DH5α y crecer en una placa LB que contenga 50 μg/ml de kanamicina62,63. Recoger y verificar colonias positivas por PCR con los cebadores de clonación y cebador universal para el vector PVX-LIC seguido de secuenciación.<ol>
<li>Realizar PCR de colonias con el cebador delantero para PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') en combinación con el cebador inverso para clonación STTM para identificar clones positivos. El tamaño de la banda de PCR debe ser de ~ 300 pb. NOTA: Verifique las secuencias de fragmentos STTM mediante secuenciación del ciclo terminador64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislar los plásmidos PVX-STTM de los clones validados y transformarlos en cepas de Agrobacterium GV3101, GV2260 o EHA10562,63. Verificar colonias de Agrobacterium mediante PCR. NOTA: Confirme las colonias de Agrobacterium mediante PCR utilizando el cebador delantero para PVX-LIC y el cebador inverso para la clonación STTM.</li>
</ol>3. Realice el ensayo VbMS basado en PVX en plantas de papa.
<ol><li>Trasplante plantas de papa in vitro de 4 semanas de edad al suelo. Las plantas trasplantadas serán sometidas a un ensayo VbMS 3-4 días después.</li>
	<li>Inocular plantas de papa con Agrobacterium que contiene los plásmidos PVX-STTM. NOTA: Para el ensayo VbMS en papa, la infiltración mediada por Agrobacterium y la inoculación de rascado de dientes se realizan simultáneamente.<ol>
<li>Recoger e inocular transformadores positivos que contengan vectores PVX-STTM en 50 ml de LB líquido que contenga 50 μg/ml de kanamicina y 50 μg/ml de rifampicina. Crecer en una incubadora de 28 °C a 220 rpm durante 16 h hasta OD600 = 1.0.</li>
		<li>Al mismo tiempo, rayar las colonias positivas de Agrobacterium en al menos dos nuevas placas LB que contengan 50 μg/ml de kanamicina y 50 μg/ml de rifampicina y crecer a 28 °C durante 1 día. Incluye el vector PVX-LIC38,66 como control y PVX-GFP67,68 para monitorear la propagación del virus.</li>
		<li>Recoger el cultivo líquido de Agrobacterium por centrifugación a 3.400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Resuspend Agrobacterium células con un volumen igual de tampón de infiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES y 200 μM acetosyringone, pH = 5.6) y ajustar a OD600 = 1.0. Incubar a temperatura ambiente durante 6 h.</li>
		<li>Infiltrar el cultivo de Agrobacterium en el lado abaxial de las hojas completamente expandidas con una jeringa sin aguja de 1 ml.<ol>
<li>Voltee y sostenga una hoja con una mano, luego use un dedo para apoyar la lámina de la hoja desde el lado adaxial en el sitio de infiltración. Mantenga la jeringa vertical a la superficie de la hoja con la otra mano e infiltre el cultivo de Agrobacterium en el lado abaxial de la lámina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raspe el cultivo de Agrobacterium de las placas LB y rasque la superficie del tallo de los primeros uno o dos entrenudos de las plantas de papa infiltradas con un palillo de dientes. Rasca suavemente la epidermis del tallo. Evite perforar a través del tallo, que puede causar daños graves a las plantas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultive las plantas infiltradas a 22 °C con un fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de luz oscura e intensidad de luz de 120 μmol/m2∙ s1 en un invernadero. NOTA: Los fenotipos causados por el silenciamiento de miRNA generalmente aparecen en 2-4 semanas después de la perinoculación (Figura 2, Figura 3). Por lo general, el fenotipo VbMS tarda de 10 a 20 días en aparecer después de la infiltración. El fenotipo VbMS depende de las propiedades de los genes específicos de miRNA y diana, las condiciones de crecimiento y las variedades de papa.</li>
</ol>4. Realizar análisis de expresión.
<ol><li>Cuando los fenotipos aparecen a las 2-4 semanas después de la perinoculación, recolecte tejidos como brotes, hojas, flores o raíces con fenotipos de las plantas VbMS y tejidos de las plantas de control con tijeras. Aislar los ARN totales de los tejidos recolectados.</li>
	<li>Comprobar la calidad del ARN por electroforesis62,63 y cuantificar la concentración de ARN midiendo la absorbancia OD260 con un espectrofotómetro.</li>
	<li>Utilice pcrr de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) con bucle de tallo para analizar la expresión de miRNA.<ol>
<li>Para miRNAs específicos, diseñe un cebador de transcripción inversa de bucle de tallo. Los cebadores RT de bucle de tallo contienen una columna vertebral universal de 5' y una extensión de 3' 6-nt de un miRNA específico. Diseñar una columna vertebral universal de 5' (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') que forme una estructura stem-loop. (La mayúscula corresponde a una secuencia inversamente repetida y la minúscula a la región del bucle).</li>
		<li>Parte de la secuencia de backbone de 5' que forma un bucle sirve como imprimación inversa para la posterior amplificación de PCR (secuencia negrita-cursiva en la secuencia de backbone). Agregue una secuencia de extensión de 6-nt que sea complementaria inversa al extremo 3' del miRNA de interés para el cebador de bucle del tallo para proporcionar especificidad para la transcripción inversa (Figura suplementaria 1A). NOTA: Diseñar el cebador de transcripción inversa stem-loop descrito por Chen et al.69 y Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Por ejemplo, el cebador de transcripción inversa stem-loop para Stu-miR160 está diseñado como 5'-GTCTCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. El cebador de transcripción inversa stem-loop para la familia miR165/166 de patata está diseñado como 5'-GTCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAGGGGGGG(A/G)A-3'. (Las secuencias en mayúsculas en negrita proporcionan la especificidad de la transcripción inversa para miRNAs específicos).</li>
		<li>Configure la reacción de transcripción inversa mezclando 50–200 ng de ARN total, 1 μL del cebador de transcripción inversa del bucle del tallo (100 μM), 2 μL de tampón 10x, 0,2 μL de inhibidor de la RNasa (40 U/μL), 0,25 μL de dNTP (10 mM cada uno) y 1 μL de transcriptasa inversa (200 U/μL) en hielo. Añadir ddH2O libre de nucleasas a un volumen total de 20 μL.</li>
		<li>Realice la transcripción inversa utilizando el procedimiento de transcripción inversa pulsada. Incubar la mezcla de reacción de transcripción inversa a 16 °C durante 30 min, realizar un ciclo de temperatura de 30 °C durante 30 s, 42 °C durante 30 s y 50 °C durante 1 s, durante un total de 60 ciclos, e inactivar la transcriptasa inversa por incubación a 85 °C durante 5 min.</li>
		<li>Para el análisis de PCR en tiempo real de la expresión de miRNA, diseñe el cebador delantero basado en la secuencia de miRNA, pero no incluya secuencias que se superpongan con el cebador de transcripción inversa de bucle de tallo diseñado anteriormente. Agregue una extensión de 3 a 7 nt a los 5' de la imprimación delantera para optimizar la longitud, la temperatura de fusión y el contenido de GC (Figura suplementaria 1). NOTA: La imprimación inversa universal es 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Por ejemplo, el cebador de transcripción inversa stem-loop para Stu-miR160 está diseñado como 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. El cebador de transcripción inversa de asa del tallo para la familia miR165/166 es 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Las secuencias en negrita sirven como extensiones de 5' para la optimización de la imprimación. Los cebadores de transcripción inversa de bucle de vástago y los cebadores de PCR en tiempo real para miRNA se pueden diseñar utilizando la herramienta de diseño de imprimación de miRNA73.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintetizar los ADNc de los ARNm objetivo mediante PCR de transcripción inversa estándar (RT-PCR). Incubar la mezcla de reacción de transcripción inversa a 37 °C durante 60 min e inactivar la transcriptasa inversa calentando a 85 °C durante 5 min. NOTA: (1) Predecir los ARNm de destino mediante el programa psRNATarget74 si no se conocen los ARNm de destino. (2) El cebador universal de transcripción inversa para ARNm es un cebador anclado 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.</li>
	<li>Configure la reacción de PCR en tiempo real tanto para el miRNA de interés como para los ARNm objetivo. Mezcle 0,5 μL de cDNA de plantilla, 5 μL de 2x tampón de PCR en tiempo real con verde SYBR, 0,05 μL de cada imprimación hacia adelante y hacia atrás (40 μM) y 4,4 μL de ddH2O en un volumen total de 5 μL sobre hielo.</li>
	<li>Incubar a 95 °C durante 3 min, 40 ciclos de 95 °C durante 3 s y 60 °C durante 30 s. Realice un análisis posterior de la curva de fusión de la siguiente manera: Incube a 95 °C durante 15 s, enfríe a 60 °C en una rampa de 20 °C/s, manténgase a 60 °C durante 60 s, caliente a 95 °C en una rampa de 0,2 °C/s y manténgase a 95 °C durante 15 s. Analizar los valores de Ct utilizando los métodos ΔΔCt76,77 y trazar las medias con errores estándar. NOTA: (1) Los cebadores de PCR en tiempo real para los ARNm objetivo se pueden diseñar como se describe75. (2) El gen de la poliubiquitina 10 de la papa puede servir como un control interno para la normalización en la papa. El cebador delantero para el gen de la poliubiquitina 10 de la patata es 5'-ATGTTGCCTTTCTGTGTGGTTG-3' y el cebador inverso 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Para el análisis de PCR en tiempo real, la contaminación y la formación de dímeros de imprimación pueden generar resultados falsos positivos. Para monitorear la amplificación inespecífica y aumentar la responsabilidad del análisis de PCR en tiempo real, se recomienda incluir controles sin plantilla y transcriptasa inversa para ensayos de PCR en tiempo real.</li>
</ol>

Presentamos un sistema de silenciamiento de miRNA basado en PVX para caracterizar la función de los miRNAs endógenos en papa mediante la integración del diseño STTM en el vector PVX. El sistema VbMS demostró ser eficaz en el silenciamiento de miRNA165/166 en papa, una familia de miRNA altamente conservada en todas las especies de plantas.
El enfoque de MT se ha desarrollado para interferir con la expresión de miRNAs basado en un imitador artificial del objetivo de miRNA que está diseñado para ...

Los microARN de las plantas (miRNAs) se caracterizan por ser ARN reguladores de 20 a 24 nucleótidos de longitud, codificados nuclearmente1 y desempeñan un papel fundamental en casi todos los aspectos de los procesos biológicos de las plantas, incluidos el crecimiento y el desarrollo2,3, la fotosíntesis y el metabolismo4,5,6,7, la síntesis y señalización hormonal8,9, las respuestas bióticas y abióticas10, 11,12,13, y regulación de nutrientes y energía14,15. Las funciones reguladoras de los miRNAs de las plantas están bien programadas y se cumplen típicamente a niveles post-transcripcionales mediante la escisión o la represión traslacional de los ARNm objetivo.
Se han logrado enormes avances hacia la identificación, el perfil transcripcional y la predicción de objetivos de miRNAs en papa16,17,18,19,20,21. Sin embargo, la caracterización funcional de los miRNAs en plantas, incluida la papa, se ha quedado atrás de otros organismos debido a la falta de enfoques genéticos eficientes y de alto rendimiento. Es difícil realizar análisis funcionales de miRNA individual mediante análisis estándar de pérdida de función, porque la mayoría de los miRNAs pertenecen a familias con redundancia genética considerable22. Además, un solo miRNA puede controlar múltiples genes diana23 y varios miRNAs diferentes pueden modular la misma vía molecular de forma colaborativa24,25. Estas propiedades dificultan la caracterización de la función de un miRNA específico o una familia de miRNA.
Gran parte del análisis funcional de los miRNAs se ha basado en gran medida en enfoques de ganancia de función que tienen limitaciones obvias. El método de miRNA artificial (amiRNA) explota las transcripciones primarias endógenas (pri-miRNAs) para producir miRNAs a un alto nivel, lo que lleva a la inhibición de la expresión génica diana26,27,28,29. Sin embargo, el etiquetado de activación y la sobreexpresión de miRNA utilizando un fuerte promotor constitutivo de 35S a menudo conducen a una mayor expresión de miRNAs que no son representativos de condiciones in vivo y, por lo tanto, pueden no reflejar la función endógena de miRNAs30. Se ha desarrollado un enfoque alternativo que involucra la expresión de formas resistentes a miRNA de genes diana que contienen mutaciones evitables en los sitios de unión y/o escisión31,32,33. Pero este enfoque también puede causar una mala interpretación del fenotipo derivado del transgén objetivo resistente al miRNA debido a artefactos transgénicos. Por lo tanto, las conclusiones de estos estudios de ganancia de función deben extraerse con precaución34. Otra limitación importante de los enfoques descritos anteriormente es que requieren transformación, que requiere mucha mano de obra y requiere mucho tiempo. Además, los enfoques dependientes de transgenes son difícilmente aplicables para las especies de plantas transformadas-recalcitrantes. Por lo tanto, es esencial desarrollar un enfoque rápido y eficiente de pérdida de función para desentrañar la función de los miRNAs.
Para eludir el requisito previo del procedimiento de transformación, se ha establecido el silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) mediante la combinación de las estrategias de imitación objetivo (TM) con vectores derivados de virus. En el sistema VbMS, las moléculas tm diseñadas artificialmente se expresan transitoriamente desde una columna vertebral del virus, ofreciendo una herramienta potente, de alto rendimiento y ahorro de tiempo para diseccionar la función de los miRNAs endógenos de las plantas35,36. VbMS se desarrolló inicialmente en N. benthamiana y tomate con el virus del sonajero del tabaco (TRV)35,36,37 y se ha extendido a Arabidopsis, algodón, trigo y maíz utilizando varios otros sistemas de expresión de virus, incluido el virus de la papa X (PVX)38, el virus de la arruga de la hoja de algodón (ClCrV)39, el virus del mosaico del pepino (CMV)40,41,42, el virus del mosaico del trigo chino (CWMV)43 , y el virus del mosaico de la raya de cebada (BSMV)44,45.
La papa (Solanum tuberosum) es el cuarto cultivo alimentario más importante y el cultivo no aéreo más cultivado en el mundo, principalmente debido a su alto valor nutricional, alta producción de energía y requerimientos de insumos relativamente bajos46. Varias características de la papa la convierten en una atractiva planta modelo dicotiledónea. Es un cultivo poliploide propagado vegetativamente con alta tasa de cruce, heterocigosidad y diversidad genética. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ningún informe que caracterice la función de los miRNAs en papa utilizando VbMS. Aquí, presentamos un enfoque VbMS basado en VbMS basado en PVX de papa adaptado a la clonación independiente de la ligadura (LIC) para evaluar la función de los miRNAs en plantas de papa38. Seleccionamos la familia miR165/166 para ilustrar el ensayo VbMS porque la familia miR165/166 y sus ARNm objetivo y los factores de transcripción homeodominio/cremallera Leu clase III (HD-ZIP III) se han caracterizado ampliamente22,47,48. Los genes HD-ZIP III son reguladores clave del desarrollo del meristemo y la polaridad de los órganos, y la supresión de la función miR165/166 conduce a una mayor expresión de los genes HD-ZIP III, lo que resulta en defectos de desarrollo pleotrópicos como la reducción de la dominancia apical y los patrones aberrantes de polaridad de la hoja22,35,38,41 . Los fenotipos de desarrollo fácilmente puntuables correlacionados con el silenciamiento de miRNA165/166 permiten una evaluación precisa de la efectividad del ensayo VbMS basado en PVX.
En este estudio, demostramos que el sistema VbMS basado en PVX puede bloquear efectivamente la función de los miRNAs en la papa. Debido a que el sistema de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) basado en PVX se ha establecido en varias variedades de papa49,50,51,52, este enfoque VbMS basado en PVX probablemente se puede aplicar a una amplia gama de especies de papa diploide y tetraploide.

<table><tbody><tr><td>100 y micro; M dATP y 100 &micro; M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , EE. UU.</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato de sodio, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>.#S0297 <tr><td>Acetosiriringa</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, EE. UU.</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cepas de Agrobacterium tumefaciens: GV3101, GV2260 o EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EE. UU.</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, EE. UU.</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EE. UU.</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>para el mantenimiento de PVX-LIC y pTRV2e que contienen el gen ccdB</td></tr><tr><td>E. coli DH5 y alfa;</td><td></td><td></td><td>para las construcciones de destino generadas por clonación de LIC</td></tr><tr><td>Fertilizante: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, EE. UU.</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos de PCR de alta fidelidad: KAPA HiFi ADN polimerasa con dNTP</td><td>Roche Secuenciación y Ciencias de la Vida, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, EE. UU</td><td>. 7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isoamílico</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EE. UU.</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Etanol puro &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, Rey de Prusia, PA 19406 , EE. UU.</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, EE. UU.</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, EE. UU.</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa</td> <td>inversa M-MuLVNueva Inglaterra BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 EE. UU.</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de nanogotas: NanoDrop OneC Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen con Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, EE. UU.</td> Máquina de PCR <td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>: Bio-Rad Sistema de PCR MyCycler</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, EE. UU</td>. <td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, EE. UU.</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, EE. UU</td>. <td>Medidor de pH / mV de sobremesa - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), pH 6,7/8,0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, EE. UU.</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, EE. UU.</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX Vector VIGS: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Máquina de PCR en tiempo real: QuantStudio 6 Flex Sistema de PCR en tiempo real</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, EE. UU</td>. <td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de PCR en tiempo real: KAPA SYBR&reg; Kit FAST qPCR Master Mix (2x) Roche</td><td>Secuenciación y Ciencias de la Vida, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, EE. UU.</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 EE. UU</td>. <td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos de transcripción inversa: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , EE. UU</td>. <td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de ARN: E.Z.N.A. Arn vegetal Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , EE. UU</td>. <td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 EE. UU</td>. <td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, EE. UU.</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Suelo: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, EE. UU.</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa y tampón</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

silenciamiento de microarn a base de x del virus de la papa (vbms) en la papa.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

El silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) es una herramienta rápida y eficiente para la caracterización funcional de microARN (miARN) en plantas. El sistema VbMS se ha desarrollado y aplicado para varias especies de plantas, incluyendo Nicotiana benthamiana, tomate, Arabidopsis, algodón y plantas monocotiledóneas como el trigo y el maíz. Aquí, describimos un protocolo detallado que utiliza vectores VbMS basados en PVX para silenciar los miRNAs endógenos en la papa. Para derribar la expresión de un miRNA específico, se diseñan moléculas mímicas (TM) objetivo de miRNA de interés, integradas en vectores de virus vegetales, y expresadas en papa por infiltración de Agrobacterium para unirse directamente al miRNA endógeno de interés y bloquear su función.

La Figura 2 muestra las plantas de papa PVX-STTM165/166 (Katahdin) con crecimiento ectópico de los tejidos de las hojas desde el lado abaxial de la lámina de la hoja a lo largo de las venas. También se han observado fenotipos más severos, como la formación de hojas en forma de trompeta. Por el contrario, no se observó ninguna anomalía fenotípica en las plantas de control de PVX. Estos resultados muestran que el sistema VbMS fue efectivo para suprimir la función endógena del miRNA en plantas ...

Presentamos un protocolo detallado para el sistema de silenciamiento de microARN (VbMS) basado en el virus de la papa X (PVX) para caracterizar funcionalmente los microARN endógenos (miRNAs) en la papa. Las moléculas de imitación objetivo (TM) de miRNA de interés se integran en el vector PVX y se expresan transitoriamente en la papa para silenciar la familia objetivo de miRNA o miRNA.

Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

El enfoque tradicional para analizar la función de los microARN en las plantas se basa principalmente en la generación de plantas de derribo estables. Este sistema de silenciamiento de microARN basado en virus no requiere una transformación tediosa y que requiere mucho tiempo. El silenciamiento de microARN basado en virus es una herramienta rápida y eficiente para la caracterización funcional de microARN en plantas que se puede aplicar a una amplia gama de especies de papa diploides y tetraploides.Jinping Zhao, investigador postdoctoral asociado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Para diseñar el módulo de imitación diana, inserte una secuencia de desajuste en la secuencia inversa del complemento del microARN de interés en el sitio correspondiente a los nucleótidos 10 a 11 del microARN. Para amplificar el fragmento de imitación de diana en tándem corto, configure una reacción de PCR con cada cebador de interés, un oligonucleótido espacial de 48 nucleótidos, un tampón de PCR 10 veces, una mezcla de dNTP, ADN polimerasa de PCR de alta fidelidad y agua destilada doble hasta un volumen final de 50 microlitros.A continuación, amplifique el microARN mediante PCR estándar utilizando los parámetros indicados. Para purificar los imitadores de objetivos en tándem corto, agregue 2,5 volúmenes de etanol y 1/10 de volumen de acetato de sodio de tres molares al producto de PCR. Mezclar enérgicamente antes de centrifugar la reacción a 14.000 veces G durante 10 minutos.Después de eliminar el sobrenadante, enjuague el pellet con un mililitro de etanol al 70% y deje que el pellet se seque, luego disuelva el pellet en 20 microlitros de agua doble destilada. Para establecer una reacción de ADN polimerasa T4, mezcle el producto de PCR imitador de objetivo en tándem corto purificado con tampón de ADN polimerasa 10 veces T4, un ditiotreitol molar, 100 milimolares dATP, ADN polimerasa T4 y agua destilada doble hasta un volumen final de cinco microlitros en hielo. A continuación, incubar la mezcla durante 15 minutos a 37 grados centígrados, seguida de una incubación de 20 minutos a 75 grados centígrados para inactivar la ADN polimerasa T4.Para preparar la construcción VBMS basada en PVX, digiera cinco microgramos de plásmidos de clonación independientes de ligadura de PVX con 2,5 microlitros de SMA1 en un volumen total de 100 microlitros. Agregue un volumen igual de fenol al cloroformo al alcohol isoamílico, agregue una proporción de 25 a 24 a uno a los productos de clonación independientes de ligadura de PVX digeridos con una mezcla vigorosa y recoja el producto por centrifugación. Agregue un volumen igual de cloroformo al alcohol isoamílico en una proporción de 24 a uno con respecto al sobrenadante con vórtice antes de someter el contenido del tubo a una segunda centrifugación.Al final del centrifugado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y agregue 2,5 volúmenes de etanol y 1/10 de volumen de acetato de sodio de tres molares con una mezcla vigorosa. Centrifugar el tubo y enjuagar el pellet con un mililitro de etanol al 70% y vórtice vigoroso. Vuelva a centrifugar el tubo y retire el sobrenadante para permitir que el pellet se seque al aire.A continuación, disuelva el pellet de plásmido de clonación independiente de ligadura PVX digerido en 100 microlitros de agua destilada doble. Para configurar la reacción de la ADN polimerasa T4, mezcle el ADN vectorial de clonación independiente de la ligadura PVX digerido con 10 veces tampón de ADN polimerasa T4, un ditiotreitol molar, dTTP 100 milimolares y ADN polimerasa T4 hasta un volumen final de cinco microlitros en hielo. A continuación, incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante 15 minutos, seguido de una incubación de 20 minutos a 75 grados centígrados para inactivar la ADN polimerasa T4.Para clonar la secuencia mímica de diana en tándem corto en el vector de clonación independiente de la ligadura PVX, mezcle cinco microlitros del producto de PCR de imitación de diana en tándem corto tratado con ADN polimerasa T4 con cinco microlitros del plásmido de clonación independiente de ligadura PVX tratado con ADN polimerasa T4 e incube la mezcla durante cinco minutos a 70 grados centígrados. Al final de la incubación, enfríe el contenido del tubo a 22 grados centígrados en una máquina de PCR a una velocidad de 0,1 grados centígrados por segundo, dejando el tubo en el termociclador durante 30 minutos una vez que se alcance la temperatura objetivo. Al final de la incubación, transforme cinco microlitros de producto de reacción de clonación independiente de ligadura en E. coli DH5 alfa utilizando protocolos de transformación estándar y cultive las bacterias transformadas en una placa LB que contenga 50 microgramos por mililitro de kanamicina.Después de verificar las secuencias de los fragmentos imitadores de diana en tándem corto mediante secuenciación del ciclo terminador, aísle los plásmidos PVX VBMS de los clones validados y transfórmelos en las cepas de Agrobacterium adecuadas. Para inocular plantas de papa in vitro de cuatro semanas de edad con Agrobacterium que contiene los plásmidos PVX VBMS, elija transformantes positivos que contengan vectores PVX VBMS e inocule los transformantes en 50 mililitros de LB líquido que contiene 50 microgramos por mililitro de kanamicina y 50 microgramos por mililitro de rifampicina durante 16 horas a 28 grados Celsius y 220 revoluciones por minuto. Durante la incubación, coloque las colonias positivas de Agrobacterium en al menos dos nuevas placas LB que contengan kanamicina y rifampicina y cultive los cultivos a 28 grados centígrados durante un día.Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 1.0, recoja el cultivo líquido de Agrobacterium por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un volumen suficiente de tampón de infiltración para ajustar la densidad óptica a 600 nanómetros a 1.0. Después de una incubación de seis horas a temperatura ambiente, cargue una jeringa sin aguja de un mililitro con la suspensión Agrobacterium y use una mano para voltear y sostener una hoja expandida de una planta de papa. Con un dedo, sostenga la lámina de la hoja desde el lado adaxial en el sitio deseado de infiltración.Y sosteniendo la jeringa vertical a la superficie de la hoja con la otra mano, infiltre de 100 a 200 microlitros de cultivo de Agrobacterium en el lado abaxial de la lámina. A continuación, use un palillo de dientes para recolectar colonias de las placas de cultivo de Agrobacterium y para rascar la superficie del tallo de los primeros uno o dos entrenudos de las plantas de papa infiltradas y la epidermis del tallo, luego cultive las plantas infiltradas en el invernadero durante dos a cuatro semanas. Cuando aparezcan los fenotipos, use tijeras para recolectar muestras con fenotipos del VBMS y las plantas de control.Aísle el ARN total de los tejidos recolectados y utilice la PCR con transcriptasa inversa para analizar la expresión de microARN y ARNm objetivo en cada muestra. En estas imágenes, se puede observar que el objetivo en tándem corto PVX imita 165/166 plantas de papa con crecimiento ectópico de los tejidos de las hojas desde el lado abaxial de la lámina de la hoja a lo largo de las venas. También se han observado fenotipos más severos, como la formación de hojas en forma de trompeta.Por el contrario, no se observan anomalías fenotípicas en las plantas de control PVX, lo que demuestra que el sistema VBSM es eficaz para suprimir la función endógena del microARN en las plantas de patata tetraploide. Las plantas de papa PVX short tandem target mimic 165/166 exhiben un crecimiento ectópico de la hoja al tejido desde el lado abaxial de la lámina de la hoja a lo largo de las venas de la lámina, lo que demuestra que el sistema PVX VBMS se puede aplicar a otras variedades de papa, incluidos los principales cultivares de papa. Es fundamental infiltrar simultáneamente las hojas e inocular el tallo de la misma planta con el mismo cultivo de Agrobacterium.Se recomiendan enfoques transgénicos para introducir de manera estable moléculas imitadoras en las plantas de papa cuando es necesario mantener el estado de silenciamiento de los microARN objetivo en las generaciones de descendencia.

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Inducida por el virus de silenciamiento génico es una herramienta útil para la identificación de genes implicados en la resistencia de las plantas hospedantes. Se demuestra el uso de patógenos bacterianos que expresan GFPuv en la identificación de genes silenciados plantas susceptibles a los agentes patógenos no hospedantes. Este método es fácil, rápido y facilita la detección a gran escala y protocolo similar se puede aplicar al estudio de otras interacciones planta-microorganismo.

VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped

Describimos aquí un método para regular el tropismo de picornavirus mediante la incorporación de secuencias complementarias a microRNAs específicos en el genoma viral.  Este protocolo se puede adaptar a todas las diferentes clases de virus con modificaciones basadas en la duración y la naturaleza de su ciclo de vida.

Reglamento basadas en microARN de picornavirus tropismo

Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.

Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.

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Este método demuestra el uso de la técnica de hibridación del norte para detectar miRNAs a partir del extracto total de ARN.

Análisis de manchas de ARN para la detección y cuantificación de microARN de plantas

Se presenta un protocolo de inyección (agroinyección) a base de Agrobacterium para la inoculación del virus del mosaico de la cola de zorro y los clones del virus del mosaico de la caña de azúcar en las plántulas de maíz. La inoculación de esta manera conduce a la infección viral, el silenciamiento génico inducido por virus de los genes marcadores y la sobreexpresión viral de GFP.

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar

En este trabajo se presenta un protocolo para estudiar la tasa de inicio de la muerte celular programada mediante la obtención de imágenes continuas de las hojas inoculadas después de la inducción de la muerte celular.

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Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

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