Name: Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a aislar, transfectar y cultivar cardiomiocitos adultos de ratón y rata durante más de 20 días. Este protocolo optimizado permite estudios de biología cardíaca, expresión génica y proliferación celular con alta eficiencia.

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Este trabajo fue apoyado por la financiación del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de Cincinnati, Facultad de Medicina, al Dr. Onur Kanisicak; una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R01HL148598) al Dr. Onur Kanisicak. El Dr. Onur Kanisicak cuenta con el apoyo del American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). El Dr. Perwez Alam cuenta con el apoyo de la subvención postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (AHA_20POST35200267). La Dra. Malina J. Ivey cuenta con el apoyo de una subvención NIH T32 (HL 125204-06A1).

Todos los experimentos deben realizarse de acuerdo con las directrices de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH). Todos los protocolos mostrados en el video fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati, Facultad de Medicina.
1. Preparación antes de la extracción cardíaca de ratones adultos (y ratas)
<ol><li>Preparar las soluciones de perfusión, enzima y parada correspondientes, de acuerdo con las recetas indicadas en la Tabla 1 y la Tabla 2,para el aislamiento de ratas y ratón, respectivamente. Filtrar las soluciones a través de un filtro de 0,22 m para eliminar cualquier contaminación o partículas no disueltos.</li>
	<li>Limpiar y esterilizar los instrumentos quirúrgicos remojando en 70% de alcohol durante 15 min, y posteriormente lavar con agua destilada doble. Deje que las herramientas se sequen al aire sobre una toalla de papel limpia.</li>
	<li>Precalentar el baño de agua a 37 oC. Compruebe el nivel de agua en el baño de agua para asegurar una circulación ininterrumpida de agua tibia a través del aparato de perfusión durante el procedimiento.</li>
	<li>Limpie el aparato de perfusión corriendo con un 70% de alcohol durante 5 min. Repita. NOTA: Aumente el caudal, lo que ayuda a limpiar el tubo.</li>
	<li>Después del flujo de alcohol, limpie los restos de alcohol corriendo doble agua destilada durante 10 min.</li>
	<li>Configure 3 platos desechables de peso de poliestireno desechables de tamaño mediano para limpiar el corazón después de la escisión. Llene los platos con 20 ml de tampón de miocitos.</li>
	<li>Añadir 2-3 gotas de heparina a cada plato con la ayuda de la pipeta Pasteur y mezclar bien pipeteando varias veces.</li>
	<li>Tome una jeringa de 10 ml con una cánula de aguja contundente. NOTA: Se puede preparar una cánula de aguja contundente cortando la punta de una aguja limpia y estéril. Se utilizaron una aguja de 21 G y una aguja de 14 G para hacer la cánula para el ratón y la rata, respectivamente.</li>
	<li>Llene la jeringa con tampón de perfusión (Tabla 1). Retire las burbujas de aire de la jeringa y colóquela en el tercer plato en una posición en ángulo. Asegúrelo con cinta adhesiva. NOTA: Para ratas, se utilizó la Solución A (Tabla 2) en lugar del tampón de perfusión de miocitos.</li>
	<li>Prepare un nudo suelto con una sutura quirúrgica y colóquelo alrededor de la aguja.</li>
	<li>Inyectar el ratón con heparina (100 unidades USP/ratón) mediante inyección intraperitoneal, 20 min antes de la inyección de anestesia.</li>
	<li>Circule el tampón de perfusión de miocitos(Tabla 1) a través del aparato de perfusión. Disminuya el caudal a 3 ml/min. NOTA: Para ratas, se utilizó la Solución A (Tabla 2) en lugar del tampón de perfusión de miocitos.</li>
	<li>Después de 5 min, sustituya el tampón de perfusión por la solución enzimática(Tabla 1). Saturar la solución enzimática con oxígeno durante el proceso. Utilice un caudal de 3 ml/min. NOTA: Para el aislamiento de LA RATA CM, utilice la solución E (Tabla 2) en su lugar.</li>
	<li>Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de anestesia. Utilice la dosis adecuada de anestesia, recomendada por el IACUC, para la cirugía terminal.</li>
	<li>Confirme la profundidad suficiente de la anestesia por la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo. A continuación, coloque el ratón en la plataforma quirúrgica.</li>
</ol>2. Extracción del corazón de ratones adultos (y ratas)
<ol><li>Esterilice la piel limpiando con 70% de alcohol.</li>
	<li>Abra cuidadosamente el pecho.</li>
	<li>Excós del corazón. Evite los tejidos no cardíacos durante la escisión.</li>
	<li>Poner el corazón en el primer plato, lleno de tampón de perfusión (Tabla 1). NOTA: Utilice la solución A para la rata (Tabla 2).</li>
	<li>Limpie la sangre del corazón apretando suavemente.</li>
	<li>Transfiera el corazón al segundo plato.</li>
	<li>Limpie la sangre del corazón y extraiga los tejidos no cardíacos. Posteriormente, transfiera el corazón al tercer plato.</li>
	<li>Recortar los pulmones y otros tejidos circundantes y cannular a través de la aorta ascendente. Este procedimiento debe realizarse lo más rápido posible (<5 min) para mejorar la calidad y la cantidad de CM.</li>
</ol>3. Digestión del corazón
<ol><li>Digestión del corazón del ratón NOTA: Todas las soluciones/buffers que circulan a través del corazón del ratón deben ser oxigenados durante todo el procedimiento.<ol>
<li>Retire con cuidado la aguja cánula de la jeringa y conéctela al aparato de perfusión de Langendorff.</li>
		<li>Evite cualquier burbuja de aire que entre en el corazón, lo que puede afectar el flujo a través de la solución enzimática y la digestión.</li>
		<li>Mueva la chaqueta de agua hacia arriba para proporcionar un ambiente homogéneo al corazón. Permita que la solución enzimática fluya a través del corazón a una velocidad de 2-3 ml/min. NOTA: La velocidad de la solución que pasa es crítica y tiene un impacto significativo en el resultado de la cantidad y la calidad de CM.</li>
		<li>Deje que la solución enzimática fluya a través del corazón durante 2 minutos.</li>
		<li>A 2 min, añadir 40 l de 100 m de solución de CaCl2 a la solución enzimática y mezclar. Deje que la solución enzimática pase a través del corazón durante otros 10-15 min. NOTA: Una vez que el flujo se vuelve suave, el corazón se vuelve marrón y suave, lo que indica la distribución uniforme de la enzima colagenasa y la digestión adecuada del corazón.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digestión del corazón de la rata NOTA: Todas las soluciones/buffers que circulen a través del corazón de la rata deben ser oxigenados durante todo el procedimiento.<ol>
<li>Retire con cuidado la aguja cánula de la jeringa y conéctela al aparato de perfusión de Langendorff.</li>
		<li>Evite cualquier burbuja de aire que entre en el corazón, lo que puede afectar el flujo a través de la solución enzimática y la digestión.</li>
		<li>Mueva la chaqueta de agua hacia arriba para proporcionar un ambiente homogéneo al corazón.</li>
		<li>Iniciar el flujo de la solución A a una velocidad de 2-3 mL/min durante 3-5 min para eliminar cualquier sangre del corazón. NOTA: La velocidad de la solución de paso es crítica y tiene un impacto significativo en el resultado de la calidad CM.</li>
		<li>Una vez que la sangre se despeje del corazón, cambie de la solución A a la solución E (Tabla 2). Valorar la solución E con CaCl2 como se indica a continuación para una concentración final de 0,1 mM en solución:<ol>
<li>Después de 10 min de perfusión, añadir 12,5 l de 0,1 M CaCl2.</li>
			<li>Después de 15 min de perfusión, añadir 25 l de 0,1 M CaCl2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deje que la solución enzimática pase a través del corazón durante otros 30-40 minutos, hasta que el flujo se vuelva rápido y el corazón sea flexible.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparación de la suspensión de una sola célula CM
<ol><li>Preparación de la suspensión de una sola célula CM (ratón)<ol>
<li>Retire el corazón del sistema de perfusión Langendorff. Muévelo a un plato Petri de 60 mm lleno de 5 ml de solución enzimática y transfila el plato a una capucha de bioseguridad. NOTA: Asegúrese de una suficiente digestión cardíaca antes de extraer el corazón del sistema de perfusión Langendorff. El tiempo de digestión depende de la actividad enzimática, el flujo de solución y el tamaño del corazón.</li>
		<li>Realice cualquier desagregación mecánica adicional en una campana de bioseguridad para garantizar la esterilidad y evitar la contaminación.</li>
		<li>Retire cuidadosamente las aurículasth (1/4 de la porción basal del corazón) y los tejidos extra grasos.</li>
		<li>Picar el corazón con fórceps en trozos finos.</li>
		<li>Tome una pipeta Pasteur estéril y corte su punta en un ángulo de 45o.</li>
		<li>Utilice esta pipeta Pasteur para dispensar el tejido cardíaco en una suspensión de una sola célula por pipeteo suave. La digestión óptima proporciona una suspensión de cardiomiocitos de una sola célula. NOTA: Retire la parte inferior estrecha de la tubería de transferencia para reducir el daño de CM debido al sellado mecánico.</li>
		<li>A continuación, añadir 5 ml de solución de parada para detener la actividad enzimática, lo que evita la posibilidad de sobredigestión.</li>
		<li>Tome un cónico fresco de 50 ml y coloque un colador celular estéril de 100 m sobre él.</li>
		<li>Pasar la suspensión del cardiomiocitos a través del colador celular para eliminar el trozo de tejido. Lavar el plato y el colador de Petri con otros 5 ml de solución de parada (Tabla 1) para recoger los cardiomiocitos que permanezcan unidos al colador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la suspensión de una sola célula CM (rata)<ol>
<li>Retire el corazón del sistema de perfusión Langendorff. Mueva el corazón a un plato Petri de 100 mm lleno de 5 ml de solución A y mueva el plato a una capucha de bioseguridad. NOTA: Asegúrese de una suficiente digestión cardíaca antes de extraer el corazón del sistema de perfusión Langendorff. El tiempo de digestión depende de la actividad enzimática, el flujo de solución y el tamaño del corazón.</li>
		<li>Realice cualquier desagregación mecánica adicional en una campana de bioseguridad para garantizar la esterilidad y evitar la contaminación.</li>
		<li>Retire cuidadosamente las aurículas (1/4 de la porción basal del corazón) y los tejidos extra grasos.</li>
		<li>Picar el corazón con fórceps en trozos finos.</li>
		<li>Tome una pipeta Pasteur estéril y corte su punta en un ángulo de 45o.</li>
		<li>Utilice esta pipeta Pasteur para dispensar el tejido cardíaco en suspensión de una sola célula mediante pipeteo suave. La digestión óptima proporciona una suspensión de cardiomiocitos de una sola célula. NOTA: Retire la parte inferior estrecha de la tubería de transferencia para reducir el daño de CM debido al sellado mecánico.</li>
		<li>Añadir 5 ml de solución B(Tabla 2) a la suspensión CM y pasar la solución a través de un colador celular de 100 m para eliminar cualquier trozo restante de grasa u otro tejido no digerido.</li>
		<li>Recoger el filtrado en un vial cónico fresco de 50 ml.</li>
		<li>Utilice otros 5 ml de solución B para lavar el plato De Petri y cualquier CM restante a través del colador celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Eliminación de los no MC
<ol><li>Eliminación de los no MC de la suspensión adulta de una sola célula (ratón)<ol>
<li>Centrifugar la suspensión celular a 20 x g durante 3 min.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de solución de parada (Tabla 1). NOTA: El aumento de la concentración de BSA en la solución de parada aumentará su viscosidad y reducirá la tasa de sedimentación de los no MC.</li>
		<li>Resuspender los CM por inversión suave del tubo 3-5 veces.</li>
		<li>A intervalos de 3 min, agregue 10 l de 100 m de solución de CaCl2 y mezcle. Repite tres veces.</li>
		<li>Después de la cuarta adición, centrifugar la suspensión de cardiomiocitos a 20 x g durante 3 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspend CM en precalegado (37 oC), medios de revestimiento CM de ratón para adultos (Tabla 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminación de los no MC de las suspensiones adultas de una sola célula (rata)<ol>
<li>Células de pellets a 20 x g durante 3 min a 25 oC.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 25 ml de la solución B (Tabla 2).</li>
		<li>Mezcle las células por inversión suave y colóquelas en un soporte de tubo para permitir que el CM se asiente bajo la gravedad.</li>
		<li>Deseche cuidadosamente el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender las células en 25 ml frescos de la solución B y valorarlas a 1,0 mM de CaCl2 mediante la adición escalonada de 50 l, 75 l y 100 l de 0,1 M de CaCl2 a intervalos de 3-5 min. NOTA: Se podría utilizar una mayor concentración de BSA en la solución B en este paso. El aumento de la concentración de BSA en la solución B aumenta la viscosidad y, por lo tanto, reduce la tasa de sedimentación de los no MC.</li>
		<li>Células de pellets a 20 x g durante 3 min a 25 oC, aspirar el sobrenadante, y añadir el volumen deseado de medios de cultivo de células de ratas adultas (Tabla 4).</li>
		<li>CMs de semillas en una placa recubierta de laminina. NOTA: El recubrimiento previo de los CM en una placa de cultivo no recubierta se puede utilizar para minimizar la contaminación de las células no CM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Revestimiento CM para adultos
<ol><li>Pre-plating<ol>
<li>Resuspender a los cardiomiocitos en medios de cultivo.</li>
		<li>Pre-placar las células en un plato de 60 mm o 100 mm para ratón o rata CM, respectivamente.</li>
		<li>Incubar los CM durante 2 h en una incubadora suplementada con 5% de CO2 a 37 oC.</li>
		<li>Durante la incubación previa a la placa, recubre las placas de cultivo celular con laminina (10 g/ml en PBS) para el cultivo de CM a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de 2 horas de pre-enchapar, recoger los CM en un vial cónico de 50 ml.</li>
	<li>Recoger las células del plato y volver a plancharlas en una placa de cultivo de 24 pozos recubierto de laminina para experimentos de transfección.</li>
	<li>Células de cultivo en una incubadora a 37 oC complementadas con 5% con CO2. 4-6 horas es suficiente para adherirse a los cardiomiocitos con la superficie, y por lo tanto, la transfección se puede realizar 6 horas después del blindaje. NOTA: El medio de chapado que contiene FBS se utiliza comúnmente y muestra una mejor compatibilidad con los estudios de proliferación. Sin embargo, un medio libre de suero se puede utilizar para experimentos en los que se están analizando factores secretores.</li>
</ol>7. Transfección
<ol><li>Incubar los CM a las placas de cultivo celular recubiertas con laminina durante 4-6 horas.</li>
	<li>Cuatro horas después de la siembra de CM en la placa recubierta de laminina, células transfectadas con siRNAs (50 nM) de interés utilizando un reactivo de transfección (por ejemplo, Lipofectamine RNAiMAX) según el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Cambie los medios 24 horas después de la transfección y cada 24 horas después de eso durante un máximo de 20 días.</li>
	<li>Después de 20 días, células fijas con 4% PFA en PBS para aplicaciones posteriores, incluyendo inmunocitoquímica para marcadores específicos de cardiacos como troponina para asegurar que los cardiomiocitos vivos se cultivaron con éxito a largo plazo.</li>
</ol>

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Existe una necesidad crítica de establecer un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos adultos y el cultivo a largo plazo para realizar estudios mecánicos específicos de la célula. Sólo hay unos pocos informes que discuten los protocolos de aislamiento CM adultos, y aún menos de ellos se utilizan para el cultivo a largo plazo de ratones adultos CM15,,16,,17. Se ha demostrado que la rata adulta CM tiene una mayor toleranci...

Las enfermedades cardíacas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Casi todos los tipos de lesiones cardíacas resultan en una pérdida significativa de cardiomiocitos adultos (CM). Los corazones de mamíferos adultos son incapaces de reparar su lesión cardíaca debido a la naturaleza senescente del CM1adulto. Por lo tanto, cualquier insulto al corazón adulto de los mamíferos resulta en una pérdida permanente de CM, lo que conduce a una reducción de la función cardíaca y la insuficiencia cardíaca. A diferencia de los mamíferos adultos, los animales pequeños como el pez cebra y los corazones newt pueden regenerar su lesión cardíaca a través de la proliferación CM existente2,,3,,4. Se está llevando a cabo un esfuerzo mundial para encontrar una nueva intervención terapéutica para lesiones cardíacas a través de enfoques proliferativos y no proliferativos. En las últimas décadas, se han desarrollado varios tipos de modelos genéticos de ratón para estudiar lesiones cardíacas y reparación. Sin embargo, el uso de modelos animales in vivo sigue siendo un enfoque costoso con la complejidad adicional para descifrar un mecanismo autónomo celular de los efectos secundarios. Además, los sistemas in vivo son difíciles de analizar los efectos específicos de CM de una intervención farmacológica que induce la señalización cardioprotectora de la CM.
Además, la cultura a largo plazo de los CM adultos es necesaria para realizar análisis de proliferación de CM. Los ensayos de proliferación de CM requieren un mínimo de 4-5 días para que las células se induzcan en el ciclo celular y obtengan datos precisos después de eso. Además, los estudios que utilizan CM aislados para estudios electrofisiológicos, cribado de fármacos, estudios de toxicidad y estudios de homeostasis Ca++ necesitan un sistema de cultivo mejorado5,,6,,7. Además, estudios recientes muestran la importancia cardioprotectora de las citoquinas secretadas de los CM (cardioquinas)8,9. Con el fin de investigar el papel terapéutico y el mecanismo molecular de estas cardioquinas durante la reparación y regeneración del corazón, se requiere un cultivo prolongado.
Los CM de ratas adultos son lo suficientemente robustos para el aislamiento de una sola célula y el cultivo a largo plazo en un sistema in vitro10,11,12. Sin embargo, los CM de ratón para adultos son de gran interés para los ensayos in vitro, debido a la disponibilidad de una variedad de modelos de ratón modificados genéticamente, lo que permite el diseño y ejecución de diversos análisis innovadores que no son posibles con la rata CM13. En contraste con el aislamiento CM de rata adulta, es bastante difícil obtener una suspensión de una sola célula de corazones de ratón adultos, y el cultivo a largo plazo de los CM de ratón adultos en el cultivo es aún más difícil.
El aislamiento CM adulto de los corazones de ratón y rata utilizando un sistema Langendorff se ha establecido previamente para estudiar la función CM5,14,15. Aquí, hemos descrito en detalle los protocolos para el aislamiento CM adulto de ratas y ratones, así como un cultivo modificado a largo plazo, transfección y proliferación CM de células aisladas.

<table><tbody><tr><td>2,3-butano monóxido de diona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatina</td><td>APExBIO</td><td>B1387</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>de célulasBD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cel-miR-67</td><td>Dharmacon</td><td>CN-001000-01-50</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia graduadas desechables</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Platos de pesaje de poliestireno desechables</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z154881-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Águila modificada de Dulbecco's medio</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de alta precisión de punta fina</td><td>Fisherbrand</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5400</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>PSLAB-018285-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas/Pinzas de alta precisión, rectas, anchas, de punta fuerte,</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td> Microscopio de luz 746436 <td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de ratón natural</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Henry Schein</td><td>24352</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Selenio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229865+5G</td><td></td></tr><tr><td>siMeis2</td><td>Dharmacon</td><td>s161030</td><td></td></tr><tr><td>siRb1</td><td>Dharmacon</td><td>s128325</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras rectas romas/afiladasTijeras de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>28252</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas rectas de precisión muy finas</td><td>Fisherbrand</td><td>16-100-120</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Tijera ultralisa con acabado biselado</td><td>Fisherbrand</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>3006S</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento, transfección y cultura a largo plazo de cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

El cultivo ex vivo de los cardiomiocitos de mamíferos adultos (CM) presenta el sistema experimental más relevante para el estudio in vitro de biología cardíaca. Los CM de mamíferos adultos son células diferenciadas terminalmente con una capacidad proliferativa mínima. El estado postmitético de los CM adultos no sólo restringe la progresión del ciclo celular de cardiomiocitos, sino que también limita el cultivo eficiente de los CM. Además, la cultura a largo plazo de los CM adultos es necesaria para muchos estudios, como la proliferación de CM y el análisis de la expresión génica.
El ratón y la rata son los dos animales de laboratorio preferidos para el aislamiento de cardiomiocitos. Si bien la cultura a largo plazo de los CM de rata es posible, los CM de ratón adultos son susceptibles a la muerte y no pueden ser cultivados más de cinco días en condiciones normales. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de optimizar el aislamiento celular y el protocolo de cultivo a largo plazo para los CM murine adultos. Con este protocolo modificado, es posible aislar y cultivar con éxito tanto los CM adultos de ratón como de rata durante más de 20 días. Además, la eficiencia de la transfección de siRNA de CM aislada aumenta significativamente en comparación con los informes anteriores. Para el aislamiento CM de ratón adulto, el método de perfusión Langendorff se utiliza con una solución enzimática óptima y tiempo suficiente para la disociación completa de la matriz extracelular. Con el fin de obtener CM ventriculares puras, ambas aurículas fueron diseccionadas y descartadas antes de proceder con la disociación y ensuciamiento. Las células se dispersaron en una placa recubierta de laminina, lo que permitió una fijación eficiente y rápida. Se permitió que los CM se conforman con 4-6 h antes de la transfección del SIRNA. Los medios de cultivo se actualizaron cada 24 horas durante 20 días, y posteriormente, los CM se fijaron y se tiñeron para marcadores específicos de los cardiacos como troponina y marcadores del ciclo celular como KI67.

El protocolo modificado actual permite el aislamiento eficiente y el cultivo de LOS CM de ratas y ratones in vitro. Para el aislamiento de la RATA CM, se utilizaron un total de 3 ratas macho Fischer 344 adultas adultas (de 12 semanas de edad) en el procedimiento. La Figura 1 muestra el aparato quirúrgico y las configuraciones de aislamiento que se requieren en el procedimiento; cada parte ha sido marcada y descrita en la leyenda de la figura. La collagenasa tipo 2 se utilizó para la digestió...

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento, la transfección y el cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos de ratón y rata.

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

El objetivo de este vídeo es demostrar un protocolo estandarizado para el aislamiento de cardiomiocitos adultos, el cultivo a largo plazo y la transfección. Aislar y cultivar cardiomiocitos de ratón o rata siguen siendo un método esencial para investigar la biología autónoma celular de los cardiomiocitos dentro del corazón sano y enfermo. Hay varias preguntas que podemos responder usando cardiomiocitos aislados.Como el potencial proliferativo. Hay cambios en la expresión génica o expresiones específicas de citoquinas tras la respuesta a la lesión. Desafortunadamente, los cardiomiocitos de ratón no sobreviven en la última semana en condiciones normales de cultivo.Por lo tanto, en este video, describimos un método optimizado para aislar cardiomiocitos de ratón adultos, los transfiguramos y los cultivamos mucho más allá de 21 días, esta técnica es inicialmente difícil de dominar. Pero con la práctica se puede lograr alrededor de 80 a 90% sobrevivir en cardiomiocitos después del aislamiento y alrededor de una eficiencia de transfección al 100 por ciento. Y la mayoría de estos cardiomiocitos en condiciones correctas pueden sobrevivir más allá de los 20 días.Limpie y esterilice sus instr

isolation-transfection-long-term-culture-adult-mouse-rat

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este trabajo se describe la forma típica de aislar y cultivar el corazón de rata adulta miocitos. Colagenasa y la proteasa se utilizan para digerir y aislar a los miocitos individuales. Miocitos cultivadas seguir este protocolo cumplir con los requisitos de la mayoría de los experimentos.

Cultivo primario de miocitos adultos de corazón de rata

Adultos miocitos cardíacos son las células primarias que pueden ser aisladas de corazones de animales y se cultivan durante varios días. Dentro de este período de la cultura de transferencia génica adenoviral pueden ser utilizadas para expresar biosensores genéticamente codificados (GEBS) o proteínas fluorescentes de fusión. Ambos enfoques permiten investigaciones celulares por medio de microscopía confocal.

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Se describe un método fiable para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto. Este protocolo se obtiene un resultado coherente para el cultivo de cardiomiocitos adultos funcionales a partir de una variedad de ratones modificados genéticamente.

Aislamiento y cultivo de ratón adulto cardiomiocitos de Señalización Celular y<em&gt; In vitro</em&gt; Hipertrofia Cardíaca

Este protocolo describe un método paso a paso para el aislamiento reproducible y el cultivo a largo plazo de cardiomiocitos de ratón adultos con alto rendimiento, pureza y viabilidad.

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Se han desarrollado y descrito varios protocolos para el aislamiento de diferentes tipos de células cardíacas de un corazón de rata. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación, reduciendo los costos experimentales.

Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC). ARVC aislada puede utilizarse para el cultivo de corto y largo plazo. El aislamiento y cultivo de ARVC pueden desempeñar un papel clave en el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento para enfermedades cardíacas.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata adulta

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

El estándar de oro en cardiología para experimentos funcionales celulares y moleculares son los cardiomiocitos. Este artículo describe adaptaciones a la técnica no Langendorff para aislar cardiomiocitos de ratón.

Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

Aprenda a aislar, transfectar y cultivar cardiomiocitos adultos de ratón y rata durante más de 20 días. Este protocolo optimizado permite estudios de biología cardíaca, expresión génica y proliferación celular con alta eficiencia.

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

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