Una guía de sección, corte y procesamiento de imágenes para adquisición y análisis de muestras óseas corticales de alto rendimiento para Micro-TC sincrotrón

Los datos disponibles relacionados con la obtención de muestras óseas para la tomografía microcomputarizada de sincrotrón siguen siendo escasos. Nuestro tutorial completo proporciona una metodología sencilla, mínimamente destructiva y rentable. La obtención de muestras óseas con dimensiones consistentes y forma cilíndrica es fundamental para garantizar que los conjuntos de datos resultantes sean de la más alta calidad y que los resultados sean aplicables.

Las técnicas descritas en este manuscrito son aplicables a la extracción de núcleos de rocas, fósiles o cualquier material duro. Los hemos utilizado para recolectar núcleos de rocas de tamaño uniforme y cristales individuales para experimentos de alta presión para explorar la reología de la corteza terrestre y el manto superior. Los principiantes pueden encontrar que el espécimen óseo forma formas cónicas.

Esto se puede solucionar permitiendo el tiempo adecuado y suficiente para que el polvo de hueso se elimine de la broca y disminuyendo la velocidad de extracción de núcleos. Hay una falta de textos instructivos y videos que demuestren la obtención de muestras óseas para la tomografía microcomputarizada de sincrotrón y es el análisis lógico. Nuestro tutorial paso a paso de preparación ósea ayuda a llenar este vacío.

Coloque un portaobjetos de microscopio de vidrio de 75 por 25 milímetros en placas calientes de hasta 140 grados Celsius y derrita una cantidad generosa de resina epoxi térmica en el centro del portaobjetos. Presione el aspecto inferior del bloque óseo en la resina epoxi térmica en el portaobjetos del microscopio con la longitud del hueso perpendicular al portaobjetos. Mueva la muestra hacia adelante y hacia atrás para cubrir la parte inferior del hueso y garantizar una adhesión segura.

Deje que la muestra montada descanse sobre la placa calefactora durante aproximadamente cinco minutos para permitir que el epoxi térmico se absorba en los poros y grietas, asegurándose de que el epoxi del portaobjetos esté libre de burbujas. Si hay burbujas, mueva la muestra hacia adelante y hacia atrás para eliminarlas. Use pinzas romas para quitar el portaobjetos con la muestra montada de la placa calefactora y deje que se enfríe a temperatura ambiente durante unos 10 minutos, luego retire cualquier epoxi del borde del portaobjetos con una cuchilla de afeitar para asegurarse de que el mandril agarre adecuadamente el portaobjetos.

Fije el portaobjetos con la muestra adherida a un mandril portaobjetos de vidrio y monte el portaobjetos en el brazo giratorio de una sierra de corte de baja velocidad, colocándolo de modo que una sección transversal del hueso pueda cortarse perpendicular a su longitud. Ajuste el brazo giratorio para asegurarse de que la cuchilla entre en contacto con la muestra y la atravieste. Agregue pesas al lado más alejado del brazo de corte para contrarrestar el peso del brazo y agregue agua destilada y líquido de corte al receptáculo de fluido.

Asegure firmemente la hoja de oblea de diamante y asegúrese de que el nivel de líquido sumerja la parte de corte de la hoja. Ajuste la velocidad a 200 RPM y baje lentamente la muestra sobre la cuchilla. Una vez que la sierra comience a seccionar, asegúrese de que la hoja y el mandril no se tambaleen ni reboten.

Si es así, detenga inmediatamente la sierra y apriete la hoja o el conjunto del brazo del portabrocas. Si el mandril se mueve agresivamente hacia arriba y hacia abajo, agregue más contrapesos. La primera sección gruesa es un corte de desecho que proporcionará una superficie bien definida paralela a cada corte adicional.

Después del corte inicial de desagüe, levante el brazo giratorio y mueva el mandril cinco milímetros hacia la hoja usando el dial de posicionamiento. Una vez completado el corte, coloque el portaobjetos de vidrio con la muestra montada en una placa caliente para derretir el epoxi térmico. Monte secciones de hueso de cinco milímetros en el fondo de una lata de aluminio poco profunda utilizando la técnica de unión térmica epoxi descrita anteriormente.

Coloque la lata en una mesa de máquina XY de la taladradora de molino y apriete a mano las abrazaderas de fijación. Inserte una broca de perforación con punta de diamante de joyeros de eje hueco de dos milímetros de diámetro interior en el mandril del taladro de molino y ajuste el limitador de profundidad para evitar que se perfore a través de la lata. Alinee la cara anterior central de la muestra ósea debajo de la broca, evitando el contacto cercano con el periostio y el ostium o áreas altamente trabecularizadas.

Llene la lata con agua destilada para cubrir completamente la muestra, lo que evita la acumulación de calor, la quema de la muestra y el daño a la broca durante la extracción de núcleos. La taladradora de molino puede ser peligrosa si no se toman las medidas de seguridad adecuadas. Los operadores deben asegurarse de usar gafas de seguridad, de que la ropa holgada esté asegurada y de que el cabello largo esté recogido para que no quede atrapado en el huso.

Para los primeros casos de contacto entre la broca central y el hueso, aplique una presión suave para usar un anillo en la superficie superior del hueso. Esto evita la deflexión de la broca al comienzo del proceso de extracción de núcleos y garantiza la colocación correcta de la broca. Durante la extracción de núcleos, levante la broca dentro y fuera de la muestra mientras mantiene la punta de la broca debajo de la superficie del agua.

Haga esto cada pocos segundos para eliminar el polvo óseo atrapado y asegurarse de que los desechos no ocluyan la broca. Una vez completada la extracción de núcleos, el núcleo óseo resultante puede alojarse en la broca de tallo hueco. Use un par de pinzas de punta fina o una llave Allen pequeña para desalojar el núcleo de la broca.

Almacene la muestra sin corazón en un tubo de microcentrífuga etiquetado en un lugar fresco y seco hasta la obtención de imágenes. El método descrito de muestreo de núcleos demostró ser altamente efectivo y eficiente. Aquí se muestran figuras representativas que comparan el flujo de trabajo de procesamiento de imágenes de una muestra con núcleo y una obtenida con una herramienta rotativa.

El corte de la muestra con la herramienta rotativa común mostró un mayor número de canales y lagunas y una disminución del diámetro promedio del canal, el volumen del canal y la porosidad cortical en comparación con la muestra con núcleo. Esta tabla muestra los datos de porosidad para cada muestra. Aunque el protocolo de extracción de muestras disminuye los artefactos observados en las tomografías de microcomputadora de sincrotrón, las cifras cargadas de artefactos de menor calidad de los experimentos de bloques óseos rectilíneos representan un problema multifacético.

El procesamiento posterior de las imágenes confirmó el potencial de la técnica para mejorar la visualización de la microarquitectura ósea cortical. Por ejemplo, se observaron diferencias en la mineralización, una mejor delineación de los límites osteonales y una visualización consistente de los tejidos blandos dentro de los canales vasculares. Proceder lentamente es la clave para obtener muestras cilíndricas de tamaño constante.

Ir demasiado rápido puede hacer que los especímenes adquieran forma de cono en lugar de cilíndricos. Al mismo tiempo que se obtienen secciones gruesas para la extracción de núcleos, se pueden recopilar secciones más gruesas para la microscopía confocal o de campo claro. Esto permite la visualización de la red canalizicular.