Modelo alveolar humano multicelular compuesto por células epiteliales y células inmunes primarias para la evaluación de riesgos

Este modelo de audio humano individual utiliza células inmunitarias relevantes como una poderosa herramienta para predecir la respuesta inmune aguda de sustancias incluyendo nanomateriales y fármacos de conocimiento. Estos medicamentos combinan células epiteliales humanas y células inmunitarias primarias humanas para evaluar esas reacciones específicas. El uso de monocitos frescos y congelados proporciona flexibilidad para el plan de experimento.

Numerosos estudios han demostrado que este modelo puede proporcionar una visión de la comunicación interestelar entre un sentido del comportamiento y el sentido inmune. Como esta demostración incluye todos los detalles importantes para taching del modelo un rasgo personal en el cultivo celular, instrucciones visuales para replicar experimentos. Varios pasos en el protocolo de la vejiga son complejos y requieren un manejo especial.

Por lo tanto, se demuestran con todos los detalles necesarios que se pueden seguir fácilmente. Para el aislamiento de monocitos de sangre periférica de las capas humanas de Buffy, dividir el contenido de la bolsa de la bolsa De Buffy cosecha, uniformemente entre 250 mililitros tubos cónicos. Traiga cuidadosamente el volumen total en cada tubo 250 mililitros con PBS y mezcle los tubos con tres inversiones suaves.

A continuación, dividir la solución de PBS de capa Buffy por igual entre cuatro nuevos tubos de 50 mililitros, a continuación, añadir 10 microlitros de CD 14 cuentas magnéticas positivas las séptimas células totales al tubo y mezclar bien por pipeteo. Al rellenar, desenchufe la pipeta de la pipeta e inmediatamente enchufara la abertura superior de la pipeta con un pulgar y luego coloque la pipeta rellena en la parte inferior de un tubo y desenchufe la abertura de la pipeta para permitir que el medio de gradiente de densidad fluya lentamente por debajo de la mezcla de PBS de capa de color, hasta que quede un mililitro del medio de gradiente de densidad dentro de la pipeta. Cuando se ha añadido un medio de gradiente de densidad a cada tubo de la misma manera, separa las células por centrifugación de gradiente de densidad y usa una pipeta serológica para recoger la capa blanca de células mononucleares de sangre periférica de dos a tres milímetros de espesor de entre el plasma y las capas medias de gradiente de densidad.

La mejor manera de conectar la capa es eliminar el plasma primero y luego suprimir nuestras pipetas lógicas para recoger las células. Tire de las células mononucleares de sangre periférica de cada conjunto de dos tubos en un nuevo tubo de 50 mililitros y lave las células dos veces con un volumen total de 50 mililitros de PBS fresco por lavado. A continuación, deseche el sobrenadante y resusppend la pipeta en cada uno en cinco mililitros de PBS fresco y acarrear las suspensiones celulares en un solo tubo para el recuento.

Después de contar, centrifugar las células de nuevo y resuspender la pelette a 80 mililitros de búfer de separación magnética por atender a las séptimas células. Luego agregue 10 microlitros de cd 14 cuentas magnéticas positivas por asistir a las séptimas células totales al tubo y mezcle bien por pipeteo. Después de una incubación de 15 minutos a cuatro grados Celsius enjuague una columna magnética con tres mililitros de búfer de separación magnética y agregue las células a la columna.

Lave la columna tres veces con tres volúmenes de tampón por lavado y transfiera la columna a un tubo de 15 mililitros que contenga un mililitro de tampón de separación magnética fresca. A continuación, utilice el émbolo y cinco mililitros de tampón para vaciar las células positivas del CD 14 en el tubo. Inducir la diferenciación de las células positivas CD 14 aisladas del cordón magnético.

En primer lugar, resuspend las células en una sola vez atender a las seis células por mililitro concentración en el medio de cultivo celular. O diferenciación MDDC, añadir 10 nanogramos por mililitro de y de planta de macrófago sitio granula factor estimulante al tubo y añadir tres mililitros de células a cada pozo de una placa de cultivo celular de seis pozos, o diferenciación añadir 10 nanogramos por mililitro de factor estimulante de colonia de macrófago a las células y placar las células como acaba de demostrar. Para establecer un modelo de cultivo de co-cultivo de células triples de tejido epitelial alveolar humano, primero transfiera 1,5 mililitros de medio de cultivo celular precaliente al número adecuado de Pozos de una placa de 12 pozos y coloque un inserto de cultivo celular en cada pozo.

A continuación añadir 500 microlitros de suspensión de células epiteliales a una densidad de cinco veces 10 a las quintas células por mililitro en el lado apical de cada plaquita y cubrir la placa para una incubación de cuatro días en la incubadora de cultivo celular. O la siembra MDDC reemplaza el sobrenadante de los Pozos de seis placas de pozos utilizados para la diferenciación MDDC, con un mililitro de medio de cultivo celular cálido fresco y utilizar un rascador celular para separar las células de adherencia de cada pozo. Lavar cada pozo tres veces con el supernate y en cada pozo y combinar todas las soluciones celulares en un solo tubo centrífugo.

El MDDC cosechado por centrifugación y pinzas estériles para colocar las plaquitas de las placas de 12 pozos boca abajo en un plato estéril de Petri. Raspar cualquier célula epitelial del lado basal de la plaquita y resuspend los MDDC en un medio de cultivo celular fresco hacer una concentración de 4.2 veces 10 de estas células por mililitro. A continuación, agregue 150 microlitros de células en cada plaquita para que toda la superficie basal de la plaquita esté igualmente cubierta con el líquido sin burbujas.

Para la siembra de MDDM después de cosechar los MDDM diferenciados como se demostró para los MDDC, diluir las células a un 2,5 veces 10 a las cuatro células por mililitro de concentración media de cultivo celular fresco y agregar 500 microlitros de células por la pared de cada célula epitelial y MDDC que contiene el inserto de cultivo celular, luego coloque la tapa en la placa y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente aspirar el sobrenadante de las áreas apical y basal de cada inserto de cultivo celular y Wells. Luego esterilizas pinzas para levantar las inserciones de los Wells y añadir 600 microlitros de precalentamiento fresco a medio de cultivo celular a cada pozo.

Después de seis días de diferenciación, los MDM aparecen redondos en forma mientras que los MDDC forman clústeres formados por celdas con una forma más alargada y protuberancias observables. Después de tres días de crecimiento en inserciones de membrana, las células epiteliales forman un aumento significativo de la densa en la liberación de lactato deshidrogenasa se observa en el medio de cultivo celular del compartimento basal tras la exposición a un control positivo para la ruptura de la membrana, lo que demuestra la capacidad de respuesta del modelo a una sustancia citotóxica. No hay aumento en la liberación de lactato deshidrogenasa medida tras la estimulación apical con TNF alfa o LPS.

Se observan aumentos estadísticamente significativos en la liberación de IL6 e IL8 en muestras tratadas alfa LPS y TNF en comparación con el control de células no tratadas. No se observan diferencias en la morfología celular entre los modelos de cultivo cocultivo que utilizan MDDM y MDDC a partir de monocitos de sangre periférica fresca en comparación con aquellos que utilizan células descongeladas en LPS y el cocultivo alfa expuesto TNF, se observó una capa epitelial alterada. Es posible utilizar otros tipos de células humanas como las vías respiratorias o células bronquiares, también se pueden analizar otros puntos finales.

Principalmente los investigadores se han inspirado en esta técnica utilizando una configuración similar a la configuración pero con diferentes tipos de células.