Name: Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a cuantificar el declive de la proteostasis en tejidos específicos de Caenorhabditis elegans mediante reportes fluorescentes de poliglutamina. Este método permite visualizar y medir la acumulación de agregados proteicos asociada al envejecimiento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría agradecer a los miembros pasados y presentes del laboratorio Samuelson por su ayuda en el refinamiento de este método y / o discusión que ayudó al desarrollo de este manuscrito. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio RF1AG062593 y R21AG064519. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El envejecimiento se caracteriza por una disminución gradual de la proteostasis. La proteostasis es mantenida por un sistema complejo, la red proteostática, para el control coordinado, dinámico y sensible al estrés del plegamiento, la degradación y la traducción de proteínas. Por qué la proteostasis falla en el curso del envejecimiento es poco conocida, pero un epigenoma en descomposición, la disminución de la inducibilidad de las respuestas al estrés y la pérdida de diafonía compensatoria coinciden con esta ruptura. En ...

La homeostasis proteica (proteostasis) se define como la capacidad celular para mantener la función adecuada y el plegamiento del proteoma. El desafío inherente a la proteostasis es garantizar que todas las proteínas se plieguen y mantengan adecuadamente en una conformación nativa, que se amplifica aún más por la naturaleza variada del tamaño de la proteína, la composición de aminoácidos, la conformación estructural, la estabilidad, la renovación, la expresión, la compartimentación subcelular y las modificaciones1. La proteostasis se mantiene a través de la acción coordinada de una gran red proteostática, que consta de aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulan la síntesis adecuada, el plegamiento, el tráfico y la degradación dentro del proteoma2,3. Los componentes del caballo de batalla de la red proteostática son nueve familias principales de chaperonas moleculares4. Cada tejido y tipo de célula utiliza preferentemente subconjuntos específicos de chaperonas moleculares, presumiblemente en alineación con las diferentes demandas de distintos proteomas5.
Un sello distintivo del envejecimiento normal del organismo es la disminución progresiva y el colapso de la proteostasis celular, que se cree que es una base subyacente para la aparición y progresión de un número creciente de enfermedades asociadas a la edad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) comparten una característica común: en cada caso, la manifestación de la neurodegeneración es impulsada por alteraciones genéticas que predisponen a una proteína mutante a la agregación (amiloide-β / Tau, α-sinucleína, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1, respectivamente)6,7,8,9,10 . Durante el envejecimiento, la integridad y la inducibilidad de la red proteostática disminuyen, lo que resulta en la acumulación de agregados proteotóxicos que resultan en disfunción celular y neurodegeneración. Cabe destacar que las enfermedades conformacionales de proteínas no son exclusivas de las neuronas y ocurren en múltiples tejidos, como lo destacan la diabetes tipo II, el mieloma múltiple y la fibrosis quística11,12,13,14. Por lo tanto, dilucidar mecanismos capaces de preservar la proteostasis facilitará el desarrollo de intervenciones específicas para el tratamiento de la enfermedad y para promover un envejecimiento saludable.
El pequeño nematodo del suelo Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha sido fundamental en el descubrimiento de genes y vías de elucidación que alteran la proteostasis. Muchos componentes de la red proteostática y las vías de transducción de señales que regulan la proteostasis se conservan evolutivamente. Además, C. elegans ha reducido la complejidad y la redundancia en relación con los sistemas de vertebrados, lo que lo hace más susceptible al análisis genético y al descubrimiento de genes. Las ventajas adicionales de C. elegans que lo han llevado a ser ampliamente utilizado como un sistema modelo para estudiar la proteostasis incluyen: una poderosa genómica genética y funcional, un ciclo de vida corto (3 días) y una vida útil (3 semanas), un genoma compacto y bien anotado, la disponibilidad de una amplia variedad de mutantes genéticos y la facilidad de visualizar cambios específicos de tejidos en la biología celular utilizando reporteros fluorescentes.
La desintegración progresiva de la proteostasis durante el envejecimiento se puede cuantificar fácilmente en C. elegans. El laboratorio Morimoto demostró por primera vez que una expansión de poliglutamina fusionada con la proteína fluorescente amarilla(polyQ::YFP)podría usarse para cuantificar la disminución proteostática en C. elegans durante el envejecimiento15,16,17,18. Las fusiones de YFP a 35 repeticiones de glutamina o más resultan en una formación asociada a la edad de focos fluorescentes junto con signos de patología celular. Cabe destacar que este rango de expansión de glutamina refleja la longitud del tracto de poliglutamina de la proteína Huntingtina en la que la patología de la enfermedad de Huntington comienza a observarse en humanos (típicamente >35 repeticiones CAG)19. Se han utilizado cepas con expresión de polyQ::YFP dentro de las células musculares, intestinales o neuronales para confirmar que la disminución de la proteostasis asociada a la edad ocurre en diferentes tipos de células y tejidos. La expresión de poliQ::YFP específica del músculo (es decir, unc-54p::Q35::YFP)ha sido el reportero específico de tejido más utilizado, ya que los focos fluorescentes acumulados son fáciles de cuantificar durante los primeros días de la edad adulta utilizando un microscopio de disección fluorescente simple(Figura 1A-1B). Además, los animales se paralizan durante la mediana edad, ya que el proteoma dentro del músculo colapsa debido al efecto proteotóxico del reportero(Figura 1C). Del mismo modo, la disminución asociada a la edad en la proteostasis neuronal puede ser seguida (rgef-1p::Q40::YFP) cuantificando directamente la formación de focos/agregados y las disminuciones asociadas a la edad en las curvas coordinadas del cuerpo después de colocar a los animales en líquido(Figura 2).
Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre cómo medir la progresión dependiente de la edad de la acumulación de agregados proteicos y la proteotoxicidad asociada inducida por la expresión de repeticiones de poliglutamina dentro del tejido neuronal y muscular en C. elegans. Proporcionamos ejemplos de resultados típicos generados utilizando estas cepas y métodos. Además, mostramos cómo hemos utilizado estos métodos para estudiar la regulación transcripcional de la red proteostática. Discutimos formas adicionales en que estos reporteros pueden integrarse fácilmente con otros reactivos existentes o adaptarse para pantallas más grandes.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultivo de 24 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Placas de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L Placas de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>replicador de placas de 96 pines</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>Junta de placa permeable al aire</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>agar bacteriológico</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>bactopeptona</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de clones de ARNi de C. elegans en bacterias HT115- Ahringer</td><td>Fuente: Bioscience</td><td>, C. elegans, RNAi Collection (Ahringer)</td><td>Véase también Kamath et. al, Nature 2003.</td></tr><tr><td>Biblioteca de clones de ARNi de C. elegans en bacterias HT115- Fuente Vidal</td><td>Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td><td>Véase también Rual et. al, Genome Research 2004. Esta biblioteca también está disponible en Dharmacon.</td></tr><tr><td>FuDR (5-fluoro-2'-desoxiuridina)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio de vidrio</td><td>VWR</td><td>48404-455</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio</td><td>VWR</td><td>160004-422</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil beta-D-1-tigalactopiranósido)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>Placa retangular de un solo pocillo sin tratar, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td>242811</tr><tr><td>Azida de sodio, CAS #26628-22-8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Axio Imager M2m con software AxioVision v4.8.2.0</td><td>Zeiss</td><td>desconocido</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Microscopio cuádruple</td><td>Zeiss</td><td>desconocido</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

La capacidad de mantener la función adecuada y el plegamiento del proteoma (homeostasis de proteínas) disminuye durante el envejecimiento normal, lo que facilita la aparición de un número creciente de enfermedades asociadas a la edad. Por ejemplo, las proteínas con expansiones de poliglutamina son propensas a la agregación, como se ejemplifica con la proteína huntingtina y la aparición concomitante de la enfermedad de Huntington. El deterioro del proteoma asociado a la edad ha sido ampliamente estudiado mediante el uso de Caenorhabditis elegans transgénicos que expresan repeticiones poliQ fusionadas a una proteína fluorescente amarilla (YFP). Este modelo animal transgénico polyQ::YFP facilita la cuantificación directa de la disminución asociada a la edad del proteoma a través de imágenes de la formación progresiva de focos fluorescentes (es decir, agregados de proteínas) y la posterior aparición de defectos de locomoción que se desarrollan como resultado del colapso del proteoma. Además, la expresión del transgén polyQ::YFP puede ser impulsada por promotores específicos del tejido, lo que permite la evaluación de la proteostasis a través de los tejidos en el contexto de un organismo multicelular intacto. Este modelo es altamente susceptible de análisis genético, proporcionando así un enfoque para cuantificar el envejecimiento que es complementario a los ensayos de vida útil. Describimos cómo medir con precisión la formación de focos poliQ::YFP dentro de las neuronas o el músculo de la pared corporal durante el envejecimiento, y la posterior aparición de defectos de comportamiento. A continuación, destacamos cómo estos enfoques se pueden adaptar para un mayor rendimiento y posibles aplicaciones futuras utilizando otras estrategias emergentes para el análisis genético de C. elegans.

En C. elegans,el modelo de repetición de poliglutamina ha sido fundamental para la identificación de genes que regulan la red proteostática. Por ejemplo, anteriormente demostramos que la proteína quinasa que interactúa con el homeodominio(hpk-1),un cofactor transcripcional, influye en la proteostasis durante el envejecimiento al regular la expresión de la autofagia y las chaperonas moleculares31. Encontramos que la pérdida de hpk-1,ya sea por silenciamiento de ARNi o en ...

El deterioro proteostático es un sello distintivo del envejecimiento, que facilita la aparición de enfermedades neurodegenerativas. Esbozamos un protocolo para medir cuantificablemente la proteostasis en dos tejidos diferentes de Caenorhabditis elegans a través de la expresión heteróloga de repeticiones de poliglutamina fusionadas a un reportero fluorescente. Este modelo permite un rápido análisis genético in vivo de la proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

El uso de la expresión tisular específica del reportero fluorescente de poliglutamina en C.elegans es significativo porque permite el descubrimiento y la caracterización de reguladores de la proteostasis en el contexto de un organismo multicelular intacto. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización y cuantificación de la disminución asociada a la edad en la proteostasis celular in vivo, lo cual es esencial para obtener una visión mecanicista más profunda de cómo los organismos mantienen el plegamiento y la función adecuados del proteoma y los efectos del envejecimiento. Elucidar mecanismos capaces de preservar la proteostasis facilitará el desarrollo de intervenciones dirigidas para el tratamiento de enfermedades asociadas al envejecimiento en las que la proteostasis está comprometida y para promover un envejecimiento saludable.El colapso de la proteostasis es un problema clínico masivo, ya que subyace al desarrollo de enfermedades de plegamiento erróneo de proteínas, como el Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica. Comience usando placas de Petri de 6 centímetros de diámetro para preparar cinco placas de ag

quantifying-tissue-specific-proteostatic-decline-caenorhabditis

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se presenta un protocolo general para medir la duración de la vida de los nematodos mantienen en medios sólidos con UV-muertos alimentaria bacteriana.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Este video muestra un ensayo basado en imágenes in vivo para determinar la disminución de la proteostasis debido al envejecimiento. El ensayo utiliza Caenorhabditis elegans que expresa la proteína de fusión de poliglutamina YFP en los músculos de la pared corporal para medir la agregación de poliglutamina asociada a la edad y la inducción de proteotoxicidad, lo que conduce a la parálisis.

Ensayo de parálisis fluorescente basado en reporteros: una técnica para evaluar la formación progresiva asociada a la edad de poliglutamina fluorescente reportera y la parálisis asociada en Caenorhabditis elegans

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

El músculo esquelético es esencial para la locomoción y es la tienda principal proteína de los cuerpos. Se describen las medidas de salud musculares dentro de C. elegans. Los posibles cambios en la estructura y la función muscular se evaluó a través de las buenas prácticas agrarias localizadas y colorantes catiónicos.

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en C. elegans

El método presentado aquí pretende explorar la agregación de proteínas durante el envejecimiento normal en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. El protocolo representa una poderosa herramienta para el estudio de los agregados grandes altamente insolubles que se forman con la edad y determinar cómo cambios en proteostasis impactan de agregación de la proteína.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

Aquí describimos el método Replica Set, un enfoque cuantitativo medida vida útil/supervivencia de C. elegans y healthspan en forma robusta y de alto rendimiento, permitiendo la proyección de muchas condiciones sin sacrificar la calidad de los datos. Este protocolo detalla la estrategia y proporciona una herramienta de software para análisis de datos de conjunto de réplica.

El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de RNA, DNA y proteínas de la misma muestra, en un esfuerzo por reducir la variación y mejorar la reproducibilidad, facilitar interpretaciones.

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

Aquí, introducimos y describimos un método noradioactivo y no invasivo para evaluar la síntesis de proteínas de novo in vivo, utilizando el nematodo Caenorhabditis elegans y la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Este método se puede combinar con pantallas genéticas y/o farmacológicas para identificar nuevos moduladores de la síntesis de proteínas.

Evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans

Aquí, se presenta un método para el análisis de la cinética de agregación de proteínas en el nematodo Caenorhabditis elegans. Los animales de una población sincronizada por edad se visualizan en diferentes puntos de tiempo, seguidos de un recuento de inclusión semiautomatizado en CellProfiler y se ajustan a un modelo matemático en AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans sirve como un excelente sistema modelo con métodos robustos y de bajo costo para estudiar la duración de la salud, la vida útil y la resistencia al estrés.

Encuesta de métodos de bajo costo para medir la esperanza de vida y la salud en Caenorhabditis elegans

Aprende a cuantificar el declive de la proteostasis en tejidos específicos de Caenorhabditis elegans mediante reportes fluorescentes de poliglutamina. Este método permite visualizar y medir la acumulación de agregados proteicos asociada al envejecimiento.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

Explorar más videos