Name: Uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas de óxido de hierro mediante sol-gel no acuoso y emplea magnetometría para monitorear su incorporación y biodegradación en células madre humanas. Este método permite cuantificar con precisión la magnetización celular y evaluar la transformación biológica de las nanopartículas en tiempo real.

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Este trabajo contó con el apoyo de la Unión Europea (proyecto ERC-2014-CoG MaTissE #648779). A los autores les gustaría reconocer la plataforma de caracterizaciones fisicoquímicas CNanoMat de la Universidad París 13.

1. Síntesis de nanopartículas magnéticas
<ol><li>Síntesis de núcleos – asistido por microondas<ol>
<li>Disolver 400 mg de acetiletonato de hierro (III) (>99,9%) en 10 ml de alcohol bencílico (BA, 99,8%) dentro de un vial de vidrio monowave de 30 ml.</li>
		<li>Aumente la temperatura de la suspensión de 25 a 250 °C en 20 min (a una velocidad de 11,25 °C/min) y mantenla a 250 °C durante 30 minutos utilizando un reactor microondas.</li>
		<li>Transfiera las nanopartículas resultantes suspendidas en alcohol bencílico a un vial de vidrio y separe las nanopartículas utilizando un imán de neodimio durante 30 min.</li>
		<li>Lave el precipitado en el vial de vidrio anterior de 100 ml con 10 ml de diclorometano, 1 M de hidróxido sódico, etanol, agua pH 7 (tres veces) utilizando un imán de neodimio durante 5 minutos cada paso para peletizar nanopartículas y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Ajuste la suspensión de nanopartículas en agua a pH 2 utilizando ácido clorhídrico de 1 M y, a continuación, centrífuga en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Retire el filtrado, agregue 12 ml de ácido clorhídrico de10-2 M a la solución de nanopartículas y centrífuga en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 min (tres veces). A continuación, diluya la solución de nanopartículas dentro de 10 ml de ácido clorhídrico de10-2 M antes de recubrimiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Capa<ol>
<li>Diluir 175 mg de ácido cítrico y ácido poliacrílico en agua a la pH 2 en un vial de vidrio de 100 ml y ajustar el pH a 2 con una solución de ácido clorhídrico de 1 M.</li>
		<li>Añadir las nanopartículas de 10 ml de dispersión acuosa a la solución de molécula de recubrimiento, correspondiente a una relación de masa de 5 entre la molécula de recubrimiento y las nanopartículas. Agitar durante 2 h bajo agitación magnética a temperatura ambiente.</li>
		<li>Después de la reacción, ajuste el pH a 7 con hidróxido de sodio de 1 M.</li>
		<li>Centrífuga la solución de nanopartícula 3 veces con agua desionizada (DI) en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 minutos; eliminar el filtrado y diluir la solución de nanopartículas en 12 ml de agua di.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultivo y etiquetado magnético de células madre
<ol><li>Cultivo de células madre mesenquimales humanas (MSC) en el medio de crecimiento completo de células madre mesenquimales (MSCGM) a 37 °C y 5% CO2. Cuando las células estén al 90% de confluencia, agregue 10 ml de trippsina-EDTA precalentada a 37 °C por matraz de 150 cm² y deje durante 2-3 minutos para separar las células.<ol>
<li>Para saber cuándo se separan las células, observelas con un microscopio de campo brillante. Resuspend las células separadas en MSCGM y divida en cuatro matraces de 150 cm². Amplificar las células de esta manera hasta el paso 4 a 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de nanopartículas magnéticas para el etiquetado celular: dispersar la concentración elegida de nanopartículas de óxido de hierro en el medio gratuito Roswell Park Memorial Institute (RMPI-1640) sin glutamina. RPMI se utiliza para la incubación de nanopartículas (y los pasos de enjuague relacionados) ya que tiene una fuerza iónica más baja que DMEM y previene mejor los eventos de agregación de nanopartículas.</li>
	<li>Cuando las células estén en el paso 4 o 5 y 90% confluentes, retire el medio MSCGM, enjuague las células con RPMI libre de suero (sin glutamina) y agregue 10 ml de solución de nanopartículas de óxido de hierro por 150 cm2 matraz de cultivo, que es el volumen mínimo necesario para cubrir todas las células.</li>
	<li>Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 30 min y luego desechar la solución de nanopartículas. Lávese una vez con RPMI-1640 libre de suero (sin glutamina) e incubar con el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina (25 ml por 150 cm2 matraz) durante la noche a 37 °C y 5% CO2 para permitir una internalización completa de las nanopartículas.</li>
</ol>3. Formación de esferoides de células madre
<ol><li>Preparar recién preparado medio de cultivo de esferoides celulares compuesto de DMEM alta glucosa con L-glutamina complementada con 50 μM L-ácido ascórbico 2-fosfato, 0.1 μM dexametasona, 1 mM de piruvato sódico, 0.35 mM L-proline, y 1% suplemento de cultivo universal que contiene insulina, transferrina humana y ácido seleno (ITS-Premix).</li>
	<li>Desenganche los MSC magnéticos añadiendo 10 ml de 0.05% trypsin-EDTA precalentado a 37 °C por 150 cm2 frasco durante 2-3 minutos. Cuando las células se desasocian, inactive inmediatamente la trippsina añadiendo 1/3 del volumen de DMEM complementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina precalentada a 37 °C.</li>
	<li>Centrífuga las células disociadas a 260 x g durante 5 minutos, aspirar el medio y volver a suspender las células en un volumen pequeño (menos de 1 ml por matraz de 150 cm²) del medio de cultivo esferoide celular, como tener 200.000 células en aproximadamente 50 μL de medio. Cuente el número de celda usando un hemociclo y ajuste el volumen si es necesario.</li>
	<li>Añadir 1 ml de medio de cultivo de esferoide celular recién preparado en un tubo centrífugo cónico estéril de 15 ml y añadir el volumen de solución resuspended correspondiente a 200.000 células.</li>
	<li>Centrífuga estas células etiquetadas magnéticamente a 180 x g durante 3 minutos, como formar un pellet celular en la parte inferior del tubo y mantener el sobrenadante, que es el medio de cultivo celular.</li>
	<li>Abra ligeramente los tubos para permitir el intercambio de aire e incubar a 37 °C con un 5% de CO2 durante un máximo de 21 días, tiempo de cultivo a lo largo del cual las células forman una estructura 3D cohesiva que resulta en un esferoide completamente formado. Cambie el medio dos veces por semana.</li>
	<li>En días dados, lave los esferoides dos veces con tampón de cacodilato hecho de cacodilato de 0,2 M diluido en agua desmineralizada y arréglalos usando 2% de glutaraldehído en 0,1 M de cacodilato diluido en agua destilada durante 30 min a temperatura ambiente. Almacene los esferoides fijos en PBS hasta que se utilicen para la medición VSM o imágenes TEM. Este paso de fijación detiene todos los procesos biológicos y permite la conservación a largo plazo.</li>
</ol>4. Cuantificación de nanopartículas magnéticas en solución y en celulo utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM)
<ol><li>Coloque un volumen dado de solución de nanopartícula magnética (máximo 10 μL) o un único esferoide de celda en el soporte de muestra diseñado específicamente para caber en el VSM.</li>
	<li>Inserte la muestra en el VSM y busque el desplazamiento de la muestra. Coloque la muestra en la posición correspondiente al máximo de magnetización.</li>
	<li>Realice la primera medición en un campo magnético bajo (entre -1500 Oe y +1500 Oe) con una velocidad de 20 Oe/s.</li>
	<li>Realice una segunda medición en un campo magnético alto (entre -30 000 Oe y +30 000 Oe) con una velocidad de 200 Oe/s.</li>
</ol>5. Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM)
<ol><li>Para las soluciones de nanopartículas, deposite 10 μL de la solución acuosa en una rejilla de cobre recubierta de carbono y déjela secar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para las nanopartículas interiorizadas en las células, contraste los esferoides celulares fijos con extracto de té Oolong (OTE) a 0.5% diluido en 0.1 M cacodilato buffer, post fix con 1% tetroxida de osmio que contiene 1.5% de cianoferato de potasio y luego deshidratar en baños de etanol calificados, incluido en Epon. Corta ultrasecciones de 70 nm y colócalos en rejillas de cooperación.</li>
	<li>Tome imágenes usando un microscopio electrónico a 80 kV con una ampliación de 1k para la observación de células enteras a 40k para la observación de compartimentos endosomales.</li>
</ol>

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<li>Van de Walle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+situ+magnetic+measurement+of+the+intracellular+biodegradation+of+iron+oxide+nanoparticles+in+a+stem+cell-spheroid+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model.</a> Nano Research. , (2020).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Utilizando una síntesis rápida y eficiente a base de microondas, las nanopartículas magnéticas se pueden sintetizar fácilmente, con tamaño controlado y recubiertas aún más con moléculas dadas. Un paso crítico es abastecer la sal de hierro y el alcohol bencílico bajo vacío para mantener una pequeña dispersión en tamaño. El alcohol bencílico actúa como disolvente y ligando al mismo tiempo permitiendo obtener directamente óxido de hierro desnudo calibrado sin necesidad de ligandos adicionales. Después de la transferencia de...

Hay un mayor interés en las características magnéticas de las nanopartículas de óxido de hierro para una amplia gama de aplicaciones biomédicas. Su respuesta a la resonancia magnética los convierte en agentes de contraste fiables para la resonancia magnética (RM), una ventaja en la medicina regenerativa donde las células etiquetadas con nanopartículas magnéticas pueden ser rastreadas in vivo después de la implantación1. Utilizando campos magnéticos, las células también se pueden guiar a distancia; de esta manera, los esferoides celulares2,3,anillos4,o hojas5 se pueden diseñar magnéticamente y también estimulado remotamente6,un activo en el desarrollo de tejidos sin andamios. La gama de posibilidades para estas nanopartículas también incluye sistemas de administración de fármacos7,8 y tratamiento hipertérmico magnético y fotoinducido para matar las células cancerosas9,10,11. Para todas estas aplicaciones, las nanopartículas se integran en el entorno biológico, ya sea mediante inyección intravenosa o a través de la internalización directa en las células y luego se dejan dentro, lo que pone en tela de juicio su destino intracelular.
Los análisis in vivo transmitieron una comprensión general del destino de las nanopartículas en el organismo: al inyectarse en el torrente sanguíneo, primero son capturadas en su mayoría por los macrófagos del hígado (células de Kupffer), bazo y médula ósea, se degradan progresivamente, y se unen a la piscina de hierro del organismo12,13,14,15,16,17,18,19. Las observaciones cualitativas sólo son posibles debido a la circulación de las nanopartículas en todo el organismo. Por lo general, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) se puede utilizar para observar directamente las nanopartículas y la presencia de hierro en los órganos se puede determinar a través de la dosificación. Más recientemente, su destino ha sido evaluado directamente en un conjunto de células, lo que significa en circuito cercano sin escape de hierro, permitiendo una medición cuantitativa de sus biotransformaciones a nivel celular20,21,22. Tales mediciones son posibles a través del análisis de las propiedades magnéticas de las nanopartículas que están estrechamente vinculadas a su integridad estructural. La magnetometría de muestras vibratorias (VSM) es una técnica en la que la muestra vibra periódicamente para que la medición de la bobina del flujo inducido proporcione el momento magnético de la muestra en el campo magnético aplicado. Dicha detección sincrónica permite una medición rápida, que es un activo para determinar los momentos magnéticos de un gran número de muestras20,21,22,23. La firma magnética macroscópica recuperada por VSM ofrece una visión cuantitativa de toda la muestra biológica directamente correlacionada con el tamaño y la estructura de las nanopartículas. En particular, proporciona el momento magnético en saturación (expresado en emú) de las muestras, que es una cuantificación directa del número de nanopartículas magnéticas presentes en la muestra, respectivamente a sus propiedades magnéticas específicas.
Se ha demostrado que el procesamiento intracelular de nanopartículas magnéticas está estrechamente vinculado a sus características estructurales20. Estas características se pueden controlar a través de protocolos de síntesis óptimos. Cada protocolo presenta ventajas y limitaciones. Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan comúnmente en soluciones acuosas a través de la coprecipitación de iones de hierro24. Para superar las limitaciones de la polidispersidad del tamaño de las nanopartículas, se han desarrollado otros métodos de síntesis como los métodos sol-gel mediados por poliol25. Los enfoques noaqueos por descomposición térmica conducen a la producción de nanopartículas de óxido de hierro muy bien calibradas26. Sin embargo, el uso de cantidades masivas de tensioactivos como la oleylamina o el ácido oleico complica su funcionalización y transferencia de agua para aplicaciones biomédicas. Por esta razón, sintetizamos tales nanopartículas magnéticas a través de una ruta de gel sol noaqueís que conduce a alta cristalina, pureza y reproducibilidad27. Este protocolo produce nanopartículas de tamaño bien controladas que se pueden ajustar a través de la variación de temperatura28. Sin embargo, la ruta sol-gel no acuosa asistida por microondas tiene un límite de tamaño superior de las nanopartículas obtenidas de alrededor de 12 nm. Este procedimiento no se adaptaría para aplicaciones que utilicen partículas ferromagnéticas a temperatura ambiente. Además de la síntesis del núcleo, otra característica principal a tener en cuenta es el recubrimiento. Acostado en la superficie de la nanopartícula, el revestimiento actúa como una molécula de anclaje, ayudando a la internalización específica de las nanopartículas, o puede proteger la nanopartícula de la degradación. Dado que el alcohol bencílico actúa como una fuente de oxígeno y un ligando al mismo tiempo, las nanopartículas desnudas se producen sin necesidad de tensioactivos o ligandos adicionales. Las nanopartículas se funcionalizan fácilmente después de la síntesis sin un proceso de intercambio de tensioactivos.
En este documento, se evalúan dos tipos de nanopartículas que poseen el mismo núcleo y difieren en el recubrimiento. El núcleo se sintetiza utilizando una técnica rápida y altamente eficiente basada en microondas. Los dos recubrimientos comparados consisten en ácido cítrico, uno de los más utilizados como agente de recubrimiento en aplicaciones biomédicas29,30,y ácido poliacrílico (PAA), un revestimiento polimérico con un alto número de funciones quelantes. Las mediciones de magnetometría VSM se utilizan primero para cuantificar la absorción de nanopartículas por las células, y luego como una evaluación directa de la integridad estructural de las nanopartículas al internalizarse en las células madre. Los resultados demuestran que la concentración de incubación afecta a la absorción de nanopartículas y que el recubrimiento influye en su degradación, con el gran número de moléculas de anclaje de PAA protegiendo el núcleo de la degradación.

<table><tbody><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol bencílico para síntesis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.22259</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Prepare una solución madre de 1 mM diluida en etanol al 100% y almacene a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Diclorometano &ge; 99% estabilizado, GPR RECTAPUR</td><td>VWR Chemicals</td><td>23367</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>Sin piruvato de sodio, sin HEPES</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td> Life <td>Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formalina 10% neutro tamponado</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, solución estandarizada 1.0N</td><td>Alfa Aesar</td><td>35640</td><td></td></tr><tr><td>acetilacetonato de hierro (III) (> 99.9%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517003</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Prepare una solución concentrada fresca (25 mM) diluida en agua destilada</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Prepare una solución madre de 175 mM diluida en agua destilada y almacene a 4 grados; C</td></tr><tr><td>Célula madre mesenquimal (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio monoonda</td><td>Anton Paar</td><td>82723_us</td><td></td></tr><tr><td>Reactor de microondas</td><td>Anton Paar</td><td>Monowave 300</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit medio</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Para el medio completo, agregue el BulletKit provisto (que contiene suero, glutamina y antibióticos) al medio MSCGM</td></tr><tr><td>PBS sin CaCl2 con o MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (10.000U/mL)/Estreptomicina (10.000&micro; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli(ácido acrílico, sal de sodio)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>416010</td><td>MW = 1200 g/mol</td></tr><tr><td>RPMI medio 1640, sin glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Sin piruvato de sodio, sin HEPES</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, 1.0N Solución estandarizada</td><td>Alfa Aesar</td><td>35629</td><td></td></tr><tr><td>Solución de piruvato de sodio 100mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico</td><td>estéril Falcon</td><td>352097</td><td>tubos de 15 mL</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Prepare una solución madre de 1 M diluida en agua destilada y almacene a 4 grados; C</td></tr><tr><td>Citrato trisódico dihidratado, certificado AR para análisis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10396430</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ultracentrífugo</td><td>Amicon</td><td>AC S510024</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Las nanopartículas magnéticas, hechas de óxido de hierro, presentan un interés peculiar para una amplia gama de aplicaciones biomédicas para las que a menudo se interiorizan en las células y luego se dejan dentro. Un desafío es evaluar su destino en el entorno intracelular con metodologías fiables y precisas. En este documento, introducimos el uso del magnetómetro de la muestra vibratoria (VSM) para cuantificar con precisión la integridad de las nanopartículas magnéticas dentro de las células midiendo su momento magnético. Las células madre se etiquetan por primera vez con dos tipos de nanopartículas magnéticas; las nanopartículas tienen el mismo núcleo producido a través de una síntesis rápida y eficiente de gel sol a base de microondas y difieren en su recubrimiento: la molécula de ácido cítrico comúnmente utilizada se compara con el ácido poliacrílico. La formación de esferoides celulares 3D se logra a través de la centrifugación y el momento magnético de estos esferoides se mide en diferentes momentos con el VSM. El momento obtenido es una huella digital directa de la integridad de las nanopartículas, con valores decrecientes indicativos de una degradación de las nanopartículas. Para ambas nanopartículas, el momento magnético disminuye con el tiempo de cultivo revelando su biodegradación. También se muestra un efecto protector del recubrimiento de ácido poliacrílico, en comparación con el ácido cítrico.

Utilizando la síntesis asistida por microondas, se producen y recubren nanopartículas magnéticas con un tamaño de núcleo monodisperse de 8,8 ± 2,5 nm con citrato o PAA (Figura 1A). A continuación, las células madre se incuban con estas nanopartículas dispersas en el medio de cultivo a una concentración determinada durante 30 minutos, lo que resulta en su endocitosis y confinamiento dentro de los endosomas celulares(Figura 1B). Las células madre magnéticas se sus...

Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan a través de un procedimiento de gel sol noaqueoso y están recubiertas con moléculas cortas aniónicas o polímero. El uso de magnetometría para monitorear la incorporación y biotransformaciones de nanopartículas magnéticas dentro de células madre humanas se demuestra utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM).

Uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Este video introduce un método rápido y eficiente para la síntesis de nanopartículas magnéticas y el uso de magnetometría para fotografiar la transformación en el entorno biológico. Las nanopartículas magnéticas han atraído una mayor atención para aplicaciones biomédicas, y es importante entender ese destino una vez interiorizado en las células. Esto se logra aquí midiendo el magnetismo celular.Tanto para la síntesis de nanopartículas magnéticas como para las mediciones, el resultado podría verse afectado por la contaminación. Utilice viales químicos bien limpiados y asegúrese de que el equipo del magnetómetro esté libre de contaminación. El soporte de muestras de magnetometría se utiliza generalmente para muestras de polvo.Mostramos cómo adaptar el uso del soporte a muestras líquidas o biológicas. En un vial de vidrio de onda de maná de 30 mililitros disuelve 400 miligramos de acetilcenato de hierro tres en 10 mililitros de alcohol bencílico. Usando un reactor de microondas, calienta la suspensión de 25 grados Celsius a 250 grados Celsius a una velocidad de 11.25 grados Celsius por minuto, y mantenla en 250 grados Celsius.Para separar las nanopartículas, aplique un imán de neodimio durante 30 minutos. Para peletizar las nanopartículas, realice una serie de lavados utilizando 10 mililitros del líquido de lavado designado y aplicando un imán de neodimio durante cinco minutos. Retire el filtrado y agregue 12 mililitros de 10 al menos dos ácido clorhídrico molar.Centrífuga la suspensión y un filtro de 100 kilodalton a 2.200 veces G durante 10 minutos. A continuación, resuspend las nanopartículas en 10 mililitros de 10 a menos dos ácido clorhídrico molar. Prepare la solución de molécula de recubrimiento como se describe en el manuscrito.Añada la dispersión acuosa de nanopartículas de 10 mililitros a la solución de molécula de recubrimiento a una proporción de masa de cinco a uno entre las moléculas de recubrimiento y las nanopartículas. A continuación, agitar la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente utilizando un agitador magnético. Una vez completada la reacción, ajuste el pH de la mezcla a siete utilizando un hidróxido de sodio molar.Cuando el cultivo de células madre mesenquimales humanas esté en el paso cinco y 90% confluente, retire el medio y enjuague las células con RPMI sin suero sin glutamina. A cada matraz de cultivo de 150 centímetros cuadrados, agregue 10 mililitros de la suspensión de nanopartículas. Incubar los frascos a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 30 minutos.A continuación, deseche el medio que contiene la suspensión de nanopartículas y lave las células una vez con RPMI 1640 libre de suero. Añadir DMEM complementado con 10%FBS y 1%penicilina estreptomicina. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono para permitir la internalización completa de las nanopartículas.Añadir 10 mililitros de 0.05% trypsin EDTA prewarmed para 37 grados Celsius a cada matraz de MSCs con etiqueta magnética. Después de dos a tres minutos, cuando las células se separan, inactivar inmediatamente la trypsin mediante la adición de un tercio del volumen de DMEM suplementado pre-advertido. Centrífuga las células separadas a 260 veces G durante cinco minutos.Aspirar el medio y resuspend las células en un pequeño volumen de medio de cultivo esferoide celular a una concentración de aproximadamente 200.000 células por cada 50 microlitros. Agregue un mililitro de medio de cultivo de esferoide celular recién preparado a un tubo centrífugo cónico estéril de 15 mililitros. A continuación, agregue un volumen de suspensión celular correspondiente a 200.000 celdas.Centrífuga estas células etiquetadas magnéticamente a 180 veces G durante tres minutos con el fin de formar un pellet celular en la parte inferior del tubo. Luego coloque el tubo en la incubadora a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono, manteniendo la tapa ligeramente abierta para el intercambio de gas. Coloque un volumen dado de nanopartícula magnética o una suspensión fija de una sola célula-esferoide en el magnetómetro de la muestra vibratoria, o VSM, soporte de muestra.Si es necesario, la cinta PTFE se puede utilizar para evitar cualquier fuga. Inserte el soporte de muestra en el VSM y busque el desplazamiento de la muestra. Coloque la muestra en la posición correspondiente al máximo de magnetización.Realice la primera medición en un campo magnético bajo entre 1.500 ersteds negativos y positivos 1.500 ersteds a una velocidad de 20 ersteds por segundo. Realice una segunda medición en un campo magnético alto entre cero ánadas y 30.000 ersteds positivos a una velocidad de 200 ersteds por segundo. 10 microlitros de nanopartículas dispersas en una solución acuosa se midieron en el magnetómetro vibratorio de la muestra.La pendiente de la segunda parte de la curva es la constante diamagnética, que representa la señal diamagnética del agua y el soporte de la muestra. Esta constante diamagnética fue restada del momento magnético de la solución para obtener el momento magnético de las nanopartículas solamente. A continuación, se determinó el momento magnético de saturación.Las nanopartículas recubiertas fueron interiorizadas en células madre. Las imágenes del microscopio electrónico muestran las nanopartículas recubiertas de citrato y recubiertas de PAA confinadas en los endosomas. Después de que las células fueron peletadas por centrifugación, formaron un esferoide celular que se puede mantener en cultivo durante largos períodos de tiempo.Los esferoides celulares individuales también se midieron usando el VSM y el momento magnético de saturación se utilizó para calcular la cantidad de nanopartículas en una muestra celular. Se encontró que la absorción de las nanopartículas dependía de su concentración de incubación. Una disminución en el magnetismo de los esferoides celulares con el tiempo indicó la biodegradación de las nanopartículas, que fue confirmada por microscopía electrónica.La degradación fue más sustancial en las nanopartículas recubiertas de citrato que en las nanopartículas recubiertas de PAA. Utilizando magnetometría, la degradación de las nanopartículas magnéticas dentro de las células se puede cuantificar con precisión, y se puede evaluar el impacto del futuro de las nanopartículas en los interesados en el comportamiento crudo. En este protocolo, las mediciones de magnetometría se realizaron en esferoides celulares, pero se pueden extender a las células en suspensión o a órganos.Con el método descrito, usted es capaz de explorar las interacciones de nanopartículas magnéticas de nuevo diseño en diferentes sistemas celulares de interés, pero también se puede seguir su biodistribución in vivo y el destino.

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Bioingeniería

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Etiquetado de las células madre con Ferumoxytol, uno de nanopartículas de hierro aprobada por la FDA de óxido

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Uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente (Video) | JoVE Journal

Uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente

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