Método de alto rendimiento para medir el tiempo de sedación del alcohol de la Drosophila melanogaster individual

Drosophila proporciona un excelente modelo para estudiar los fundamentos genéticos de la sensibilidad al alcohol, ya que se puede cuantificar la sensibilidad al alcohol precisamente bajo antecedentes genéticos controlados y condiciones ambientales. Métodos actuales para medir la sensibilidad al alcohol en los grupos de moscas de prueba de Drosophila. Presentamos un método simple, de bajo costo y alto rendimiento para evaluar la sensibilidad al alcohol en un gran número de moscas individuales.

La variación en la sensibilidad al alcohol en Drosophila se puede traducir a fenotipos similares en los seres humanos porque las moscas comparten alrededor del 75% de sus genes con ortologs humanos. El ensayo que desarrollamos también se puede aplicar para medir los efectos de la toxicidad aguda de los volátiles en otros insectos, incluyendo otras especies de moscas o vectores de enfermedades. Comience creando una plantilla de cartón de una placa de cultivo celular de 24 pozos.

Trace alrededor de la placa y corte el área designada. A continuación, utilice la plantilla de cartón para crear una pieza de malla de pantalla de insectos pequeño del tamaño de la placa. Coloque una pequeña línea de pegamento caliente alrededor del perímetro de una placa de cultivo de 24 pozos, y coloque la malla de la pantalla en la parte superior de los pozos.

A continuación, utilice la pistola de pegamento caliente para asegurar un palo de artesanía de madera a tres lados de la placa de cultivo. Prepare tantas placas como puedan caber en la cámara de filmación. Para crear la cámara de filmación, corte un agujero del tamaño de la lente de la cámara de vídeo en un lado de una caja de poliestireno y una ranura adicional en el tamaño de la almohadilla de iluminación en el lado opuesto.

Inserte la almohadilla de iluminación en la ranura y coloque la cámara en el orificio de la lente por encima de la almohadilla de iluminación. Coloque todos los materiales de prueba en un entorno controlado, preferiblemente una cámara de comportamiento con aproximadamente 30% de humedad, 25 grados de temperatura celsius, flujo de aire uniforme y niveles de ruido inferiores a 65 decibelios. Utilice la plantilla de cartón hecha anteriormente para cortar dos trozos de tela de queso.

A continuación, pipetear un mililitro de 100% etanol a través de la malla de la pantalla en cada pozo. Seque la malla y coloque las dos piezas de tela de queso en la parte superior. Corte una pequeña pieza de cartón de plástico fino, flexible utilizando la plantilla de cartón como guía para expandir el área de uno a dos centímetros en uno de los lados cortos.

Después del corte, asegúrese de que el plástico todavía cabe entre los tres palos de artesanía de madera en el aparato de prueba, pero cuelga de un extremo. Preparar un aspirador de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y utilizarlo para transferir una mosca por pozo en una placa de cultivo celular de 24 pozos, cubriendo cualquier pozo con moscas previamente aspiradas con el plástico flexible. Registre la posición del pozo y cualquier información relevante sobre el genotipo o el fenotipo de cada mosca.

Sostenga el plástico flexible al ras con la parte superior de la placa de cultivo celular que contiene las moscas, e invierta la placa en la parte superior de la placa de cultivo celular modificada con el etanol. Utilice los palos de la nave para alinear la placa de cultivo celular invertido, asegurándose de que cada pozo con el etanol se alinea con cada pozo que contiene una mosca. Asegúrese de que la almohadilla de iluminación esté encendida a pleno brillo y comience a grabar con la cámara de vídeo.

Exponga las moscas al etanol retirando cuidadosamente el plástico entre las dos placas, asegurándose de no desalojar la tela de queso. Cuando se sospeche que todas las moscas han perdido el control postural, toque firmemente en el centro de la placa. Si hay movimiento, continúe grabando, tocando cada uno o dos minutos hasta que no se produzca ningún movimiento.

Termine la grabación una vez que no haya movimiento. Para recuperar las moscas, retire la placa superior del aparato de prueba y aspire las moscas individuales en los contenedores elegidos. Reemplace el etanol en las placas de cultivo celular modificadas al menos una vez por hora para mantener una exposición constante al etanol durante todo el ensayo, y repita el experimento para tantas muestras como desee.

Vea la grabación de vídeo para determinar el tiempo de sedación de la mosca, que se define como el momento en que una mosca pierde el control postural y la capacidad locomotora. Para garantizar la precisión, vea la película en sentido inverso y registre el tiempo que la mosca comienza a moverse. Este método se puede utilizar para generar datos en un gran número de moscas en 10 minutos.

Se utilizaron dos placas de 24 pozos para medir simultáneamente los tiempos de sedación de etanol para 48 moscas individuales de dos líneas DGRP con diferentes sensibilidades al alcohol. Los tamaños de muestra grandes aumentan la precisión y reducen el error a la variación ambiental. RAL_555 moscas eran menos sensibles que las moscas RAL-177.

Los machos y las hembras de RAL_177 no mostraron ningún efecto sexualmente dimórfico, mientras que las hembras de RAL_555 de línea eran menos sensibles a la exposición al etanol que los machos. Al intentar este protocolo, es crucial realizar la aspiración de moscas y la inversión de la placa de cultivo celular con precisión para lograr el resultado deseado. Dado que la capacidad de evaluar moscas individuales evita efectos confusos debido a interacciones grupales, este ensayo mejora la utilidad del modelo Drosophila para estudios de alto rendimiento sobre los efectos agudos de la exposición al alcohol.