En Utero Electroporación de marcadores de color multiaconsejables integradores del genoma (MAGIC) para individualizar los astrocitos corticales del ratón

Los astrocitos azulejos de la corteza cerebral uniformemente, haciendo que el análisis de su morfología compleja desafiante a nivel celular. El protocolo proporcionado aquí utiliza etiquetado multicolor basado en electroporación de útero para señalar astrocitos corticales y analizar su volumen y morfología con una canalización de análisis de imágenes fácil de usar.

La electroporación intrauterina de MAGIC Marker es una técnica potente y versátil para individualizar y evaluar rápidamente la morfología de los astrocitos corticales. La principal ventaja de esta técnica en particular es etiquetar múltiples células progenitoras y la progenie neuronal y viral con un control preciso. Demostrando el procedimiento conmigo estará Karine Loulier, la investigadora principal de Antes de comenzar el procedimiento, esterilizar todas las herramientas quirúrgicas a alta temperatura en un esterilizador de perlas de vidrio.

Y coloque una gota de gel de electrodos en un plato de 35 milímetros. Inserte una micropipeta en un soporte de microinyección y rompa la punta de la micropipeta. Aspire la solución de ADN y coloque una gota de un microlitro de una solución verde rápida con una pipeta en la tapa de un plato de tres centímetros como referencia.

A continuación, añada un volumen de la micropipeta rota junto a la gota de referencia y reajuste el parámetro de presión o tiempo si es necesario; de modo que el micro inyector producirá las gotas de tamaño equivalente. Si el volumen es inferior al de referencia, vuelva a romper la punta de la micropipeta y repita. Para preparar a la rata preñada, después del pesaje y la inyección anestésica, confirmar la falta de respuesta en la rata hembra anestesiada y aplicar ungüento en los ojos del animal.

Afeitar suavemente el abdomen del ratón colocado en posición supina sobre una almohadilla térmica. Limpie la piel expuesta con una almohadilla empapada en yodo y otra empapada en alcohol. Y colocar compresas estériles alrededor de la zona quirúrgica afeitada, limpia y desinfectada del animal.

Cuando el ratón haya sido preparado, haga una incisión vertical de dos centímetros en la línea media en la parte inferior del abdomen. Y manipular suavemente las bolsas embrionarias para exponer los cuernos uterinos. Evaluar la ubicación del cuello uterino y el número de bolsas embrionarias a cada lado del cuello uterino.

Y orientar el cerebro del embrión del día 15,5 para que sea electroporado de modo que se pueda visualizar el brahma, que se reconoce fácilmente en la unión de los tres vasos sanguíneos principales que corren a lo largo de las fisuras cerebrales. Imaginando una línea virtual entre el brahma y el ojo, introduzca la micropipeta entre la línea virtual y la fisura longitudinal. A continuación, presione el pedal para administrar un microlitro de solución de ADN en el ventrículo lateral del hemisferio objetivo.

Un ventrículo inyectado con éxito aparecerá de color azul. Después de que se haya inyectado el ADN, aplique electrodos en ambos lados del embrión con el ánodo cubriendo el hemisferio inyectado. Presione el pedal del electroporador para entregar una serie de cuatro cargas de 50 milisegundos y 35 voltios, separadas por intervalos de 950 milisegundos.

A continuación, hidratar el embrión con solución salina tibia. Cuando todos los embriones objetivo hayan sido electroporados, regrese los cuernos uterinos al abdomen y llene la cavidad abdominal con solución salina tibia. Cierre el músculo abdominal con una sutura reabsorbible continua.

Y cerrar la piel con aproximadamente 10 puntos individuales de una sutura reabsorbible 4-0. Al final del procedimiento quirúrgico, coloque las suturas de piel regularmente a lo largo de la incisión. A continuación, coloque al animal en una jaula limpia con seguimiento hasta su completa recuperación.

La rata embarazada completamente recuperada debe tener un pelaje limpio y una incisión quirúrgica intacta. Para la obtención de imágenes confocales multicanal de los tejidos inyectados, configure el microscopio para la excitación de los láseres adecuados. Y localizar los astrocitos más brillantes en la zona electroporada.

Dado que las celdas etiquetadas más cercanas a la superficie pueden parecer más brillantes que las más profundas dentro del sector, ajuste la configuración de adquisición en las celdas de superficie para evitar saturar las imágenes, utilizando la tabla de búsqueda de alto y mínimo. Una imagen adecuadamente equilibrada debe mostrar solo unos pocos píxeles azules y casi ningún píxel rojo. A continuación, utilice la platina motorizada del microscopio para adquirir pilas Z en mosaico de 1024 por 1024 píxeles con una superposición del 10% entre las pilas adyacentes para permitir posteriormente reconstrucciones en mosaico del área electroporada o la zona de interés.

Los astrocitos marcados se pueden evaluar con imágenes confocales en mosaico adquiridas con un objetivo de 20x, 0.8na y ensambladas como reconstrucciones de pila Z como se demuestra. El contorno de los astrocitos individuales se puede delinear en cada sección óptica individual de las pilas de imágenes confocales para la segmentación y reconstrucción del dominio territorial ocupado por cada astrocito. A partir de las mismas pilas de imágenes Z, se puede segmentar la morfología de las ramas de los astrocitos corticales seleccionados mediante un software de acceso abierto que permite extraer el esqueleto de los principales procesos astrocitarios.

Una correcta hidratación durante la cirugía y antes de colocar la sutura de cierre es fundamental para impulsar la supervivencia de los embriones y la recuperación de la madre. La electroporación en el útero de la caja de herramientas MAGIC Marker se puede utilizar para etiquetar las células progenitoras en distintos modelos en etapas de valor de desarrollo para rastrear el linaje a la resolución de una sola célula.