Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

En brotes mediados por arbovirus, las contramedidas están en gran medida limitadas a la reducción de mosquitos. Por ello, los análisis de competencia vectorial son estrategias preventivas fundamentales, ya que determinan qué poblaciones y especies de mosquitos pueden actuar como vectores para un arbovirus determinado, y por ende deben ser objeto de intervención. Así, uno de los componentes más importantes en nuestra caja de herramientas para evaluar el papel de los mosquitos, y de otros vectores en la transmisión de enfermedades infecciosas, es el estudio de competencia vectorial. Estos son experimentos en los que podemos controlar con gran precisión no solo la especie de mosquito o garrapata, por ejemplo, sino también cepas geográficas, así como cepas muy específicas de un virus distinto u otro organismo infeccioso, para obtener datos precisos y bien controlados sobre el riesgo que representan diferentes especies en la transmisión de diversos agentes en zonas muy específicas del mundo. Trabajar con mosquitos infectados requiere instalaciones especializadas, formación, experiencia y una planificación cuidadosa para minimizar los riesgos para el experimentador, así como el peligro de que un mosquito infectado escape. Por tanto, es muy importante que las personas nuevas en estas instalaciones dediquen tiempo a trabajar con mosquitos alimentados con sangre no infectada, para familiarizarse con las técnicas y el flujo de trabajo.

El día de la exposición, encienda la fuente de alimentación en una instalación de contención de artrópodos para precalentar las unidades de alimentación. Combine sangre humana recién recolectada con citrato o heparinizada con un stock vírico en una proporción de volumen uno a uno, y cubra una unidad de reservorio estándar de tres mililitros con la piel de un ratón naïve no infectado. Coloque el reservorio cubierto sobre toallas de papel blanco y agregue aproximadamente dos mililitros de sangre infecciosa al reservorio, un mililitro a la vez.

Luego, inspeccione con toallas de papel para confirmar que no hay fugas. 24 horas antes de realizar el ensayo infeccioso, prepare placas de cultivo celular de 24 pocillos con células Vero y etiquete cada pocillo con la identidad del mosquito y la muestra. En la mañana en que los mosquitos serán expuestos a la comida sanguínea infecciosa, retire las bolas de algodón saturadas de agua y fije los depósitos con las comidas sanguíneas artificiales a las conexiones de la unidad de alimentación mediante una caja de contención de plástico transparente con guantes.

Coloque el cartón con los mosquitos hambrientos dentro de la cabina de guantes debajo de la unidad de alimentación. Una vez finalizada la alimentación, retire el reservorio e imérjalo en lejía al 10% recién preparada. Dentro de la cabina de guantes, vierta los mosquitos anestesiados con frío en una placa de Petri sobre hielo y separe los mosquitos saciados de los no saciados.

Vierta los mosquitos llenos de sangre nuevamente en el cartón, tapándolo rápidamente con una malla y su tapa. Recorte el exceso de malla del cartón y asegure la tapa con cinta adhesiva. Añada una bola de algodón saturada con sacarosa estéril filtrada al 10 % a la malla y coloque el cartón dentro de un recipiente plástico secundario grande que contenga una esponja húmeda para mantener la humedad.

Incube el recipiente secundario a 27 grados Celsius, permitiendo a los mosquitos acceso ad libitum a la sacarosa hasta la finalización de los experimentos. Utilice un aspirador mecánico para obtener un número predeterminado de mosquitos incubados del cartón, tapando el tubo de recolección con un trozo de algodón cuando termine. Trabajando dentro de la cabina de flujo laminar, vierta los mosquitos anestesiados con frío en una placa de Petri sobre hielo.

Retire todas las seis patas de cada mosquito y colóquelas en un tubo microcentrífugo de dos mililitros previamente etiquetado, con una bola de acero inoxidable esterilizada y 500 microlitros de medio de recolección de mosquitos, o MCM. Coloque suavemente el mosquito sobre una gota de aceite mineral, teniendo cuidado de que el aceite no entre en contacto con la cabeza ni con el probóscide del mosquito. Introduzca el probóscide en una punta de pipeta microdispensadora llenada con 10 microlitros de suero bovino fetal inactivado por calor y permita que el mosquito salive durante 30 minutos.

Expulse la punta de la pipeta con la saliva en un tubo microcentrífugo con 100 microlitros de MCM, y coloque el cadáver en un tubo separado de dos milímetros con la bola de acero esterilizada y 500 microlitros de MCM. Transporte los tubos a un dispositivo de homogenización tisular por molienda con perlas dentro de una cabina de seguridad biológica, y triture todas las muestras de cuerpo y patas a 26 hercios durante cinco minutos para liberar las partículas virales en el sobrenadante. Clarifique todas las muestras mediante centrifugación a 200 veces g durante cinco minutos para formar un sedimento con los restos celulares.

Inmediatamente antes de la inoculación con las muestras, retire el medio de las células Vero previamente preparadas. Aliquote cuidadosamente 100 microlitros de los sobrenadantes clarificados de los cuerpos o patas en cada pocillo, teniendo cuidado de no perturbar los restos celulares de mosquitos del botón. Luego, incube las placas durante una hora.

Después de la incubación, agregue un mililitro de recubrimiento de metilcelulosa a cada pocillo y devuelva las placas al incubador durante tres a siete días. Retire las placas de recubrimiento del incubador y llévelas a una cabina de seguridad biológica. Deseche el recubrimiento de metilcelulosa en una bandeja que contenga lejía al 10% y lave cada pocillo dos veces con PBS, descartando cada lavado en la bandeja.

Elimine el PBS y agregue un mililitro de metanol-acetona por pocillo, y deje que las células se fijen a la placa durante 30 minutos. Luego, deseche el fijador y deje secar las placas. Lave cada pocillo tres veces con PBS no estéril en un agitador orbital para placas durante 15 minutos por cada lavado, luego agregue un mililitro de solución bloqueadora a cada pocillo y agite la placa durante otros 15 minutos.

Añada 100 microlitros de anticuerpo primario anti-Virus del Zika o anti-flavivirus a cada pocillo e incube la placa con agitación durante la noche. Al día siguiente, retire el anticuerpo primario y repita los lavados con PBS. Después del último lavado, añada 100 microlitros de anticuerpos secundarios e incube la placa con agitación durante una hora.

Repita los lavados con PBS, luego agregue 100 microlitros de reactivo de desarrollo de sustrato por pocillo y agite la placa durante 15 minutos. Cuando se desarrollen los focos o placas, detenga la reacción enjuagando la placa con agua del grifo. Retire el agua del grifo y deje que las placas se sequen al aire, luego cuantifique los focos virales para determinar el número de unidades formadoras de focos presentes en la muestra dada.

Tres poblaciones de mosquitos fueron expuestas a una cepa brote del virus del Zika en un rango de títulos en la cena sanguínea. Durante las dos semanas siguientes, se procesaron subgrupos de mosquitos para determinar las tasas de infección, diseminación y transmisión potencial. En los títulos más bajos de la cena sanguínea, los mosquitos provenientes de Salvador, Brasil, presentaron infección tras 4, 10 y 14 días de incubación extrínseca, sin evidencia de infección diseminada observada en las patas analizadas.

En el título más alto, el virus se detectó en las patas de los mosquitos, pero no en la saliva. Los mosquitos procedentes de la República Dominicana resultaron ser los más susceptibles a la infección y los más competentes en transmisión en todos los títulos de la cena sanguínea ensayados. Los mosquitos alimentados con las tres dosis mostraron diseminación a los siete días y competencia para la transmisión a los 14 días posteriores a la infección.

Los mosquitos de la región del Valle del Río Grande en Texas, expuestos a títulos más bajos de la comida sanguínea, se infectaron tan pronto como cuatro días posteriores a la infección, mientras que se encontraron infecciones diseminadas después de 14 días. En el grupo expuesto al título más alto, la infección se observó a partir del segundo día posterior a la infección y alcanzó picos a los 4, 10 y 14 días. Las infecciones diseminadas se observaron a los siete días, y solo un mosquito fue capaz de transmitir a los 10 días.

Al intentar este protocolo, es importante trabajar de forma segura, en lugar de rápidamente. Por lo tanto, siempre manipule mosquitos infectados o potencialmente infectados dentro de una cabina de flujo laminar o una cabina de seguridad biológica, hasta que se les hayan retirado las patas o las alas. El flujo de trabajo básico de competencia vectorial puede adaptarse para producir mosquitos infectados destinados a análisis posteriores, como estudios de transmisión, así como para examinar las interacciones entre los mosquitos, el virus y el microbioma.

La competencia vectorial ha sido una herramienta realmente importante para comprender el papel de los mosquitos en la transmisión de virus durante epidemias de enfermedades virales, y esto ha sido cierto durante muchas décadas. Pero también es un método que ha evolucionado a lo largo de los años para incluir nueva información, conforme la vamos conociendo, sobre las interacciones entre estos virus y los vectores mosquíticos. Solo por mencionar dos ejemplos, la población genética del virus, la complejidad de la población dentro del mosquito resulta ser muy importante para su capacidad de transmisión, y ahora podemos incluir esto en estudios de competencia vectorial con nuevos métodos para secuenciar la población viral.

También sabemos ahora que la población de bacterias y otros organismos que viven en el tracto gastrointestinal del mosquito puede tener un impacto importante en su capacidad de transmisión, y ahora podemos evaluar esa población con nuevos métodos de secuenciación. Por lo tanto, la competencia vectorial es un método que ha evolucionado y continúa evolucionando a medida que aprendemos más sobre estas interacciones complejas.