Name: Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a analizar la competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika mediante experimentos controlados. Este método permite identificar poblaciones de vectores para estrategias de prevención de enfermedades.

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Reconocemos al personal del Centro de Referencia Mundial para Virus Emergentes y Arbovirus (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzmán, Dr. Kenneth Plante, Dra. Jessica Plante, Dionna Scharton y Divya Mirchandani, por su incansable trabajo en la curaduría y provisión de muchas de las cepas virales utilizadas para nuestros experimentos de competencia vectorial y de otros grupos. El trabajo presentado fue financiado por el McLaughlin Fellowship Fund (SRA) y las subvenciones de los NIH AI120942 y AI121452.

Todos los procedimientos realizados en estos protocolos se realizaron en pleno cumplimiento de los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston.
1. Amplificar ZIKV en células Vero
<ol><li>Cultivar células Vero (CCL-81 o VeroE6) en la modificación de Dulbecco del medio esencial mínimo (DMEM) de Eagle suplementado con 10% v/v de suero fetal bovino inactivado térmicamente (FBS) y 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina (100 U/mL y 100 μg/mL, respectivamente) en una incubadora humidificada de 37 °C con 5% de CO2 a entre 80-90% de confluencia en un matraz de cultivo tisular de 150 cm2.</li>
	<li>En un gabinete de bioseguridad (BSC), retire el medio y deséchelo en lejía al 10% o en una dilución de trabajo de amonio cuaternario dual(Tabla de materiales). Inocular inmediatamente la monocapa con 1 ml de material viral, con el objetivo de 0,1-1 partículas virales infecciosas por célula. Agitar el matraz inmediatamente de tal manera que el inóculo entre en contacto con la monocapa en su totalidad.</li>
	<li>Rellene el medio a un volumen de 5 ml usando DMEM suplementado con 2% v / v FBS inactivado por calor y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina. A continuación, mueva el matraz a la incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2 durante 60 min.</li>
	<li>Retire el matraz de la incubadora y llévelo a un BSC. Agregue un medio adicional a un volumen total de 15 ml usando DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 2% v / v y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina. Mueva el matraz a una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2.</li>
	<li>Examine el matraz diariamente bajo microscopía de contraste de fase para detectar evidencia de efectos citopáticos (CPE). Proceda a la cosecha viral (paso 1.7) cuando solo aproximadamente el 40-50% de las células permanecen en la monocapa, generalmente 3-5 días después de la infección, dependiendo de la cepa de ZIKV que se utilice.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y colóquelo en un vial cónico de 50 ml. Clarificar el sobrenadante de residuos celulares por centrifugación (3.500 x g durante 20 min). NOTA: Si varios matraces se infectaron de manera idéntica, los sobrenadantes de múltiples matraces se pueden combinar en tubos cónicos de 50 ml.</li>
	<li>Retire el sobrenadante del tubo cónico de 50 ml a uno nuevo, teniendo cuidado de no interrumpir el pellet. Complemente el sobrenadante con FBS inactivado por calor a una concentración final del 30% (v / v). Alícuota esta mezcla en tubos de tapón de rosca individuales y congele a -80 °C hasta su uso.</li>
</ol>2. Preparación de harinas de sangre artificiales
<ol><li>El día en que los mosquitos deben exponerse a las harinas de sangre infecciosas, encienda la fuente de energía (Tabla de Materiales) en una instalación de contención de artrópodos de tal manera que las unidades de alimentación (Tabla de Materiales) estén precalentadas para el momento en que los mosquitos estén preparados para la exposición.</li>
	<li>Prepare harinas de sangre artificiales utilizando uno de los métodos que se describen a continuación.<ol>
<li>Método 1: Combinar sangre humana recién cosechada (en el plazo de una semana) citrada o heparinizada comprada comercialmente 1:1 v/v con material viral (preparado como se describe en la sección 1). NOTA: Este método depende de la ausencia de anticuerpos contra la familia virus/virus presentes en la sangre.</li>
		<li>Si no se puede confirmar la ausencia de anticuerpos o se sabe que la fuente de sangre tiene una exposición previa al flavivirus, lave y empaque manualmente los eritrocitos.<ol>
<li>En un BSC, agregue 30 ml de sangre humana entera a un tubo cónico de 50 ml y rellene hasta 50 ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
			<li>Centrifugadora a 3.500 x g durante 20 min.</li>
			<li>Aspire el sobrenadante, ya sea vertiendo suavemente en una bandeja que contenga lejía al 10% o diluyendo de amonio cuaternario dual, teniendo cuidado de no desechar el gránulo de eritrocitos.</li>
			<li>Agregue 10 ml de PBS y golpee suavemente la parte inferior del tubo cónico contra la parte inferior del BSC de modo que el gránulo de eritrocitos se haya reconstituido. Lleve el volumen de la suspensión hasta 50 ml con PBS. Mezclar por inversión suave.</li>
			<li>Repita los pasos 2.2.2.1−2.2.2.4 un total de 4−6x. Confirme que el sobrenadante es transparente o solo ligeramente rosado y ya no es opaco. Retire todo el sobrenadante con una pipeta serológica. Resuspend el pellet de eritrocitos en 1−2 mL de PBS.</li>
			<li>Ensamblar la harina de sangre: 350 μL de eritrocitos empaquetados, 100 μL de sacarosa al 10%, 200 μL de FBS inactivado por calor, 900 μM de ATP recombinante y 2 ml de stock de virus adecuadamente diluido utilizando DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 2% v / v y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Superponga una unidad de reservorio estándar de 3 ml(Tabla de materiales)con la piel de un ratón no infectado (otras opciones incluyen película de parafina, membranas colágenas o envoltura de salchicha).</li>
	<li>Coloque el depósito cubierto sobre toallas de papel blanco. Agregue ~ 2 ml de harina de sangre infecciosa al reservorio 1 ml a la vez. Inspeccione la toalla debajo del comedero en busca de cualquier evidencia de fuga. Si hay fugas, recupere la harina de sangre de los comederos y deseche las cubiertas. Selle los alimentadores con tapones. Una vez más confirme que no hay fugas presentes.</li>
</ol>3. Backtitración de harinas de sangre/ensayo de placa
<ol><li>Usando el volumen restante de la harina de sangre preparada, realice una serie de dilución en serie de 10x (es decir, 6 diluciones, que van desde diluidas de 10x a 1,000,000x) usando DMEM suplementado con 2% v / v FBS inactivado por calor y 1% (v / v) penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Alícuota 100 μL de las diluciones en los pocillos de 24 o 12 placas de pocillos desde las más diluidas hasta las más concentradas.</li>
	<li>Incubar durante 1 h en una incubadora de 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Al final del período de incubación de 1 h, devuelva las placas al BSC y agregue 1 ml o 2 ml de superposición de metilcelulosa a las placas de 24 pocillos o 12 pocillos, correspondientemente.</li>
	<li>Coloque las placas superpuestas en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 3-7 días (dependiente de la cepa del virus).</li>
	<li>Después de la incubación, retire las placas de la incubadora y llévelas al BSC. Deseche la superposición de metilcelulosa en una bandeja que contenga lejía al 10% o desinfectante de amonio cuaternario dual.</li>
	<li>Lave cada pozo 2 veces con PBS, desechando el lavado en una bandeja que contenga 10% de lejía o amonio cuaternario dual.</li>
	<li>Agregue ~ 1 ml de metanol: acetona (1: 1 v: v) y permita que las células se fijen en la placa durante al menos 30 minutos en el BSC a temperatura ambiente (RT). Desechar metanol:acetona según la política institucional sobre residuos orgánicos.</li>
	<li>Visualice ZIKV utilizando uno de los dos métodos que se describen a continuación.<ol>
<li>Después de la eliminación de metanol: acetona, manche inmediatamente con una solución violeta cristalina (0.25% p/v en metanol al 30%) durante 5 min. Enjuague 2 veces en agua del grifo y deje secar, luego visualice directamente a ojo para detectar evidencia de placas o destrucción de monocapa.</li>
		<li>Alternativamente, realice un ensayo de formación de enfoque.<ol>
<li>Deje que las placas se sequen al aire hasta que no quede ningún fijador orgánico. NOTA: Esto debería tomar ~ 2-3 h fuera del BSC, pero puede acelerarse mediante el secado al aire en un BSC o una campana de humos químicos.</li>
			<li>Lave cada pozo 3x durante 15 min cada uno en PBS no estéril (Mg2+ y Ca2+ libres) en un balancín de placa orbital. Retire PBS y agregue 1 ml de solución de bloqueo (PBS + 3% FBS) a cada pozo y roca durante 15 minutos en RT.</li>
			<li>Añadir 100 μL por pocillo de α-ZIKV o anticuerpo primario contra el α-flavivirus (por ejemplo, hibridoma del grupo flavivirus D1-4G2-4-15 [4G2]) a una dilución de 1:2.000 en solución de bloqueo. Incubar con balanceo durante un mínimo de 4 h (preferiblemente durante la noche, no superior a 18 h) en RT.</li>
			<li>Retire el anticuerpo primario y lave 3 veces durante 15 minutos cada una con PBS (Mg2+ y Ca2+ libres) en un balancín de placa orbitaria.</li>
			<li>Añadir 100 μL por pocillo del anticuerpo secundario (marcado con HRP de cabra α ratón) diluido 1:2.000 en tampón de bloqueo. Incubar con balanceo durante 1 h en RT.</li>
			<li>Lave 3x durante 15 min cada uno con PBS (Mg2+ y Ca2+ libres) en un balancín de placa orbital.</li>
			<li>Alícuota 100 μL de reactivo de desarrollo de sustrato (Tabla de Materiales) por pozo. Placas de roca en RT durante 15 min.</li>
			<li>Detenga la reacción al desarrollo de focos / placas eliminando el sustrato y enjuagando las placas 2x con agua del grifo. Vierta el agua del grifo y deje que las placas se sequen al aire antes de cuantificar.</li>
			<li>Contar los focos virales para determinar el número de FFU presentes en la muestra dada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Administración de harinas de sangre
<ol><li>Use mosquitos Ae. aegypti 2-4 días después de la eclosión. Clasifique los mosquitos hembra en cartones de cartón de 0,5 L con tapas mosquitectadas y privarlos de azúcar (generalmente 36-48 h antes de la harina de sangre infecciosa). Proporcione agua ad libitum a través de bolas de algodón saturadas de agua.</li>
	<li>Retire las bolas de algodón saturadas de agua en la mañana en que los mosquitos estarán expuestos a la harina de sangre infecciosa.</li>
	<li>Conecte los depósitos que contienen harinas de sangre artificiales a los cables de la unidad de alimentación dentro de una guantera de plástico transparente.</li>
	<li>Dentro de la guantera, coloque un cartón de cartón de 0.5 L con una tapa apantallada, que contenga 50-100 mosquitos Ae. aegypti hambrientos, debajo de la unidad de alimentación conectada al reservorio. NOTA: Los mosquitos hambrientos apropiadamente generalmente se alimentarán dentro de los 20 minutos. La alimentación puede prolongarse según sea necesario para aumentar el tamaño de la muestra en poblaciones más lentas, aunque esto no debe extenderse más allá de 60 min, porque el título viral (ZIKV) puede disminuir dentro del alimentador después de ~ 60 min.</li>
	<li>Al finalizar la alimentación, retire el reservorio y sumérjalo en lejía al 10% recién hecha.</li>
	<li>Anestesiar en frío a los mosquitos mediante incubación durante 30 s a -20 °C o durante 5 min en un refrigerador.</li>
	<li>Dentro de la guantera, vierta los mosquitos en una placa de Petri sobre hielo. Cuente y clasifique las hembras congestionadas de mosquitos no comprometidos. Deseche los mosquitos no comprometidos por inmersión en un tubo cónico de 50 ml lleno de etanol al 70%. Mientras los mosquitos todavía están anestesiados, viértalos de nuevo en el cartón de cartón de 0,5 L y cúbralos rápidamente con la pantalla y la tapa. Recorte el exceso de malla de la pantalla de la caja de cartón y asegure la malla con cinta adhesiva.</li>
	<li>Agregue una bola de algodón saturada con sacarosa acuosa estéril filtrada al 10% a la pantalla de cada caja. Coloque todos los cartones de mosquitos en un recipiente secundario de plástico grande con una esponja húmeda para mantener la humedad.</li>
	<li>Coloque el recipiente secundario que contenga cajas de mosquitos en una incubadora con una temperatura de 27 ± 1 ° C (o según corresponda para simular condiciones en la región de interés) con un 80% de ± 10% de humedad relativa y un ciclo de luz: oscuridad de 16: 8). Mantenga los mosquitos con acceso ad libitum al 10% de sacarosa hasta la finalización de los experimentos.</li>
</ol>5. Adquisición y procesamiento de muestras
<ol><li>En los días específicos posteriores a la alimentación, aspire un número predeterminado de mosquitos de los cartones apropiados utilizando un aspirador mecánico dentro de una guantera. Cubra el tubo de recolección con una ronda de algodón después de adquirir el número requerido de mosquitos.</li>
	<li>Anestesiar en frío a los mosquitos mediante incubación durante 30 segundos a -20 °C o durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Dentro de la guantera, vierta los mosquitos en una placa de Petri sobre hielo. Usando dos pares de fórceps, retire las seis patas de cada mosquito y colóquelas en un tubo de microcentrífuga de fondo redondo preetiquetado de 2 ml que contenga un rodamiento de bolas de acero inoxidable esterilizado (7/32") y 500 μL de medios de recolección de mosquitos (MCM) compuestos de DMEM, FBS al 2%, penicilina-estreptomicina al 1% y anfotericina de 2.5 μg / ml.</li>
	<li>Coloque suavemente el mosquito sobre una gota de aceite mineral para contenerlo, teniendo cuidado de no permitir ningún contacto entre el aceite y la cabeza y la probóscide del mosquito.</li>
	<li>Inserte la probóscide del mosquito en una punta de pipeta de 10 μL llena de 10 μL de FBS inactivado por calor. NOTA: Alternativamente, la pipeta se puede llenar con sacarosa, sangre o aceite mineral. El aceite permite la visualización directa de las burbujas de saliva a través de la microscopía de luz.</li>
	<li>Deje que el mosquito saliva durante 30 minutos. Expulse la punta de la micropipeta que contiene FBS + saliva en un tubo de microcentrífuga que contiene 100 μL de MCM, luego coloque la carcasa en un tubo de microcentrífuga inferior redondo separado de 2 ml que contenga un rodamiento de bolas de acero esterilizado y 500 μL de MCM. Asegúrese de que los tubos utilizados para los cuerpos, las piernas y la saliva estén etiquetados para que quede claro que las tres muestras se originaron en el mismo mosquito.</li>
	<li>Mientras los mosquitos están salivando, realice los pasos 5.3-5.5 en los mosquitos restantes.</li>
	<li>Transportar los tubos que contienen los cuerpos y las patas a un dispositivo de homogeneización de tejido de fresado de cuentas contenido dentro de un BSC. Triturar todas las muestras de cuerpo y piernas a 26 Hz durante 5 minutos para liberar partículas virales en el sobrenadante. Clarificar todas las muestras por centrifugación a 200 x g durante 5 min para granular los residuos celulares. NOTA: En este punto, las muestras se pueden congelar a -80 ° C o ensayarse inmediatamente.</li>
</ol>6. Detección de ZIKV por ensayo infeccioso
<ol><li>En un BSC, prepare 24 placas de cultivo de tejido de pozo con células Vero (105 células por pozo) 24 h antes del inicio del ensayo infeccioso. Etiquete cada pozo con la identidad de un solo mosquito/muestra.</li>
	<li>Si las muestras se congelaron a -80 °C, deje que se descongelen.</li>
	<li>Retire los medios de las placas celulares Vero antes de la inoculación con muestras de una placa a la vez.</li>
	<li>Para muestras que contengan cuerpos o patas, alícuota cuidadosamente 100 μL de sobrenadante clarificado en cada pozo, teniendo cuidado de no molestar los restos de células de mosquitos del pellet. NOTA: Las muestras de saliva se pueden diluir 1: 1 (v / v) con MCM antes de la inoculación en las células para conservar las muestras para su posterior titulación, si es necesario.</li>
	<li>Mueva las placas a una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 1 h.</li>
	<li>Devuelva las placas al BSC y agregue ~ 1 ml de superposición de metilcelulosa a cada pozo. Coloque las placas superpuestas de nuevo en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 3-7 días (dependiente del virus/ cepa).</li>
	<li>Realice la fijación y la visualización como se describe en los pasos 3.6 a 3.9.</li>
	<li>Con respecto a la puntuación a través de un ensayo de formación de enfoque, cuantifique los pozos positivos mediante un examen bajo un microscopio de luz. La detección de tinción intracitoplasmática de células en un pozo indica la presencia del virus. Las muestras se puntúan únicamente como foco positivo o negativo.</li>
</ol>

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<li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li>
<li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li>
<li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li>
<li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).</li>
<li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fever+from+the+forest%3A+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li>
<li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos aquí proporcionan un flujo de trabajo generalizado para realizar análisis de competencia vectorial. Como marco general, muchas de estas metodologías se conservan a lo largo de la literatura. Sin embargo, hay un espacio sustancial para las modificaciones (revisado en Azar y Weaver1). Se sabe que el virus (por ejemplo, el linaje viral, el almacenamiento del virus de desafío, la historia del paso viral), la entomología (por ejemplo, la colonización de laboratorio de las poblacio...

La competencia vectorial se define como la capacidad a nivel de especie, población, e incluso un individuo, de un artrópodo dado, como un mosquito, garrapata o flebotomina, para adquirir y transmitir un agente biológicamente con replicación o desarrollo en el artrópodo1,2. Con respecto a los mosquitos y los virus transmitidos por artrópodos (es decir, arbovirus), el agente es absorbido de un huésped virémico por un mosquito hembra. Después de la ingestión, el virus debe infectar productivamente a una de una pequeña población de células epiteliales del intestino medio3,superando diversos obstáculos fisiológicos como la degradación proteolítica por enzimas digestivas, la presencia de la microbiota (barrera de infección del intestino medio, o MIB) y la matriz peritrófica secretada. La infección del epitelio del intestino medio debe ser seguida por la replicación del virus y el eventual escape del intestino medio al sistema circulatorio abierto del mosquito, o hemolinfa, que representa el inicio de una infección diseminada que supera la barrera de escape del intestino medio (MEB). En este punto, el virus puede establecer infecciones de tejidos secundarios (por ejemplo, nervios, músculos y cuerpos grasos) y continuar replicándose, aunque dicha replicación secundaria puede no ser estrictamente necesaria para que el virus infecte las células acinares de las glándulas salivales (superando la barrera de infección de las glándulas salivales). La salida de las células acinares de la glándula salival en sus cavidades apicales y luego el movimiento hacia el conducto salival permite la inoculación del virus en huéspedes posteriores al morder, y completa el ciclo de transmisión1,2,4,5,6,7.
Dado este mecanismo de propagación bien caracterizado y generalmente conservado dentro de un mosquito vector, las evaluaciones de competencia de vector de laboratorio son a menudo metodológicamente similares, aunque existen diferencias en los protocolos1,2. En general, después de la exposición oral al virus, los mosquitos se diseccionan para que los tejidos individuales como el intestino medio, las piernas, los ovarios o las glándulas salivales puedan ser evaluados para detectar infección viral, infección diseminada, infección diseminada / transmisión transovarial potencial e infección diseminada / competencia de transmisión potencial, respectivamente8. La mera presencia de un virus en las glándulas salivales, sin embargo, no es evidencia definitiva de capacidad de transmisión, dada la evidencia de una barrera de escape/salida de glándulas salivales (SGEB) en algunas combinaciones vector/virus1,2,4,5,7,9. El método estándar para demostrar la competencia de transmisión sigue siendo la transmisión de mosquitos a un animal susceptible10,11,12. Sin embargo, dado que para muchos arbovirus esto requiere el uso de modelos murinos inmunocomprometidos13,14,15,16, este método es a menudo prohibitivo. Una alternativa de uso común es la recolección de la saliva del mosquito, que puede analizarse mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) o un ensayo infeccioso para demostrar la presencia del genoma viral o partículas infecciosas, respectivamente. Vale la pena señalar que tales métodos de recolección de saliva in vitro pueden sobreestimar12 o subestimar17 la cantidad de virus depositado durante la alimentación in vivo, lo que indica que dichos datos deben interpretarse con precaución. Sin embargo, el método in vitro es muy valioso cuando se analiza desde la perspectiva de la mera presencia de virus en la saliva, lo que indica un potencial de transmisión.
Existen dos enfoques principales para determinar el papel de los mosquitos vectores en los brotes de enfermedades arbovirales. El primer método implica la vigilancia de campo, en la que los mosquitos se recogen en el contexto de la transmisión activa18,19,20,21,22,23,24. Sin embargo, dado que las tasas de infección suelen ser bastante bajas (por ejemplo, la tasa de infección estimada del 0,061% de mosquitos en áreas de circulación activa del virus del Zika (ZIKV) en los Estados Unidos21), la incriminación de posibles especies de vectores puede estar muy sesgada por la metodología de captura25,26 y el azar aleatorio (por ejemplo, tomar muestras de un individuo infectado de 1,600 no infectados)21 . Teniendo esto en cuenta, un estudio dado puede no adquirir suficientes mosquitos tanto en números brutos como en diversidad de especies para muestrear con precisión los mosquitos involucrados en la transmisión. Por el contrario, los análisis de competencia vectorial se llevan a cabo en un entorno de laboratorio, lo que permite un control estricto de parámetros como la dosis oral. Aunque no son totalmente capaces de representar la verdadera complejidad de la infección por mosquitos y la capacidad de transmisión en un entorno de campo, estas evaluaciones de laboratorio siguen siendo herramientas poderosas en el campo de la arbovirología.
Basándonos en varios análisis de competencia vectorial con ZIKV en varias especies de mosquitos, poblaciones y métodos27,28,29,30, 31,32,así como una revisión reciente de las evaluaciones de competencia vectorial1,describimos aquí varios de los protocolos asociados con un flujo de trabajo típico de competencia vectorial. En estos experimentos, tres poblaciones de Ae. aegypti de las Américas (la ciudad de Salvador, Brasil; la República Dominicana; y el valle inferior del Río Grande, TX, EE. UU.) fueron expuestas a una sola cepa de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a dosis de 4, 5 o 6 log10 unidades formadoras de enfoque (FFU) / ml por medio de harinas de sangre artificiales. Posteriormente, se analizaron en busca de evidencia de infección, infección diseminada y competencia de transmisión después de varios tiempos de incubación extrínseca (2, 4, 7, 10 y 14 días) mediante disección y un ensayo infeccioso basado en cultivo celular. Aunque el flujo de trabajo / protocolos actuales están optimizados para ZIKV, muchos elementos son directamente traducibles a otros arbovirus transmitidos por mosquitos en los niveles de contención y bioseguridad de artrópodos 2 y 3 (ACL / BSL2 o ACL / BSL3).

<table><tbody><tr><td>Depósito estándar de 3 ml</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipo de insectario</td></tr><tr><td>Acero inoxidable de 7/32" 440 bolas de grado C</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Medios de molienda</td></tr><tr><td>acetona, grado histológico, Fisher Chemicals, botella de polietileno, 4L, 4/caja</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fijador</td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato hidrato de sal disódica, microbiano, bioreactivo, apto para célula cultivo</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Anticuerpo antiantígeno del grupo Flavivirus, clon D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Anticuerpo primario para</td></tr> ensayo <tr><td>formador de foco Anticuerpo anti-ratón IgG (H+L), suero humano adsorbido y marcado con peroxidasa, 1,0 mL/frasco</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Anticuerpo secundario para ensayo formador de foco</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Descontaminación</td></tr><tr><td>Corning, Matraces tratados para cultivo celular, 150 cm2, tapón ventilado, caja de 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Consumible para cultivo celular</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular Costar, 24 pocillos, 5/bolsa, 100/caja, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Consumible para cultivo celular</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular Costar, 96 pocillos, 5/bolsa, 100/caja, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Consumible para cultivo celular</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td></td></tr><tr><td>Stain Eppendorf Snap Cap Microcentrífuga Safe-Lock 2mL Tubos, 500/Caja</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumible</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumible</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumible</td></tr><tr><td>Falcon Pipetas serológicas de poliestireno desechables de 10 ml, 200/caja</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Pipetas</td></tr><tr><td>serológicas de poliestireno desechables de poliestireno de plástico Falcon, 1000/caja</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Pipetas</td></tr><tr><td>serológicas de poliestireno desechables de plástico Falcon, 200/caja</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumible</td></tr><tr><td>Falcon Poliestireno desechable Pipetas serológicas de 5 ml, 200/caja</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumible</td></tr><tr><td>Falcon Platos de cultivo de tejidos estándar</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumible</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino-Premium, 500 ml</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Reactivo</td></tr> <tr><td>de cultivo celularPortaobjetos de microscopio de vidrio liso Fisherbrand Economy</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Inmovilización de mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Alimentador</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipos de insectario; unidades</td></tr><tr><td>de alimentación Gibco DPBS con Calcio y Magnesio, 10 botellas de 500 ml 140-040-182</td><td></td><td>FisherScientific</td><td>Reactivo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Anfotericina B, 250&mu; g/mL, 50mL/Frasco</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Reactivo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Gibco Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL), 100 mL/Frasco, 20 Frascos/Caja</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Reactivo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Gibco, tripsina-EDTA (.25%), rojo de fenol, 20 botellas de 100 ml</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Reactivo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, alto contenido de glucosa, 10 botellas de</td> <td>500 ml11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Reactivo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Sangre humana, género no especificado, Na-Citrato, 1 unidad</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Preparación de harina de sangre</td></tr><tr><td>Aspirador InsectaVac</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Equipo de insectario</td></tr><tr><td>Metanol, certificado ACS, Fisher Chemicals, Botella de vidrio ámbar, 4L, 4/caja</td><td>A412-4</td><td>Fijador</td><td></td></tr> <tr><td>FisherScientificMetilcelulosa, viscosidad: 3.500-5.600 cP, 2 % en agua (20 &deg; C), 250 g/botella</td><td>M0512-250 g</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reactivo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Detergente desinfectante</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Descontaminación; dilución de trabajo de amonio cuaternario dual</td></tr><tr><td>Aceite mineral, biorreactivo, para biología molecular</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Inmovilización de mosquitos</td></tr><tr><td>Juntas tóricas</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipo de insectario</td></tr><tr><td>Tapones de plástico</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipo de insectario</td></tr><tr><td>PS6 Unidad de potencia (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Equipo de insectario; fuente de alimentación</td></tr><tr><td>Pinzas Rubis, Cuchillas desplazadas, puntos superfinos</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Equipo de insectario</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Tapón de rosca Microtubo, Fondo Cónico, Tapa de junta tórica, Estéril, 1000/Caja</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plástico consumible</td></tr><tr><td>Sacarosa, BioUltra, para biología molecular</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&mu; L Puntas de pipeta, 100 puntas/gradilla, 8 gradillas/paquete, 4 paquetes/caja</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Consumible de plástico</td></tr><tr><td>ThermoScientific, barrera ART de baja retención 200&mu; L Puntas de pipeta, 96 puntas/gradilla, 10 gradillas/paquete, 5 paquetes/caja</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Consumible de plástico</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&mu; L Puntas de pipeta, 96 puntas/gradilla, 10 gradillas/paquete, 5 paquetes/caja</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Consumible de plástico</td></tr><tr><td>ThermoScientific, barrera ART de baja retención, alcance extendido 10&mu; L Puntas de pipeta, 96 puntas/gradilla, 10 gradillas/paquete, 5 paquetes/caja</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Tissue consumible de</td></tr><tr><td>plásticoLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogeneization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidasa Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Solución de desarrollo para el ensayo de formación de foco</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>Colección</td> <td>de cultivos tipo americanoLínea celular de mamífero para amplificar virus y realizar ensayos infecciosos</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clon E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection Línea</td><td>celular de mamíferos para amplificar virus y realizar ensayos infecciosos</td></tr></tbody></table>

análisis de competencia vectorial en mosquitos aedes aegypti con el virus zika

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Los procedimientos presentados describen una metodología generalizada para infectar a los mosquitos Aedes aegypti con el virus del Zika en condiciones de laboratorio para determinar la tasa de infección, la infección diseminada y la posible transmisión del virus en la población de mosquitos en cuestión. Estos procedimientos se utilizan ampliamente con diversas modificaciones en las evaluaciones de competencias vectoriales a nivel mundial. Son importantes para determinar el papel potencial que un mosquito dado (es decir, especie, población, individuo) puede desempeñar en la transmisión de un agente determinado.

Tres poblaciones de Ae. aegypti de las Américas (Salvador, Brasil; República Dominicana; y el Valle del Río Grande, TX, EE.UU.) estuvieron expuestas a una cepa de brote de ZIKV de las Américas (ZIKV Mex 1-7, Estado de Chiapas, México, 2015) en un rango de títulos de harina de sangre (4, 5 y 6 log10 FFU / ml) presentados en una harina artificial de sangre a base de eritrocitos humanos lavados. En los días 2, 4, 7, 10 y 14 después de la infección, se procesaron subconjuntos de mosquitos para determinar ...

El protocolo presentado puede determinar la competencia vectorial de las poblaciones de mosquitos Aedes aegypti para un virus determinado, como el Zika, en un entorno de contención.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

En brotes mediados por arbovirus, las contramedidas están en gran medida limitadas a la reducción de mosquitos. Por ello, los análisis de competencia vectorial son estrategias preventivas fundamentales, ya que determinan qué poblaciones y especies de mosquitos pueden actuar como vectores para un arbovirus determinado, y por ende deben ser objeto de intervención. Así, uno de los componentes más importantes en nuestra caja de herramientas para evaluar el papel de los mosquitos, y de otros vectores en la transmisión de enfermedades infecciosas, es el estudio de competencia vectorial. Estos son experimentos en los que podemos controlar con gran precisión no solo la especie de mosquito o garrapata, por ejemplo, sino también cepas geográficas, así como cepas muy específicas de un virus distinto u otro organismo infeccioso, para obtener datos precisos y bien controlados sobre el riesgo que representan diferentes especies en la transmisión de diversos agentes en zonas muy específicas del mundo. Trabajar con mosquitos infectados requiere instalaciones especializadas, formación, experiencia y una planificación cuidadosa para minimizar los riesgos para el experimentador, así como el peligro de que un mosquito infectado escape. Por tanto, es muy importante que las personas nuevas en estas instalaciones dediquen tiempo a trabajar con mosquitos alimentados con sangre no infectada, para familiarizarse con las técnicas y el flujo de trabajo.El día de la exposición, encienda la fuente de alimentación en una instalación de contención de artrópodos para precalentar las unidades de alimentación. Combine sangre humana recién recolectada con citrato o heparinizada con un stock vírico en una proporción de volumen uno a uno, y cubra una unidad de reservorio estándar de tres mililitros con la piel de un ratón naïve no infectado. Coloque el reservorio cubierto sobre toallas de papel blanco y agregue aproximadamente dos mililitros de sangre infecciosa al reservorio, un mililitro a la vez.Luego, inspeccione con toallas de papel para confirmar que no hay fugas. 24 horas antes de realizar el ensayo infeccioso, prepare placas de cultivo celular de 24 pocillos con células Vero y etiquete cada pocillo con la identidad del mosquito y la muestra. En la mañana en que los mosquitos serán expuestos a la comida sanguínea infecciosa, retire las bolas de algodón saturadas de agua y fije los depósitos con las comidas sanguíneas artificiales a las conexiones de la unidad de alimentación mediante una caja de contención de plástico transparente con guantes.Coloque el cartón con los mosquitos hambrientos dentro de la cabina de guantes debajo de la unidad de alimentación. Una vez finalizada la alimentación, retire el reservorio e imérjalo en lejía al 10% recién preparada. Dentro de la cabina de guantes, vierta los mosquitos anestesiados con frío en una placa de Petri sobre hielo y separe los mosquitos saciados de los no saciados.Vierta los mosquitos llenos de sangre nuevamente en el cartón, tapándolo rápidamente con una malla y su tapa. Recorte el exceso de malla del cartón y asegure la tapa con cinta adhesiva. Añada una bola de algodón saturada con sacarosa estéril filtrada al 10 % a la malla y coloque el cartón dentro de un recipiente plástico secundario grande que contenga una esponja húmeda para mantener la humedad.Incube el recipiente secundario a 27 grados Celsius, permitiendo a los mosquitos acceso ad libitum a la sacarosa hasta la finalización de los experimentos. Utilice un aspirador mecánico para obtener un número predeterminado de mosquitos incubados del cartón, tapando el tubo de recolección con un trozo de algodón cuando termine. Trabajando dentro de la cabina de flujo laminar, vierta los mosquitos anestesiados con frío en una placa de Petri sobre hielo.Retire todas las seis patas de cada mosquito y colóquelas en un tubo microcentrífugo de dos mililitros previamente etiquetado, con una bola de acero inoxidable esterilizada y 500 microlitros de medio de recolección de mosquitos, o MCM. Coloque suavemente el mosquito sobre una gota de aceite mineral, teniendo cuidado de que el aceite no entre en contacto con la cabeza ni con el probóscide del mosquito. Introduzca el probóscide en una punta de pipeta microdispensadora llenada con 10 microlitros de suero bovino fetal inactivado por calor y permita que el mosquito salive durante 30 minutos.Expulse la punta de la pipeta con la saliva en un tubo microcentrífugo con 100 microlitros de MCM, y coloque el cadáver en un tubo separado de dos milímetros con la bola de acero esterilizada y 500 microlitros de MCM. Transporte los tubos a un dispositivo de homogenización tisular por molienda con perlas dentro de una cabina de seguridad biológica, y triture todas las muestras de cuerpo y patas a 26 hercios durante cinco minutos para liberar las partículas virales en el sobrenadante. Clarifique todas las muestras mediante centrifugación a 200 veces g durante cinco minutos para formar un sedimento con los restos celulares.Inmediatamente antes de la inoculación con las muestras, retire el medio de las células Vero previamente preparadas. Aliquote cuidadosamente 100 microlitros de los sobrenadantes clarificados de los cuerpos o patas en cada pocillo, teniendo cuidado de no perturbar los restos celulares de mosquitos del botón. Luego, incube las placas durante una hora.Después de la incubación, agregue un mililitro de recubrimiento de metilcelulosa a cada pocillo y devuelva las placas al incubador durante tres a siete días. Retire las placas de recubrimiento del incubador y llévelas a una cabina de seguridad biológica. Deseche el recubrimiento de metilcelulosa en una bandeja que contenga lejía al 10% y lave cada pocillo dos veces con PBS, descartando cada lavado en la bandeja.Elimine el PBS y agregue un mililitro de metanol-acetona por pocillo, y deje que las células se fijen a la placa durante 30 minutos. Luego, deseche el fijador y deje secar las placas. Lave cada pocillo tres veces con PBS no estéril en un agitador orbital para placas durante 15 minutos por cada lavado, luego agregue un mililitro de solución bloqueadora a cada pocillo y agite la placa durante otros 15 minutos.Añada 100 microlitros de anticuerpo primario anti-Virus del Zika o anti-flavivirus a cada pocillo e incube la placa con agitación durante la noche. Al día siguiente, retire el anticuerpo primario y repita los lavados con PBS. Después del último lavado, añada 100 microlitros de anticuerpos secundarios e incube la placa con agitación durante una hora.Repita los lavados con PBS, luego agregue 100 microlitros de reactivo de desarrollo de sustrato por pocillo y agite la placa durante 15 minutos. Cuando se desarrollen los focos o placas, detenga la reacción enjuagando la placa con agua del grifo. Retire el agua del grifo y deje que las placas se sequen al aire, luego cuantifique los focos virales para determinar el número de unidades formadoras de focos presentes en la muestra dada.Tres poblaciones de mosquitos fueron expuestas a una cepa brote del virus del Zika en un rango de títulos en la cena sanguínea. Durante las dos semanas siguientes, se procesaron subgrupos de mosquitos para determinar las tasas de infección, diseminación y transmisión potencial. En los títulos más bajos de la cena sanguínea, los mosquitos provenientes de Salvador, Brasil, presentaron infección tras 4, 10 y 14 días de incubación extrínseca, sin evidencia de infección diseminada observada en las patas analizadas.En el título más alto, el virus se detectó en las patas de los mosquitos, pero no en la saliva. Los mosquitos procedentes de la República Dominicana resultaron ser los más susceptibles a la infección y los más competentes en transmisión en todos los títulos de la cena sanguínea ensayados. Los mosquitos alimentados con las tres dosis mostraron diseminación a los siete días y competencia para la transmisión a los 14 días posteriores a la infección.Los mosquitos de la región del Valle del Río Grande en Texas, expuestos a títulos más bajos de la comida sanguínea, se infectaron tan pronto como cuatro días posteriores a la infección, mientras que se encontraron infecciones diseminadas después de 14 días. En el grupo expuesto al título más alto, la infección se observó a partir del segundo día posterior a la infección y alcanzó picos a los 4, 10 y 14 días. Las infecciones diseminadas se observaron a los siete días, y solo un mosquito fue capaz de transmitir a los 10 días.Al intentar este protocolo, es importante trabajar de forma segura, en lugar de rápidamente. Por lo tanto, siempre manipule mosquitos infectados o potencialmente infectados dentro de una cabina de flujo laminar o una cabina de seguridad biológica, hasta que se les hayan retirado las patas o las alas. El flujo de trabajo básico de competencia vectorial puede adaptarse para producir mosquitos infectados destinados a análisis posteriores, como estudios de transmisión, así como para examinar las interacciones entre los mosquitos, el virus y el microbioma.La competencia vectorial ha sido una herramienta realmente importante para comprender el papel de los mosquitos en la transmisión de virus durante epidemias de enfermedades virales, y esto ha sido cierto durante muchas décadas. Pero también es un método que ha evolucionado a lo largo de los años para incluir nueva información, conforme la vamos conociendo, sobre las interacciones entre estos virus y los vectores mosquíticos. Solo por mencionar dos ejemplos, la población genética del virus, la complejidad de la población dentro del mosquito resulta ser muy importante para su capacidad de transmisión, y ahora podemos incluir esto en estudios de competencia vectorial con nuevos métodos para secuenciar la población viral.También sabemos ahora que la población de bacterias y otros organismos que viven en el tracto gastrointestinal del mosquito puede tener un impacto importante en su capacidad de transmisión, y ahora podemos evaluar esa población con nuevos métodos de secuenciación. Por lo tanto, la competencia vectorial es un método que ha evolucionado y continúa evolucionando a medida que aprendemos más sobre estas interacciones complejas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Un ensayo de bioluminiscencia de calcio para el análisis funcional de los Mosquitos ( Aedes aegypti) Y Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados a proteínas

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Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

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