Un enfoque de sobremesa para la ubicación específica de la barrera hematoencefálica que se abre con ultrasonido enfocado en un modelo de rata

El ultrasonido enfocado con agentes de microburbuja puede abrir la barrera hematoencefálica de forma focal y transitoria. Esta técnica se ha utilizado para entregar una amplia gama de agentes a través de la barrera hematoencefálica. Este artículo proporciona un protocolo detallado para la entrega localizada al cerebro de roedores con o sin orientación de RMN.

El ultrasonido focalizado en combinación con microburbujas circulantes se puede utilizar para proporcionar aberturas temporales de tamaño milimétrico en la barrera hematoencefálica. Esto permite la administración no invasiva de agentes que circulan sistémicamente a las regiones cerebrales objetivo. Para comenzar, llene el tapón del catéter con solución salina y caliente la cola de la rata con una lámpara, teniendo cuidado de no sobrecalentar al animal.

Inserte un catéter de vena de cola de calibre 24 que se utilizará para administrar microburbujas, tinte azul de Evans, contraste de resonancia magnética con gadobutrol si se usa resonancia magnética y el agente experimental de interés. La sangre llenará la vaina cuando se golpee la vena. Lentamente, retire la aguja interior mientras empuja la vaina más adentro de la vena.

Atornille el tapón del catéter en el extremo del puerto del catéter, tan pronto como el puerto se haya llenado de sangre. Envuelva cuidadosamente la cinta de laboratorio alrededor del catéter y la cola para mantenerlo en su lugar, comenzando con una pequeña pieza en la parte superior y trabajando en la dirección caudal. Deje expuesto el extremo del tapón del catéter.

Conecte la línea de anestesia al conector de anestesia en el marco estereotáctico. A continuación, fije la cabeza del animal en el marco colocando la boca en la barra de mordida y guiando las barras de las orejas hacia ambos canales auditivos y apretando los tornillos de fijación. Mueva al animal a la cama de resonancia magnética.

Utilizando los parámetros descritos en el texto, el manuscrito recopila imágenes coronales y axiales ponderadas en T2 que capturan todo el cerebro, así como la resonancia magnética fiducial para las mediciones de coordenadas. En las imágenes coronales, encuentre la imagen en la que el fiducial es el más grande, lo que indica el centro del fiducial. Registre la distancia desde la parte superior de la fiducial hasta la región de interés del cerebro en milímetros, tanto en la dirección medial-lateral como en la dirección dorsal-ventral.

En las imágenes axiales, busque la imagen que muestra la parte superior del fiducial y registre las coordenadas X e Y para el centro del fiducial y las coordenadas X e Y de la región cerebral de interés. Calcule la distancia desde el centro de la fiducial hasta la región objetivo del cerebro en las direcciones rostral-caudal y medial-lateral. Después de recopilar las coordenadas, recopile las imágenes previas al escaneo.

Manteniendo al animal en este marco estereotáxico, transpórtelo rápidamente desde la cama de resonancia magnética hasta la configuración de FUS de escritorio. Asegúrese de que el animal permanezca dormido bajo el efecto de la anestesia. Deslice el marco en el soporte del marco y sujételo firmemente en su lugar.

Use una maquinilla para afeitar la cabeza del animal, luego cepille el exceso de vello y aplique crema removedora de vello en el cuero cabelludo. Déjalo reposar durante tres minutos y límpialo con agua y gasa. Si utiliza la guía de resonancia magnética, coloque el puntero y muévalo a la ubicación del fiducial de resonancia magnética.

Coloque el puntero en la parte superior y central de la referencia de la resonancia magnética, que es el punto desde el que se calcularon todas las distancias en la imagen de resonancia magnética. Retire el puntero y mueva el posicionador a las coordenadas medial-lateral y a las coordenadas rostral-caudal. Lame el botón de posición nula y levante el posicionador presionando el botón hasta 50, para permitir la colocación del baño de agua y el gel de ultrasonido.

Aplique gel de ultrasonidos en el cuero cabelludo del animal y coloque el baño de agua sobre el animal, con la ventana de la cinta de poliimida presionada sobre el gel, asegurándose de que no haya burbujas de aire en el gel. Llene el baño de agua con agua desgasificada. Si utiliza el transductor de alta potencia, baje el posicionador de modo que el imán quede justo por encima del agua.

Conecte el transductor al posicionador bajando con cuidado el transductor en el agua en ángulo y conectando los imanes. Baje el posicionador a la coordenada dorsal-ventral y encienda el amplificador de potencia de RF. Inyecte un mililitro por kilogramo de tinte azul Evans al 3% introduciendo la punta de una aguja en el tapón del catéter e inyectando.

Todo el animal debe ponerse azul en cuestión de segundos, lo que indica que el catéter está colocado correctamente en la vena de la cola. Deje que el tinte circule durante cinco minutos, luego active las microburbujas agitándolas violentamente con el agitador de burbujas. Invierta esta jeringa varias veces para obtener una distribución uniforme de las microburbujas, luego conecte y llene el equipo de infusión alado.

Coloque la jeringa en la bomba de infusión y configure la bomba de infusión para que suministre 0,2 mililitros a una velocidad de seis mililitros por hora, proporcionando una infusión lenta de las microburbujas durante los dos minutos de exposición a la FUS. Inserte la aguja alada en el tapón del catéter. Primero haga funcionar la bomba de infusión, espere tres segundos, luego inicie el tratamiento FUS presionando el botón de encendido y en el generador de funciones.

Repita esto dos veces por región con cinco minutos entre ellos para permitir que las microburbujas se eliminen. Vuelva a pulsar el botón de encendido del generador de funciones para detener el tratamiento con FUS cuando la bomba de infusión se detenga a los dos minutos. Espere cinco minutos para que se eliminen las micro burbujas, luego comience la infusión y el segundo tratamiento FUS.

Inmediatamente después del segundo tratamiento con FUS, inyecte el contraste de gadobutrol y el agente de interés. El volumen total suministrado de todos los agentes no debe exceder los cinco mililitros por kilogramo. Para confirmar la apertura de la BBB, vuelva a colocar al animal en la cama de resonancia magnética exactamente en el mismo lugar y conecte la línea de anestesia.

Recoger las resonancias magnéticas posteriores a las exploraciones con los mismos parámetros de imagen que las imágenes previas a la exploración para confirmar la mejora de la resonancia magnética con gadobutrol en la región de la apertura de la BHE. Este protocolo se utilizó para inducir la apertura localizada de la barrera hematoencefálica tanto con el transductor de inmersión de baja potencia como con el transductor de ultrasonido focalizado de alta potencia. En primer lugar, el transductor de inmersión de baja potencia se dirigió al hemisferio cerebral anterior o medial.

Los animales fueron sacrificados con o sin perfusión, y la apertura de la BHE se visualizó a través de la autofluorescencia del tinte azul de Evans. En experimentos posteriores, el transductor FUS se dirigió al hipocampo o a la corteza cingulada anterior. Además del tinte azul de Evans, se utilizó el agente de contraste gadobutrol para la resonancia magnética para verificar la apertura específica de la BBB en VIVO.

Después de que los animales fueron sacrificados, la autofluorescencia con tinte azul de Evans confirmó la ubicación de apertura. Para evaluar si esta técnica podría usarse para la administración de genes dirigidos, se inyectaron nueve AAV que expresan proteína fluorescente verde y contraste de gadobutrol inmediatamente después de la apertura de la barrera hematoencefálica en el hipocampo. Se tomaron imágenes del animal para verificar la apertura con contraste de gadobutrol.

A continuación, se confirmó la entrega génica mediante la expresión de GFP. Este protocolo ofrece un enfoque de sobremesa para la apertura de la barrera hematoencefálica mediada por ultrasonido Focus guiada por RMN, que puede ser fácilmente adaptada por otros laboratorios para proporcionar una alternativa traslacional no invasiva a la cirugía estereotáctica.