Reconstrucción de firmas de fluorescencia innata unicelular mediante microscopía confocal

Esta técnica ofrece una investigación única para demostrar la identidad o las características fisiológicas de su célula a nivel de una sola célula sin la necesidad de un etiquetado invasivo. Las principales ventajas de esta técnica son que facilita la resolución espacial a nivel de una sola celda para su análisis, y que permite la distinción entre un proceso de fondo. Por lo tanto, esta técnica puede contribuir potencialmente a la identificación y el análisis fenotípico de microbios patógenos.

Esta técnica también se puede aplicar al estudio de la heterogeneidad fenotípica, o al seguimiento del estado fisiológico de la población microbiana de interés. Kyosuke Takabe, profesor asistente de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. La configuración de microscopía de reflexión confocal y microscopía confocal multicanal.

Conecte el microscopio confocal con canales espectrales desbarridos a un tubo fotomultiplicador. Equipar el microscopio con un objetivo de alta apertura numérica, con un aumento adecuado. Y equipe el microscopio con un espejo de semirreflexión para acomodar la microscopía de reflexión confocal, que se basa en la dispersión celular de la luz incidente para visualizar la morfología celular.

Para la microespectroscopia confocal multicanal, equipe el microscopio con espejos dicroicos y utilice un medidor de potencia láser para ajustar la intensidad de la iluminación para cada longitud de onda de excitación. A continuación, configure la salida bajo el microscopio para que sea constante a través de las longitudes de onda de excitación. Para obtener imágenes de las bacterias a través del microscopio, establezca el tamaño del orificio en 1,0 unidad de área en el software del microscopio y establezca el tiempo de permanencia de los píxeles para cada longitud de onda de excitación.

Establezca la resolución de escaneo. Para células pequeñas, como las bacterias, use un área de escaneo de 1024 por 1024. Establezca el rango de escaneo Z para que se cubra la región de interés.

Y usando una ventana espectral de ocho a 10 nanómetros, configure el detector D-Scan para capturar el rango de longitud de onda visible. A continuación, adquiera imágenes de microespectroscopía confocal multicanal en una secuencia de longitudes de onda de excitación más largas a más cortas para crear pilas Z de imágenes de fluorescencia e imágenes de microscopía de reflexión confocal, y guarde las imágenes en formato tiff de 16 bits. Para realizar la segmentación celular y la reconstrucción de firmas fluorescentes innatas de una sola célula, abra un programa de software de análisis de imágenes adecuado y haga doble clic para abrir uno de los scripts proporcionados.

En la pestaña del editor, haga clic en ejecutar. Aparecerá una ventana de selección de carpetas. Seleccione el directorio en el que se guardaron las imágenes de Z-Stack y haga clic en abrir.

Aparecerá automáticamente un cuadro de diálogo que solicita la entrada del parámetro de segmentación. Establezca el umbral de binarización de imágenes en 0-1, la binarización de imágenes en 0,45, el umbral superior para una región de celda en 200, el umbral inferior para una región de celda en 10 y el número de detectores en 32. Aparecerá un cuadro de diálogo solicitando la entrada del número de longitudes de onda de excitación.

Introduzca el número de longitudes de onda utilizadas para la adquisición de imágenes y haga clic en Aceptar. Aparecerá un cuadro de diálogo que solicita entrada para las longitudes de onda de excitación. Introduzca las longitudes de onda de excitación en secuencia de la más corta a la más larga y haga clic en OK.

Aparecerá una nueva ventana de imagen que presenta una imagen de microscopía de reflexión confocal. Seleccione una región de fondo arbitraria para utilizarla en la sustracción de fondo y dibuje un rectángulo dentro de la imagen de microscopía de reflexión confocal. Haga doble clic dentro de la región seleccionada para confirmar la selección y localizar un nuevo directorio llamado signature.

Para realizar técnicas de reducción dimensional, cree un directorio vacío y asigne un nombre parent_directory. Almacene las firmas fluorescentes de cada una de las dos poblaciones de células en dos directorios separados y abra la interfaz de línea de comandos de la estación de trabajo. Introduzca el comando.

Cuando se muestre seleccionar directorio de destino, seleccione el parent_directory. A continuación, en la carpeta parent_directory, localice el PCA. PNG, que contendrá el gráfico de análisis de componentes principales resultante.

Aquí, se muestra una firma fluorescente típica de una sola célula bacteriana presentada como un gráfico de espectro tradicional y como un mapa de calor. En esta figura, se puede observar una segmentación celular 2D inexacta superpuesta a la imagen original de microscopía de reflexión confocal de una población de bacterias del suelo. Con las firmas fluorescentes innatas resultantes para la población presentadas como un mapa de calor.

Nótese que la variabilidad intrapoblacional fue relativamente menor después de una segmentación celular exitosa. Aquí, se muestra un ejemplo de segmentación celular inexacta superpuesta a la misma población de P. putida como se mostró anteriormente. El impacto de la segmentación celular inexacta en las firmas fluorescentes innatas de la población es evidente a partir del considerable número de valores atípicos observados en el mapa de calor correspondiente.

La segmentación inexacta de células da como resultado un grupo más flexible después del análisis de componentes principales, en comparación con el grupo de tipos obtenido después de una segmentación de células precisa. A pesar de las pequeñas variabilidades de la firma fluorescente innata observadas dentro de las cepas bacterianas individuales, cada población forma un grupo distinto en el gráfico de análisis de componentes principales. En esta figura, se puede observar una segmentación celular 3D inexacta superpuesta a la imagen original de microscopía de reflexión confocal de una población de levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae YM4271.

Nótese la falta de valores atípicos y las firmas fluorescentes innatas resultantes para la población. Es esencial obtener una imagen lo más limpia posible por microscopía confocal y evitar una saturación de la intensidad de la señal, ya que el ruido puede estropear la precisión de los análisis posteriores. Puede entrenar modelos de aprendizaje automático con el conjunto de datos de firmas occidentales innatas para su uso en tareas de clasificación o predicción, lo que ofrece un análisis de población sin etiquetas y una predicción fenotípica.