Name: Modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende el modelo de inoculación en almohadilla plantar para estudiar respuestas neuroinflamatorias virales en ratones C57BL/6. Este método permite evaluar la cinética viral y procesos inmunopatológicos en el sistema nervioso periférico.

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Los autores reconocen a los laboratorios de Charles River por su excelente apoyo técnico en la ejecución de los análisis de histopatología. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) (RO1 NS033506 y RO1 NS060699). Los financiadores no tenían ningún papel en el diseño de estudios, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con un protocolo (número 2083-16 y 2083-19) revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Princeton. Este trabajo se realizó siguiendo estrictamente los requisitos de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), a los que tenemos un laboratorio totalmente equipado aprobado por el comité de bioseguridad de la Universidad de Princeton. Los procedimientos que incluyen la abrasión de la almohadilla del ratón, la inoculación viral, la disección de ratón y la recolección de tejidos se realizaron en un gabinete de seguridad biológica (BSC) en la sala de instalaciones de biocontención animal de la Universidad de Princeton. Aquellos que realizan el procedimiento llevaban batas desechables, cubierta para la cabeza, protección para los ojos, guantes estériles, máscaras quirúrgicas y fundas de zapatos.
1. Abrasión del teclado del ratón
<ol><li>Anestesiar un ratón C57BL/6 (5-7 semanas de edad) con anestésico de gas isoflurano, entregado a una dosis del 3% a través de un pequeño sistema de anestesia (cámara).<ol>
<li>Coloque el ratón en el plano quirúrgico de la anestesia en su espalda, antes de la inoculación, en el reposapiés trasero. Fije un cono nasal con un diafragma (una hendidura suficientemente grande para ajustar el hocico del animal) al ratón y entregue anestésico de gas isoflurano a una dosis constante de 1.5%–2.0%.</li>
		<li>Supervise de cerca el ratón para obtener una respuesta al estímulo doloroso creado por la pinza de la dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del objeto con fórceps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sujete ligeramente un pie trasero con fórceps planos.<ol>
<li>Abrasa suavemente la piel glabra de la almohadilla trasera aproximadamente 20x, entre el talón y las almohadillas para caminar, con una tabla de esmeril (100-180 de grano). No induzca el sangrado abrasando con demasiada frecuencia o aplicando demasiada presión.</li>
		<li>Usando fórceps finos, despegue lentamente el estrato córneo separado por abrasión para exponer el estrato basale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Inoculación de la almohadilla de pie PRV
<ol><li>Preparar el inóculo del virus diluido al título deseado en medios DMEM que contengan un 2% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina(Tabla de Materiales).<ol>
<li>Cantidade el número de unidades formadoras de placas (PFU) en el stock de virus en las células PK15 para calcular y estandarizar la dosis viral y diluir el inóculo viral en consecuencia. NOTA: En este estudio, se utilizó una cepa virulenta de PRV (PRV-Becker) a una dosis de 8 x 106 PFU. Esta dosis se optimizó en un experimento preliminar anterior para garantizar que todos los animales inoculados mostraran síntomas clínicos a 82 h después de la inoculación (hpi).</li>
		<li>Mantenga el inóculo del virus sobre hielo y mezcle suavemente antes de usarlo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir una gota de 20 l de inóculo del virus (8 x 106 PFU) a la almohadilla abrasada (administración tópica). Realice inoculaciones simuladas (solo medianas) en paralelo.</li>
	<li>Frote suavemente 10x con el eje de una aguja para facilitar la adsorción del virus. Evite rascarse con el punto de la aguja. Repita este paso cada 10 minutos.</li>
	<li>Mantenga el ratón bajo anestesia durante 30 minutos hasta que la almohadilla abrasada esté seca.</li>
	<li>Después de detener la anestesia, monitoree el ratón hasta que pueda mantener la recumbencia esternal y colóquelo en una jaula individual para el seguimiento clínico y el muestreo.</li>
</ol>3. Disección del ratón y recolección de tejidos
<ol><li>En los momentos apropiados después de la infección, eutanasiar el ratón por el método de asfixia (CO2). NOTA: En este estudio, el punto final humano (cuando los animales comienzan a presentar síntomas terminales) para los ratones infectados por PRV-Becker es de 82 hpi. Eutanasia los animales de control en paralelo.</li>
	<li>Coloque el lado ventral del ratón mirando hacia arriba sobre una estera quirúrgica usando agujas/pins. Asegure las extremidades del ratón con alfileres a una placa de espuma quirúrgica. Humedezca el lado ventral del ratón con 70% de etanol para minimizar la contaminación del pelaje.</li>
	<li>Pinche la capa externa de piel y piel usando fórceps y haga una pequeña incisión inicial usando tijeras finas cerca de la abertura uretral.<ol>
<li>Desde esta abertura, continúe la incisión en el lado ventral medio hasta la barbilla.</li>
		<li>Extienda dos incisiones laterales hacia las extremidades de las extremidades delanteras y posteriores.</li>
		<li>Separe la piel de la capa muscular subyacente y ancle hacia abajo hacia un lado.</li>
		<li>Abra la cavidad abdominal e incíme hasta la base del tórax. Completar la apertura de la cavidad abdominal realizando dos incisiones transversales.</li>
		<li>Abra la cavidad torácica cortando el diafragma y las costillas en ambos lados laterales. NOTA: Cortar los lados de la caja torácica evita el riesgo de cortar el corazón.</li>
		<li>Recoger órganos expuestos, incluyendo corazón, pulmones, bazo, páncreas, hígado, riñones y vejiga en microtubos de 1,5 ml. Mantenga los tubos en hielo.</li>
		<li>Corte la almohadilla abrasada entre el talón y las almohadillas para caminar y coloque el trozo de tejido en un tubo como se describe en el paso 3.3.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el lado dorsal del ratón hacia arriba y moje el pelaje con 70% de etanol. Corte la capa de la piel para exponer la columna vertebral.<ol>
<li>Haga una pequeña incisión en la región de la pelvis. Retire la piel de las extremidades posteriores hacia la cabeza.</li>
		<li>Retire las piernas y los brazos cortando con tijeras paralelas y cerca de la columna vertebral en ambos lados.</li>
		<li>Cortar la cabeza en la base del cráneo (nivel C1–C2).</li>
		<li>Abre el cráneo con tijeras desde el foramen magnum hasta el hueso frontal.</li>
		<li>Tire de abrir el cráneo en direcciones laterales utilizando fórceps.</li>
		<li>Saque suavemente el cerebro usando fórceps y proceda como se describe en el paso 3.3.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpie la columna vertebral cortando músculo, grasa y tejidos blandos usando tijeras curvas. Corta la cola. Coloque la columna vertebral intacta en un tubo de 15 ml que contenga solución salina estéril con fosfato frío helado (PBS). Mantenga los tubos sobre hielo hasta una mayor disección de la médula espinal y el DRG.</li>
</ol>4. Extracción de la médula espinal y el DRG
NOTA: Extraiga la médula espinal y el DRG de la columna de vértebras directamente después de la disección del ratón. El protocolo para la extracción de la médula espinal y la DRG ha sido adaptado de una publicación anterior7.
<ol><li>Retire la columna de vértebras del tubo PBS helado y retire los tejidos blandos restantes, lo que se vuelve más fácil después de la refrigeración.</li>
	<li>Realice tres cortes transversales en la columna a través de las vértebras (niveles T1, L1 y S2) utilizando una cuchilla de afeitar. Coloque las tres piezas en un plato de Petri de 15 mm que contenga PBS al hielo estéril. Realice un seguimiento y marque el origen de los segmentos para su posterior análisis.</li>
	<li>Tome un segmento y asegúrelo entre fórceps, lado dorsal hacia arriba. Haga un único corte longitudinal a través de la línea media usando una cuchilla de afeitar, dividiendo la columna en dos mitades iguales.</li>
	<li>Coloque ambas mitades en un nuevo plato de Petri que contenga un nuevo PBS estéril helado. Asegurar la orientación correcta del segmento para poder distinguir los lados izquierdo y derecho.</li>
	<li>Bajo un microscopio diseccionando, pela suavemente la médula espinal de la columna de las vértebras de cada mitad en una dirección rostral a caudal usando fórceps finos.</li>
	<li>Recoger ambas mitades de la médula espinal en microtubos de 1,5 ml que contengan 500 l de PBS estéril helado. Mantenga los tubos en hielo.</li>
	<li>Retire suavemente las meninges de un lado de la columna vertebral al otro para exponer el DRG.</li>
	<li>Retire cada DRG individualmente agarrando el nervio espinal expuesto y sácalo suavemente de la columna vertebral. Coloque el DRG recogido en un plato de Petri de 15 mm que contenga PBS helado. Cosecha todo el DRG ipsilateral y contralateral por separado del segmento de la columna vertebral y proceda como se describe en el paso 4.5. NOTA: El DRG es visible como una estructura transparente redonda a lo largo del nervio espinal blanco.</li>
	<li>Repita los pasos 4.3–4.7 usando los otros dos segmentos de columna vertebral dentro de 30–45 min.</li>
	<li>Centrifugar todos los tubos a alta velocidad (17.900 x g) durante 3 min a 4oC.</li>
	<li>Aspirar tubos de sobrenadantes y de congelación de flash en nitrógeno líquido. Almacene los tubos a -80 oC para una mayor homogeneización del tejido.</li>
	<li>Alternativamente, fije y seccione el DRG limpio y otros tejidos de ratón para análisis histopatológicos y/o tinción de inmunofluorescencia después del paso 4.9.</li>
</ol>5. Homogeneización de tejidos
<ol><li>Descongelar los tubos que contienen muestras de tejido congelado sobre hielo.</li>
	<li>Pesar 100 mg de tejido y colocarlo en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga un cordón de acero estéril y 500 l de tampón RIPA que contenga 0,5 M EDTA (pH a 8,0), 1 M Tris-HCl (pH a 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS e inhibidores de cócteles proteasas.</li>
	<li>Interrumpir los tejidos a temperatura ambiente (RT) utilizando un homogeneizador a 20 ciclos/s durante 2 min, seguido de un período de espera de 1 min, luego 20 ciclos/s durante 2 min.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a alta velocidad (17.900 x g)durante 10 min en RT.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante (500 l) en un tubo nuevo y almacenarlo a -20 oC hasta realizar ELISA y qPCR para cuantificar los marcadores inflamatorios y las cargas virales, respectivamente. NOTA: Para qPCR, recoja todas las muestras con material libre de RNase (es decir, perlas, tubos, etc.) y interrumpa los tejidos con tampón de lice yissis de ARN que contengan 1% de betamercaptoetanol(Tabla de materiales).</li>
</ol>6. Preparación y tinción de inmunofluorescencia de secciones DRG congeladas
<ol><li>Procesamiento de tejidos<ol>
<li>Fijar el DRG diseccionado y limpiado en 1% de paraformaldehído (PFA) durante 2 h en RT.</li>
		<li>Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con 10% de sacarosa en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.</li>
		<li>Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con una sacarosa del 20% en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.</li>
		<li>Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con una sacarosa al 30% en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.</li>
		<li>Incruste los tejidos en el PTU usando un criomold y coloque bloques en hielo seco para una rápida congelación.</li>
		<li>Conservar las muestras a -80 oC hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de criocisión<ol>
<li>Retirar el bloque congelado de -80 oC y dejar que se equilibre en la temperatura de la cámara del criostato durante 30 min.</li>
		<li>Cryosection el DRG a un espesor de 15 m y montar las secciones en diapositivas.</li>
		<li>Utilice una pluma para dibujar un círculo hidrófobo alrededor del tejido montado en la diapositiva.</li>
		<li>Mantenga los portaobjetos a 4 oC hasta que se manches.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tinción de inmunofluorescencia<ol>
<li>Lavar las secciones DRG 3x en PBS durante 10 min en RT.</li>
		<li>Incubar las secciones con 100 ml de anticuerpo primario deseado (p. ej., anticuerpo de ratón contra la glicoproteína B) durante 1 h a 37oC. Diluir el anticuerpo primario en PBS que contiene 10% de suero de cabra negativo.</li>
		<li>Repita el paso 6.3.1.</li>
		<li>Incubar las secciones con 100 ml de anticuerpo secundario deseado (antiratón de cabra Alexa Fluor 488) durante 50 min a 37oC. Diluir anticuerpo secundario solo en PBS.</li>
		<li>Añadir 100 l de colorante DAPI (4o,6-diamidino-2-fenilíndole) diluido en PBS en la sección. Incubar más muestras a 10 min a 37oC.</li>
		<li>Repita el paso 6.3.1.</li>
		<li>Monte las muestras utilizando un medio de montaje de fluorescencia en diapositivas de vidrio y asegúrela y cúbrala con cubreobjetos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Preparación y tinción H&E de secciones de tejido incrustadas en parafina
<ol><li>Fijar el tejido en 10% de formalina durante 24 h a 4 oC.</li>
	<li>Realizar un cronograma de procesamiento estándar para la incrustación de parafina y sección de tejidos fijos. Transfiera los tejidos fijos al 70% de etanol y procese a través de alcoholes mejorados al xileno seguido de parafina, como se describió anteriormente8. NOTA: Utilice esponjas de poliéster para mantener pequeñas muestras de tejido como DRG dentro de los casetes.</li>
	<li>Realizar la desparafinación estándar seguida de la tinción H&E de secciones de tejido, como se describió anteriormente9.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de inoculación de la almohadilla de pie descrito aquí es útil para investigar el inicio y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias durante la infección por alfaherpesvirus. Además, este modelo in vivo se utiliza para establecer la cinética de la replicación y propagación del alfaherpesvirus desde el PNS al SNC. Se trata de un suplente de otros modelos de inoculación, como el modelo de inoculación de la piel del flanco, que se basa en el rascado dérmico profundo13,o la ruta intracranea...

Este estudio describe un modelo de inoculación de la almohadilla para investigar la replicación y propagación de virus desde el PNS al SNC y las respuestas neuroinflamatorias asociadas. El modelo de inoculación de la almohadilla de pie se ha utilizado intensamente para estudiar la infección por alfaherpesvirus en las neuronas1,2,3. El objetivo principal de este modelo es permitir que los virus neurotrópicos viajen una distancia máxima a través del PNS antes de alcanzar el SNC. Aquí, este modelo se utiliza para obtener nuevos conocimientos en el desarrollo de una neuropatía particular (picazón neuropática) en ratones infectados con el virus pseudorabies (PRV).
El PRV es un alfaherpesvirus relacionado con varios patógenos conocidos (es decir, herpes simple tipo 1 y 2 [HSV1 y HSV2] y virus varicela-zoster [VZV]), que causan herpes labial, lesiones genitales y varicela, respectivamente4. Estos virus son todos pantrópicos y capaces de infectar muchos tipos de células diferentes sin mostrar afinidad por un tipo de tejido específico. Sin embargo, todos ellos exhiben un neurotropismo característico al invadir el PNS (y ocasionalmente, el SNC) de especies anfitrionas. El huésped natural es el cerdo, pero el PRV puede infectar a la mayoría de los mamíferos. En estos huéspedes no naturales, PRV infecta el PNS e induce un prurito severo llamado la "prurito loco", seguido de la muerte peraguta5,6. El papel de la respuesta neuroinmune en el resultado clínico y la patogénesis de la infección por PRV ha sido mal entendido.
El modelo de inoculación de la almohadilla de pie permite que el PRV inicie la infección en las células epidérmicas de la almohadilla. Luego, la infección se propaga a las fibras nerviosas sensoriales y simpáticas que inerpen la epidermis, las glándulas sudoríparas y la dermis. La infección se propaga por partículas de virus que se mueven a través del nervio ciático al DRG dentro de aproximadamente 60 h. La infección se propaga a través de la médula espinal, llegando en última instancia al cerebro trasero cuando los animales se vuelven moribundos (82 h después de la infección). Durante este período de tiempo, las muestras de tejido se pueden recoger, procesar y analizar para la replicación del virus y los marcadores de la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, el examen histológico y la cuantificación de la carga viral se pueden realizar en diferentes tejidos para establecer correlaciones entre la iniciación y el desarrollo de procesos clínicos, virológicos y neuroinflamatorios en la patogénesis del V PRV.
Utilizando el modelo de inoculación de la almohadilla, se pueden investigar los mecanismos celulares y moleculares del prurito inducido por PRV en ratones. Además, este modelo puede proporcionar una nueva visión de la iniciación y el desarrollo de la neuroinflamación inducida por el virus durante las infecciones por herpesvirus. Una mejor comprensión de los procesos subyacentes a las neuropatías inducidas por alfaherpesvirus puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras. Por ejemplo, este modelo es útil para investigar los mecanismos de la picazón neuropática en pacientes con lesiones post-herpéticas (por ejemplo, herpes zóster, herpes zóster) y probar nuevas dianas terapéuticas en ratones para las enfermedades humanas correspondientes.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-PRV gB</td><td>Fabricado por el laboratorio</td><td></td><td>Dilución 1/500</td></tr><tr><td>Aqua-hold2 bolígrafo pap rojo</td><td>Fisher scientific</td><td>2886909</td><td></td></tr><tr><td>Limas compactas de 24 unidades (limas de uñas de grano 100/180)</td><td>Revlon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete sin EDTA Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma-Aldrich 11836170001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones (5-7 semanas)</td><td>The Jackson Laboratorios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución DAPI (1 mg/ml)</td><td>Fisher scientific</td><td>62248</td><td>dilución 1/1000</td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno estéril desechable 100 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences SH30028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences SH30088</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras curvas finas acero inoxidable</td><td>FST</td><td>14095-11</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje Fluoromount-G</td><td>Fisher scientific</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formalina, tamponada neutra 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga 2ml</td><td>Microtubo de 1000945</td><td></td><td></td>Denville Scientific</tr><tr><td>1,5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72692005</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra negativo</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>154022</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de deslizamiento de precisión 18G</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar con respaldo de acero</td><td>Personna</td><td>9412071</td><td></td></tr><tr><td>tampón de lisis de ARN (RLT)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de acero inoxidable, 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos microscópicos Superfrost/plus Fisher</td><td>scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Lisador de tejidos LT</td><td>Qiagen</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>488 (cabra anti-ratón)</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>dilución 1/2000</td></tr></tbody></table>

modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

Este protocolo describe un modelo de inoculación de la almohadilla para pies utilizado para estudiar el inicio y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias durante la infección por alfaherpesvirus en ratones. Como los alfaherpesvirus son los principales invasores del sistema nervioso periférico (PNS), este modelo es adecuado para caracterizar la cinética de la replicación viral, su propagación desde el PNS al SNC, y las respuestas neuroinflamatorias asociadas. El modelo de inoculación de la almohadilla de pie permite que las partículas del virus se propaguen desde un sitio de infección primaria en la epidermis del pie a las fibras nerviosas sensoriales y simpáticas que invaden la epidermis, las glándulas sudoríparas y la dermis. La infección se propaga a través del nervio ciático a los ganglios de la raíz dorsal (DRG) y, en última instancia, a través de la médula espinal hasta el cerebro. Aquí, se inocula un reposapiés de ratón con el virus pseudorabies (PRV), un alfaherpesvirus estrechamente relacionado con el virus del herpes simple (VHS) y el virus de la varicela-zoster (VZV). Este modelo demuestra que la infección por PRV induce una inflamación grave, caracterizada por la infiltración de neutrófilos en el reposapiés y el DRG. Las altas concentraciones de citoquinas inflamatorias son posteriormente detectadas en tejidos homogeneizados por ELISA. Además, se observa una fuerte correlación entre el gen PRV y la expresión de proteínas (a través de la tinción qPCR e IF) en DRG y la producción de citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, el modelo de inoculación de la almohadilla de pie proporciona una mejor comprensión de los procesos subyacentes a las neuropatías inducidas por alfaherpesvirus y puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras. Además, el modelo puede guiar la investigación sobre neuropatías periféricas, como la esclerosis múltiple y el daño inducido por el virus asociado al PNS. En última instancia, puede servir como una herramienta in vivo rentable para el desarrollo de fármacos.

El modelo de inoculación del ratón para el reposapiés permite caracterizar la inmunopatogénesis de la infección por alfaherpesvirus in vivo, incluida la replicación y propagación de la infección desde la almohadilla inoculada hasta el sistema nervioso y la inducción de respuestas neuroinflamatorias específicas.
En este estudio, primero abrasamos el pie trasero del ratón y nos maglegráramos o inoculamos la región abrasada con una cepa virulenta de PRV (PRV-Becker). El sitio de abrasión era visi...

El modelo de inoculación de la almohadilla es una herramienta valiosa para caracterizar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por virus in vivo. En particular, proporciona una evaluación clara de la cinética viral y los procesos inmunopatológicos asociados iniciados en el sistema nervioso periférico.

Modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Este protocolo permite el estudio de la iniciación y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias en el sistema nervioso periférico del ratón durante una infección viral. Con este modelo, las infecciones viajan una mayor distancia desde la periferia hasta el sistema nervioso periférico y central, permitiendo una evaluación máxima de la cinética de la respuesta neuroinflamatoria. Después de colocar el ratón C57BL/6 anestesiado de cinco a siete semanas en la posición supina en una almohadilla quirúrgica, confirme una falta de respuesta al reflejo del pedal.Y usa una tabla de esmeril de 100 a 180 granos, para abrasar suavemente la piel glabra de una almohadilla trasera entre el talón y las almohadillas para caminar con alrededor de 20 pasadas de la tabla. A continuación, utilice fórceps finos para despegar lentamente el estrato córneo separado por la abrasión para exponer el estrato basale. Después de una mezcla suave, aplique tópicamente 20 microlitros del título apropiado del inóculo del virus en la almohadilla abrasada.Realizar inoculaciones simuladas con medio sólo en las almohadillas abrasadas de los animales de control en paralelo. Después de cada aplicación, frote suavemente la almohadilla 10 veces con el eje de una aguja para facilitar la adsorción del virus cada 10 minutos durante 30 minutos. Cuando la almohadilla de pie abrasada se seque, deje que los ratones se recuperen con monitoreo hasta la reclinación esternal antes de colocar los animales en jaulas individuales para el seguimiento clínico y el muestreo.En los puntos de tiempo experimentales apropiados, recoja los órganos expuestos al virus, incluidos el corazón, los pulmones, el bazo, el páncreas, el hígado, los riñones y la vejiga en microtubos individuales de 1,5 mililitros en hielo. Luego cosecha las almohadillas abrasadas entre el talón y las almohadillas para caminar y coloca las muestras en microtubos individuales de 1,5 mililitros sobre hielo. A continuación, coloque el ratón en la posición propensa y moje el pelaje con 70% de etanol.Para exponer la columna vertebral, haga una pequeña incisión en la región de la pelvis y despoje la piel de las extremidades posteriores hacia la cabeza. Para quitar las extremidades delanteras y traseras, utilice tijeras para cortar paralelas y cercanas a la columna vertebral en ambos lados. Y retire la cabeza en la base del cráneo.Usa las tijeras para abrir el cráneo desde el foramen magnum hasta el hueso frontal. Y usa fórceps para abrir el cráneo en una dirección lateral. Luego usa los fórceps para sacar suavemente el cerebro y colocar el cerebro en un microtubo de 1,5 mililitros sobre hielo.Usa tijeras curvas para limpiar la columna vertebral del músculo, la grasa y el tejido blando, y elimina la cola. A continuación, coloque la columna vertebral intacta en un tubo de 15 mililitros de PBS frío enfriado estéril en hielo durante no más de tres horas. Después de la disección, transfiera la médula espinal a una placa de cultivo de tejido para permitir la extracción de cualquier tejido blando restante.Utilice una cuchilla de afeitar para hacer tres cortes transversales a través de la columna vertebral en las vértebras S2, L1 y T1. Transfiera las piezas a platos individuales de 15 milímetros que contengan PBS estéril helado. Realizar un seguimiento y marcar los orígenes de los segmentos para su posterior análisis.A continuación, utilice fórceps para asegurar un lado dorsal de segmento hacia arriba y utilice una cuchilla de afeitar para hacer un solo corte longitudinal a través de la línea media para dividir la columna en dos mitades iguales. Coloque ambas mitades en un nuevo plato de Petri que contenga PBS frío helado fresco y estéril en la orientación original para poder distinguir los lados izquierdo y derecho de la columna vertebral. Bajo un microscopio diseccionando, utilice fórceps finos para pelar suavemente la médula espinal de cada mitad de la columna vertebral en una dirección rostral a caudal.A continuación, coloque ambas mitades de la médula espinal en microtubos individuales de 1,5 mililitros que contengan 500 microlitros de PBS frío enfriado estéril sobre hielo. Para exponer el ganglio de la raíz dorsal, retire suavemente las meninges de un lado de la columna vertebral al otro. Y saca el nervio espinal blanco expuesto de la columna vertebral.Cosecha el ganglio de raíz dorsal redondo y transparente del segmento de la columna vertebral en un plato Petri de 15 milímetros de PBS helado. Y recoger el ganglio de raíz dorsal ipsilateral y contralateral como acaba de demostrar. Después de cosechar el nervio espinal y el ganglio de la raíz dorsal de los otros dos segmentos de la columna vertebral como se acaba de demostrar, centrifugar todos los tubos de tejido a alta velocidad.A continuación, aspirar los sobrenadantes y congelar las muestras en nitrógeno líquido, y almacenar en menos 80 grados Celsius hasta la homogeneización. Para la homogeneización de tejidos, descongele los tubos de tejido congelado sobre hielo antes de pesar 100 miligramos de cada muestra. Transfiera a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga perlas estériles y 500 microlitros de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación.A continuación, interrumpir los tejidos a temperatura ambiente en un homogeneizador a 20 ciclos por segundo durante dos minutos, seguido de un período de espera de un minuto, y 20 ciclos por segundo durante dos minutos adicionales. Después de la segunda ronda de homogeneización, centrifugar los tejidos a alta velocidad antes de transferir 500 microlitros de cada sobrenadante a un nuevo tubo debidamente etiquetado. Conservar a menos 20 grados Celsius hasta el análisis posterior.El sitio de abrasión es visible en la almohadilla de control. Y es típico que se forme una corteza en el sitio de abrasión como parte del proceso de curación. Por el contrario, los ratones inoculados con pseudorabies, demuestran una inflamación grave de la almohadilla en el punto final humano que se caracteriza por hinchazón y enrojecimiento.El examen histopatológico de la almohadilla de pie inoculada y el ganglio de raíz dorsal revela necrosis epidérmica e inflamación dérmica grave dentro de las secciones de los pies infectados. La infiltración de neutrófilos también se observa en pseudorabies infectados DRG secciones. Se mide un aumento significativo en la expresión de proteína G-CSF en el footpad y el ganglio de raíz dorsal de los ratones infectados por pseudorabies en comparación con los controles de siete y 82 horas después de la infección.Niveles significativos de G-CSF también se observan a las 82 horas después de la infección en la médula espinal, cerebro, corazón, y los tejidos hepáticos de pseudorabies ratones infectados en comparación con los controles. Además, se detectan niveles significativos de IL-6 en todos los tejidos probados de pseudorabies ratones infectados a partir de las 24 horas después de la infección. En un estado moribundo, se detectaron pseudorabies en el bloc de notas, ganglio de raíz dorsal, médula espinal y cerebro.Con la alta expresión citoplasmático de psuedorabies glicoproteína gB en las neuronas del ganglio de raíz dorsal en pseudorabies ratones infectados. Para asegurar una infección exitosa, es importante que la gota de virus en una columna no caiga de la almohadilla de pie abrasada. Este modelo animal puede servir plataforma para probar la eficacia de los medicamentos antiinflamatorios y antivirales con el fin de prevenir las neuropatías periféricas inducidas por el virus.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El video demuestra la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón mediante la inyección de una combinación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina y Mycobacterium tuberculosis inactivada. El modelo permite a los investigadores estudiar los mecanismos de la enfermedad y probar intervenciones terapéuticas.

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

Este video muestra la generación de un modelo de ratón con una infección en el SNC. A una cría lactante se le inyecta el virus tanto por vía intracraneal como intraperitoneal. El virus se propaga, infectando el SNC causando la muerte de las células neuronales y la inflamación. El cachorro es evaluado para detectar síntomas de infección a medida que la enfermedad progresa.

Generación de un modelo murino con una infección del sistema nervioso central

Este video muestra la generación de neuroinflamación en un modelo de ratón. Se toma un ratón anestesiado con microheridas y se aplica un inóculo del virus de la pseudorrabia (PRV) en las heridas. El virus infecta los nervios periféricos, se propaga a los ganglios de la raíz dorsal (DRG) e infecta aún más la médula espinal y el cerebro. La infección de las neuronas del sistema nervioso provoca una respuesta inmunitaria que induce daño neuronal, lo que conduce a la neuroinflamación.

Generación de neuroinflamación inducida por virus en un modelo de ratón

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Este video muestra el proceso de evaluación de la disfunción motora en un modelo de ratón mediante la administración de toxina de tos ferina y un inóculo que contiene péptidos y adyuvantes que imitan la mielina, seguido de pruebas en cinta rodante para evaluar la función motora y evaluar el daño nervioso resultante debido a la activación inmune y la desmielinización.

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En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado para la prueba de rendimiento Rotarod, utilizada para medir la discapacidad neurológica progresiva en ratones infectados con TMEV.

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Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.

Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

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Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

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Un modelo murino de enfermedad similar a la encefalitis vírica aguda inducida por el virus del dengue

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Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55

Aprende el modelo de inoculación en almohadilla plantar para estudiar respuestas neuroinflamatorias virales en ratones C57BL/6. Este método permite evaluar la cinética viral y procesos inmunopatológicos en el sistema nervioso periférico.

Modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral

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