Modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral

Este protocolo permite el estudio de la iniciación y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias en el sistema nervioso periférico del ratón durante una infección viral. Con este modelo, las infecciones viajan una mayor distancia desde la periferia hasta el sistema nervioso periférico y central, permitiendo una evaluación máxima de la cinética de la respuesta neuroinflamatoria. Después de colocar el ratón C57BL/6 anestesiado de cinco a siete semanas en la posición supina en una almohadilla quirúrgica, confirme una falta de respuesta al reflejo del pedal.

Y usa una tabla de esmeril de 100 a 180 granos, para abrasar suavemente la piel glabra de una almohadilla trasera entre el talón y las almohadillas para caminar con alrededor de 20 pasadas de la tabla. A continuación, utilice fórceps finos para despegar lentamente el estrato córneo separado por la abrasión para exponer el estrato basale. Después de una mezcla suave, aplique tópicamente 20 microlitros del título apropiado del inóculo del virus en la almohadilla abrasada.

Realizar inoculaciones simuladas con medio sólo en las almohadillas abrasadas de los animales de control en paralelo. Después de cada aplicación, frote suavemente la almohadilla 10 veces con el eje de una aguja para facilitar la adsorción del virus cada 10 minutos durante 30 minutos. Cuando la almohadilla de pie abrasada se seque, deje que los ratones se recuperen con monitoreo hasta la reclinación esternal antes de colocar los animales en jaulas individuales para el seguimiento clínico y el muestreo.

En los puntos de tiempo experimentales apropiados, recoja los órganos expuestos al virus, incluidos el corazón, los pulmones, el bazo, el páncreas, el hígado, los riñones y la vejiga en microtubos individuales de 1,5 mililitros en hielo. Luego cosecha las almohadillas abrasadas entre el talón y las almohadillas para caminar y coloca las muestras en microtubos individuales de 1,5 mililitros sobre hielo. A continuación, coloque el ratón en la posición propensa y moje el pelaje con 70% de etanol.

Para exponer la columna vertebral, haga una pequeña incisión en la región de la pelvis y despoje la piel de las extremidades posteriores hacia la cabeza. Para quitar las extremidades delanteras y traseras, utilice tijeras para cortar paralelas y cercanas a la columna vertebral en ambos lados. Y retire la cabeza en la base del cráneo.

Usa las tijeras para abrir el cráneo desde el foramen magnum hasta el hueso frontal. Y usa fórceps para abrir el cráneo en una dirección lateral. Luego usa los fórceps para sacar suavemente el cerebro y colocar el cerebro en un microtubo de 1,5 mililitros sobre hielo.

Usa tijeras curvas para limpiar la columna vertebral del músculo, la grasa y el tejido blando, y elimina la cola. A continuación, coloque la columna vertebral intacta en un tubo de 15 mililitros de PBS frío enfriado estéril en hielo durante no más de tres horas. Después de la disección, transfiera la médula espinal a una placa de cultivo de tejido para permitir la extracción de cualquier tejido blando restante.

Utilice una cuchilla de afeitar para hacer tres cortes transversales a través de la columna vertebral en las vértebras S2, L1 y T1. Transfiera las piezas a platos individuales de 15 milímetros que contengan PBS estéril helado. Realizar un seguimiento y marcar los orígenes de los segmentos para su posterior análisis.

A continuación, utilice fórceps para asegurar un lado dorsal de segmento hacia arriba y utilice una cuchilla de afeitar para hacer un solo corte longitudinal a través de la línea media para dividir la columna en dos mitades iguales. Coloque ambas mitades en un nuevo plato de Petri que contenga PBS frío helado fresco y estéril en la orientación original para poder distinguir los lados izquierdo y derecho de la columna vertebral. Bajo un microscopio diseccionando, utilice fórceps finos para pelar suavemente la médula espinal de cada mitad de la columna vertebral en una dirección rostral a caudal.

A continuación, coloque ambas mitades de la médula espinal en microtubos individuales de 1,5 mililitros que contengan 500 microlitros de PBS frío enfriado estéril sobre hielo. Para exponer el ganglio de la raíz dorsal, retire suavemente las meninges de un lado de la columna vertebral al otro. Y saca el nervio espinal blanco expuesto de la columna vertebral.

Cosecha el ganglio de raíz dorsal redondo y transparente del segmento de la columna vertebral en un plato Petri de 15 milímetros de PBS helado. Y recoger el ganglio de raíz dorsal ipsilateral y contralateral como acaba de demostrar. Después de cosechar el nervio espinal y el ganglio de la raíz dorsal de los otros dos segmentos de la columna vertebral como se acaba de demostrar, centrifugar todos los tubos de tejido a alta velocidad.

A continuación, aspirar los sobrenadantes y congelar las muestras en nitrógeno líquido, y almacenar en menos 80 grados Celsius hasta la homogeneización. Para la homogeneización de tejidos, descongele los tubos de tejido congelado sobre hielo antes de pesar 100 miligramos de cada muestra. Transfiera a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga perlas estériles y 500 microlitros de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación.

A continuación, interrumpir los tejidos a temperatura ambiente en un homogeneizador a 20 ciclos por segundo durante dos minutos, seguido de un período de espera de un minuto, y 20 ciclos por segundo durante dos minutos adicionales. Después de la segunda ronda de homogeneización, centrifugar los tejidos a alta velocidad antes de transferir 500 microlitros de cada sobrenadante a un nuevo tubo debidamente etiquetado. Conservar a menos 20 grados Celsius hasta el análisis posterior.

El sitio de abrasión es visible en la almohadilla de control. Y es típico que se forme una corteza en el sitio de abrasión como parte del proceso de curación. Por el contrario, los ratones inoculados con pseudorabies, demuestran una inflamación grave de la almohadilla en el punto final humano que se caracteriza por hinchazón y enrojecimiento.

El examen histopatológico de la almohadilla de pie inoculada y el ganglio de raíz dorsal revela necrosis epidérmica e inflamación dérmica grave dentro de las secciones de los pies infectados. La infiltración de neutrófilos también se observa en pseudorabies infectados DRG secciones. Se mide un aumento significativo en la expresión de proteína G-CSF en el footpad y el ganglio de raíz dorsal de los ratones infectados por pseudorabies en comparación con los controles de siete y 82 horas después de la infección.

Niveles significativos de G-CSF también se observan a las 82 horas después de la infección en la médula espinal, cerebro, corazón, y los tejidos hepáticos de pseudorabies ratones infectados en comparación con los controles. Además, se detectan niveles significativos de IL-6 en todos los tejidos probados de pseudorabies ratones infectados a partir de las 24 horas después de la infección. En un estado moribundo, se detectaron pseudorabies en el bloc de notas, ganglio de raíz dorsal, médula espinal y cerebro.

Con la alta expresión citoplasmático de psuedorabies glicoproteína gB en las neuronas del ganglio de raíz dorsal en pseudorabies ratones infectados. Para asegurar una infección exitosa, es importante que la gota de virus en una columna no caiga de la almohadilla de pie abrasada. Este modelo animal puede servir plataforma para probar la eficacia de los medicamentos antiinflamatorios y antivirales con el fin de prevenir las neuropatías periféricas inducidas por el virus.