Flypub para estudiar la desinhibición conductual inducida por etanol y la sensibilización
18 de mayo de 2020
El ensayo Flypub mide los comportamientos que la mosca de la fruta Drosophila melanogaster muestra bajo la influencia del etanol. El ensayo puede ser fácilmente dominado por los experimentadores en todos los niveles y aplicado a varios estímulos vaporizados, facilitando el abuso de sustancias y estudios de adicción.
El ensayo Flypub mide comportamientos desinhibidos bajo la influencia del alcohol. Facilitando así el estudio mecanicista del trastorno por consumo de alcohol. El alcohol es una de las drogas más fácilmente disponibles y ampliamente abusadas en el mundo.
El mecanismo neurobiológico subyacente al trastorno por consumo de alcohol, sin embargo, se entiende incompletamente. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha utilizado ampliamente para estudiar los efectos del etanol sobre la euforia, locomoción, desinhibición y sedación. También se utiliza para estudiar sus cambios largos y duraderos en el comportamiento relevante para la adicción como la tolerancia, sensibilización, y la búsqueda de etanol.
Muchos estudios en Drosophila y otros modelos animales se centran en los efectos de activación locomotora del etanol. El efecto distintivo del etanol es la desinhibición conductual. Sin embargo, su estudio está bastante subrepresentado.
Para abordar este tema clave, desarrollamos el ensayo Flypub para medir el comportamiento desinhibido bajo la influencia del etanol. Para montar la cámara Flypub, tome una botella redonda y corte su parte inferior de una marca de 25 mililitros con una cuchilla de afeitar. Cree un agujero en la marca de 50 mililitros utilizando un soldador caliente.
Este es el punto de acceso donde se introducirán las moscas. Coloque una malla redonda de 54 milímetros de diámetro en la marca de 75 mililitros y fíjela con pegamento caliente. Coloque una lámina de plástico transparente de 70 milímetros de diámetro en el extremo inferior abierto y fíjela con pegamento caliente.
Para asegurarse de que la ronda de plástico está firmemente unida a la parte inferior, presión hacia abajo usando pesas. Recoge moscas machos en un grupo de 33. Colóquelos en el lado de un vial de alimentos.
Colóquelos en una incubadora de 25 grados Celsius con al menos 50% de humedad relativa y una luz de 12 horas, 12 horas de ciclo oscuro durante 2 días antes de la exposición al etanol. Prepare la estación de ensayo Flypub encendiendo luces, un ordenador y una cámara para la grabación de vídeo. Prepara seis pubs para un conjunto de experimentos.
Etiquetarlos con números del uno al seis. Introduzca suavemente las moscas en el pub usando un pequeño embudo. Cierre el pub con una cinta.
Aclimatar a las moscas durante 10 minutos. Durante la aclimatación, ajuste el enfoque de la cámara y grabe los últimos cinco minutos de aclimatación. Durante la aclimatación preparar almohadillas de algodón para la entrega de etanol.
Corta una almohadilla de algodón en cuatro cuadrantes iguales y luego recorta las esquinas para que quepa en un plato de Petri. Agregue una almohadilla de algodón a un plato de Petri. Añadir un mililitro de 95% de etanol a la almohadilla de algodón.
Asegúrese de que la solución de etanol se distribuya uniformemente en toda el área de la almohadilla. Cubra rápidamente el plato Petri con toallitas de laboratorio. Coloque cuidadosamente un etanol que contenga un plato de Petri debajo de cada pub.
Alinee los pubs en el escenario. Comience a grabar e inicie simultáneamente un temporizador. Graba hasta que las moscas dejen de cortejar o se muevan.
Retire el etanol que contiene el plato Petri cuando más del 90% de las moscas estén sedadas. Transfiera suavemente las moscas sedadas de vuelta a los viales de alimentos. Colóquelos de nuevo en la incubadora.
Repita los pasos anteriores cada 24 horas durante seis días consecutivos. Abra el vídeo con un reproductor multimedia. A continuación, puntúe el número de hombres que participan en actividades de cortejo cada 10 segundos.
Las actividades de cortejo para puntuar incluyen: extensión unilateral del ala, cadena de cortejo, círculo de cortejo, flexión abdominal y montaje. Se muestran grabaciones representativas del comportamiento de la mosca. Durante la aclimatación donde los machos no muestran mucha actividad.
Durante la primera exposición donde los machos exhiben un cortejo esporádico. Y durante la sexta exposición donde los machos muestran un cortejo de actividad. Introduzca el número de machos que muestran el cortejo en un bloque de diez segundos.
Utilice el número máximo de machos cortejados en tres bloques consecutivos de 10 segundos de tiempo como punto de datos representativo. El promedio de 10 puntos de datos consecutivos que tienen el valor más alto representan el porcentaje de cortejo intermale por pub. El tipo salvaje Canton-S exhibe progresivamente mayores actividades de cortejo desinhibido tras la exposición repetida al etanol.
Esto representa la sensibilización conductual al efecto de desinhibición del etanol. Examinamos el papel de la octopamina en la sensibilización probando las moscas que carecen de tiramina beta-hidroxilasa, T beta H, por lo tanto deficiente en octopamina. Al igual que Canton-S, los mutantes T beta H mostraron respuestas escaladas a la exposición repetida al etanol, pero a un nivel reducido.
Cuando comparamos T beta H y Canton-S, observamos que los machos mutantes T beta H mostraban un cortejo menos desinhibido que los machos de Cantón-S en cada exposición indicando que la octopamina puede ser importante para la sensibilización. Ahora puede configurar, conducir y analizar comportamientos inducidos por etanol utilizando el ensayo Flypub. Los puntos clave a tener en cuenta incluyen, uno, el montaje adecuado del pub.
Dos, entrega constante de etanol, y tres, puntuación de comportamiento precisa e imparcial. El ensayo Flypub tiene muchas ventajas. Es simple, barato de configurar y fácil de aprender.
Además, se pueden ensayar simultáneamente múltiples grupos de moscas, facilitando este estudio para identificar los efectos de las manipulaciones genéticas o experimentales. El ensayo Flypub es altamente atractivo para los experimentadores en todos los niveles, incluyendo primaria a escuela secundaria, estudiantes de pregrado y posgrado, postdoctorados y profesores. En resumen, el ensayo Flypub le permitirá identificar jugadores moleculares, vías celulares, circuitos cerebrales y factores de riesgo que contribuyen al trastorno del consumo de alcohol.
Descripción general
El ensayo Flypub mide comportamientos desinhibidos en la mosca del vinagre Drosophila melanogaster bajo la influencia del etanol. Este ensayo está diseñado para facilitar el estudio del trastorno por consumo de alcohol y puede ser dominado fácilmente por investigadores de todos los niveles.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del comportamiento
- Investigación sobre el trastorno por consumo de alcohol
Antecedentes
- El alcohol se consume ampliamente de forma abusiva, aunque sus mecanismos neurobiológicos no se comprenden completamente.
- Drosophila melanogaster sirve como organismo modelo para estudiar los efectos del etanol.
- El ensayo Flypub aborda específicamente el estudio poco representado de la desinhibición conductual provocada por el etanol.
- Estudios previos se han centrado principalmente en los efectos locomotores más que en la desinhibición.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para medir el comportamiento desinhibido en respuesta al etanol.
- Explorar el papel de la octopamina en la sensibilización conductual relacionada con la exposición al alcohol.
- Proporcionar un ensayo sencillo y eficaz para que los investigadores estudien los mecanismos de la adicción.
Métodos Utilizados
- Ensamblaje de la cámara Flypub utilizando una botella modificada.
- Preparación de Drosophila macho para exposición al etanol.
- Grabación de video del comportamiento de las moscas durante actividades de cortejo.
- Calificación de los comportamientos de cortejo para evaluar los efectos de desinhibición.
Resultados principales
- Las moscas de tipo silvestre Canton-S mostraron un aumento del cortejo desinhibido con exposiciones repetidas a etanol.
- Los mutantes T beta H mostraron una reducción de la desinhibición en comparación con Canton-S, lo que indica el papel de la octopamina.
- El ensayo permite la prueba simultánea de múltiples grupos de moscas.
- Una administración constante de etanol y una puntuación precisa son cruciales para obtener resultados confiables.
Conclusiones
- El ensayo Flypub es una herramienta valiosa para estudiar los efectos del etanol sobre el comportamiento.
- Puede ayudar a identificar los mecanismos moleculares y celulares implicados en el trastorno por consumo de alcohol.
- El ensayo es accesible para investigadores de diversos niveles educativos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo Flypub aborda un vacío crítico en la investigación del trastorno por consumo de alcohol al centrarse en la desinhibición conductual inducida por etanol, un cambio adaptativo clave subyacente a la adicción. Al permitir la medición de la intensificación de la corte desinhibida en Drosophila melanogaster, el ensayo apoya la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento. Su simplicidad, escalabilidad y compatibilidad con herramientas genéticas aumentan la confianza predictiva para la interrogación de vías y circuitos en los mecanismos de adicción.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la medición del comportamiento desinhibido escalado como un indicador de sensibilización al etanol.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas genéticas, como componentes de la vía de la octopamina, a través de fenotipos reducidos de desinhibición.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al cuantificar la sensibilización conductual entre genotipos, ayudando en la priorización de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores mediante el establecimiento de respuestas de desinhibición basal y sensibilizadas.
- Valor operativo: Estandariza la administración de etanol y la puntuación del comportamiento, asegurando la reproducibilidad entre series experimentales y laboratorios.
- Valor de escalabilidad: Permite la prueba simultánea de múltiples grupos de moscas, facilitando la evaluación paralela de manipulaciones genéticas o farmacológicas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor traslacional: Relaciona la sensibilización de la desinhibición en moscas con modelos mamíferos de adicción, apoyando la validación cruzada de especies para dianas terapéuticas.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite el análisis de los factores moleculares, las vías celulares y los circuitos cerebrales que contribuyen a los cambios conductuales inducidos por el etanol.
- Continuidad predictiva: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de la modulación de dianas con fenotipos de desinhibición tras exposiciones repetidas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo Flypub se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos prometedores, particularmente para dianas relacionadas con la adicción que afectan la regulación del comportamiento.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre genes y vías implicados en la respuesta al etanol, como la tirosina beta-hidroxilasa y la señalización de octopamina.
- Tamizaje: Ofrece disponibilidad para ensayos mediante cámaras estandarizadas, preparación consistente de etanol y puntuación cuantificable del cortejo cada 10 segundos.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes—porcentaje de cortejo entre machos por bar—lo que permite comparaciones entre condiciones y genotipos.
- Investigación Traducional: Relaciona la sensibilización de la desinhibición con relevancia preclínica al modelar respuestas exacerbadas similares a comportamientos adictivos.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para evaluar modificadores genéticos, farmacológicos o ambientales de la respuesta al etanol en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista en torno a la sensibilización por desinhibición.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante el ensamblaje estandarizado de cámaras, la administración de etanol y la puntuación conductual ciega.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar fenotipos cuantitativos basados en la escalada que reflejan neuroadaptaciones relevantes para la adicción.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos según su influencia en las trayectorias de sensibilización conductual.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, observación del comportamiento y puntuación basada en video.
- Depende de instrumentación para la administración de etanol, grabación de video y control ambiental (25°C, 50 % de humedad, ciclo de 12 h luz/oscuridad).
- Necesita la estandarización entre equipos de los criterios de cortejo y los intervalos de puntuación para garantizar la comparabilidad de los datos.
- Implica consideraciones de adaptación al extender el ensayo para medir otros comportamientos inducidos por etanol más allá de la desinhibición del cortejo.
- Incluye limitaciones prácticas, como el sesgo del evaluador y la variabilidad en la motivación de las moscas, mitigadas mediante el uso del cortejo máximo a lo largo de bloques de tiempo consecutivos.
