Name: Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende el método ChIP-Exo para mapear interacciones proteína-ADN con alta resolución en neuronas derivadas de células madre de ratón. Esta técnica mejora significativamente la resolución respecto a métodos convencionales.

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Agradecemos al miembro del laboratorio Rhee por compartir datos inéditos y discusiones valiosas. Este trabajo fue apoyado por la subvención RGPIN-2018-06404 (H.R.) del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
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<li>Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+transcriptional+profiling+of+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer.</a> Scientific Data. 6, 190033(2019).</li>
<li>Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+ChIP-exo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Simplified ChIP-exo assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 2842(2018).</li>
<li>Perreault, A. A., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChIP-exo+Method%3A+Identifying+Protein-DNA+Interactions+with+Near+Base+Pair+Precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, chip seguido de digestión exonuclease se utiliza para obtener bibliotecas de ADN para la identificación de interacciones proteína-ADN en células de mamíferos a resolución cartográfica ultra alta. Muchas variables contribuyen a la calidad del experimento ChIP-exo. Los parámetros experimentales críticos incluyen la calidad de los anticuerpos, la optimización de la sonicación y el número de ciclos LM-PCR. Estos parámetros experimentales críticos también son lo que puede limitar los experimentos chip-exo y...

Las ubicaciones de las interacciones proteína-ADN proporcionan información sobre los mecanismos de regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se ha utilizado durante una década para examinar las interacciones proteína-ADN en todo el genoma en las células vivas1,2. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por la heterogeneidad en la fragmentación del ADN y la contaminación de ADN no entrante que conducen a una baja resolución cartográfica, falsos positivos, llamadas perdidas y señal de fondo no específica. La combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) mejora el método ChIP-seq recortando el ADN ChIP a los puntos de enlace proteína-ADN, proporcionando una resolución cercana al par base y una señal de fondo baja3,4,5. La resolución cartográfica muy mejorada y los bajos antecedentes proporcionados por ChIP-exo permiten determinar ubicaciones precisas y completas de unión proteína-ADN en todo el genoma. ChIP-exo es capaz de revelar motivos funcionalmente distintos de unión al ADN, interacciones cooperativas entre factores de transcripción (TF) y múltiples sitios de enlace proteína-ADN en una determinada ubicación de unión genómica, no detectable por otros métodos de cartografía genómica3,4,6,7.
ChIP-exo se utilizó inicialmente en levadura en ciernes para examinar la unión de ADN específica de secuencia de los TFs, para estudiar la organización precisa del complejo de transcripción previa a la iniciación, y la estructura sub-nucleosomal de histonas individuales a través del genoma4,8,9. Desde su introducción en 20114,ChIP-exo se ha utilizado con éxito en muchos otros organismos incluyendo bacterias, ratones y células humanas7,10,11,12,13,14,15,16,17. En 2016, Rhee et al.14 utilizaron ChIP-exo en neuronas de mamíferos por primera vez para entender cómo se mantuvo la expresión génica neuronal después de la regulación descendente de la programación tf Lhx3, que forma un complejo heterodímero con otra programación TF Isl1. Este estudio demostró que en ausencia de Lhx3, Isl1 es reclutado para nuevos potenciadores neuronales unidos por Onecut1 TF para mantener la expresión génica de genes efectores neuronales. En este estudio, ChIP-exo reveló cómo múltiples TFs reconocen dinámicamente el tipo de célula y los elementos reguladores de ADN específicos de la etapa celular de una manera combinatoria a la resolución de mapeo de casi nucleótidos. Otros estudios también utilizaron el método ChIP-exo para entender la interacción entre las proteínas y el ADN en otras líneas celulares de mamíferos. Han et al.7 utilizó ChIP-exo para examinar la organización del genoma de los TFs GATA1 y TAL1 en células eritródicas de ratón utilizando ChIP-exo. Este estudio encontró que TAL1 se recluta directamente para el ADN en lugar de indirectamente a través de interacciones proteína-proteínas con GATA1 a lo largo de la diferenciación eritroide. Estudios recientes también utilizaron ChIP-exo para perfilar las ubicaciones de unión a todo el genoma de CTCF, ARN Polymerase II y marcas de histona para estudiar mecanismos epigenómicos y transcripcionales en líneas celulares humanas18,19.
Hay varias versiones del protocolo ChIP-exo disponibles3,5,20. Sin embargo, estos protocolos ChIP-exo son difíciles de seguir para las investigaciones que no están familiarizadas con la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación. Una excelente versión del protocolo ChIP-exo fue publicada con instrucciones fáciles de seguir y un video21,pero contenía muchos pasos enzimáticos que requieren una cantidad significativa de tiempo para completarse. Aquí informamos de una nueva versión del protocolo ChIP-exo que contiene pasos enzimáticos reducidos y tiempos de incubación, y explicaciones para cada paso enzimático21. Las reacciones de reparación final y relaves dA se combinan en un solo paso utilizando la enzima de preparación final. Los tiempos de incubación de los pasos de ligadura del adaptador universal y de índice se reducen de 2 h a 15 min utilizando un potenciador de ligadura. Se elimina la reacción quinasa después del paso de ligadura del adaptador de índice descrito en el protocolo ChIP-exo anterior. En su lugar, se agrega un grupo de fosfato durante la síntesis de ADN de oligo a uno de los extremos de 5' del adaptador de índice(Tabla 1),que se utilizará para el paso de digestión lambda exonuclease. Mientras que el protocolo chip-exo anterior utilizó la digestión RecJf exonuclease para eliminar contaminantes de ADN de una sola cadena, este paso de digestión se elimina aquí porque no es crítico para la calidad de la biblioteca ChIP-exo. Además, para purificar el ADN de enlace inverso después de la elución chip, se utiliza un método de purificación de cuentas magnéticas en lugar del método de extracción de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (PCIA). Esto reduce el tiempo de incubación de la extracción de ADN. Es importante destacar que elimina la mayoría de los atenuadores de adaptador formados durante la ligadura del adaptador de índice, lo que puede afectar a la eficiencia de la PCR mediada por ligadura.
El protocolo ChIP-exo presentado aquí está optimizado para la detección de interacciones precisas proteína-ADN en neuronas de mamíferos diferenciadas de las células madre embrionarias (ES) del ratón. Brevemente, las células neuronales cosechadas y reticuladas se miman, para permitir que la cromatina esté expuesta a la sonicación, luego sonicadas para que se obtengan fragmentos de ADN de tamaño adecuado(Figura 1). Las cuentas recubiertas de anticuerpos se utilizan para inmunoprecipitar selectivamente la cromatina fragmentada y soluble a la proteína de interés. Mientras que el ADN inmunoprecipitado todavía está en las cuentas, se realizan pasos de reparación final, ligadura de adaptadores de secuenciación, reacción de relleno y 5' a 3' pasos de digestión exonucleasa lambda. El paso de digestión exonuclease es lo que le da a ChIP-exo su alta resolución y alta relación señal-ruido. Lambda exonuclease recorta el ADN inmunoprecipitado a unos pocos pares de bases (bp) del sitio de enlace cruzado, lo que hace que el ADN contaminante se degrade. El ADN ChIP tratado con exonucleasa se eluta de las cuentas recubiertas de anticuerpos, se invierten los enlaces cruzados proteína-ADN y se degradan las proteínas. El ADN se extrae y desnaturaliza al ADN ChIP de una sola cadena, seguido de recocido de imprimación y extensión para hacer ADN de doble cadena (dsDNA). A continuación, se realiza la ligadura de un adaptador universal a los extremos tratados con exonucleasa. El ADN resultante se purifica, luego pcr amplificado, gel purificado, y sometido a secuenciación de próxima generación.
El protocolo ChIP-exo es más largo que el protocolo ChIP-seq, pero no es muy difícil técnicamente. Cualquier ADN ChIP inmunoprecipitado con éxito puede ser sometido a ChIP-exo, con varios pasos enzimáticos adicionales. Las ventajas notables de ChIP-exo, como la resolución de mapeo ultra alta, una señal de fondo reducida y la disminución de falsos positivos y negativos, con respecto a los sitios de enlace genómico, superan el costo de tiempo.

<table><tbody><tr><td>Agarosa,</td><td>UltraPure Invitrogen</td><td>16500</td><td>Comprobación de la sonicación (sección 4.3.6) y purificación en gel del ADN amplificado por LM-PCR (sección 19.1)</td></tr><tr><td>Albúmina, suero bovino (BSA), libre de proteasas, aislamiento por choque térmico, mín. 98%</td><td>BioShop</td><td>ALB003</td><td>Anticuerpo de solución bloqueante</td></tr><tr><td>contra Isl1</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td><td>Incuación de anticuerpos con perlas (Sección 5.6)</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico& nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060010</td><td>cromatina sonicante (Sección 3.3)</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA), Grado de biología molecular</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>B9000S</td><td>Reacción de relleno en perlas (Sección 10.2) y desnaturalización, recocido de cebadores y extensión de imprimación (Sección 14.2)</td></tr><tr><td>Centrífuga 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td>cromatina sonicante (Sección 3.5), control de la sonicación (secciones 4.3.1, 4.3.3 y 4.3.4)</td></tr><tr><td>Centrífuga 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Células de recolección, reticulación y congelación (Sección 1.3), Lisis celular (Sección 2.2 y 2.3), Cromatina sonicante (Sección 3.1)</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa completo, mini, sin EDTA</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Añadido a todos los tampones, excepto al tampón de proteinasa K y al tampón de elución ChIP</td></tr><tr><td>Solución de dATP New</td><td>England BioLabs</td><td>N0440S</td><td>dA-Tailing Reaction (Section 15.1)</td></tr><tr><td>Ácido desoxicólico Sal de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349</td><td>Tampón de lisis 3, tampón de lavado con alto contenido de sal y tampón de lavado LiCl</td></tr><tr><td>Mezcla dNTP, Grado de biología molecular</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Reacción de relleno en perlas (Sección 10.2) y desnaturalización, recocido de imprimación y extensión de imprimación (Sección 14.2)</td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x &nbsp;</td><td>PCR</td> mediada por ligadura Thermo Scientific <td>K1081</td><td>(sección 18.1)</td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 m, solución estéril, pH 8,0</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td>Tampón de lisis 1-3, control de sonicación (sección 4.1), tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado LiCl y tampón de elución ChIP</td></tr><tr><td>Alcohol etílico anhidro, 100%</td><td>Alcoholes comerciales</td><td>P006EAAN</td><td>control de la sonicación (sección 4.3.3)</td></tr><tr><td>Formaldehído, 36,5-38%, contiene 10-15% metanol</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Células de recolección, reticulación y congelación (Sección 1.1)</td></tr><tr><td>Glicerol, grado reactivo, min 99.5%</td><td>BioShop</td><td>GLY002</td><td>Tampón de lisis 1</td></tr><tr><td>glicina, grado biotecnológico, min. 99%</td><td>BioShop</td><td>GLN001</td><td>Células de recolección, reticulación y congelación (Sección 1.2)</td></tr><tr><td>Glucógeno, grado de ARN</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td>Sonicación de control (Sección 4.3.3)</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M Solución Filtrada Estéril, pH 7.3&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>HEP003</td><td>Tampón de lisis 1, tampón de lavado con alto contenido de sal</td></tr><tr><td>Fragmento de Klenow (3->5 exo-)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212S</td><td>dA-Tailing Reaction (Sección 15.1)</td></tr><tr><td>Lambda exonucleasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262S</td><td>Digestión de Lambda Exonucleasa en Perlas (Sección 11.2)</td></tr><tr><td>Ligase Enhancer</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>Kit de biblioteca de ADN NEBNext Ultra II. Ligadura de adaptador de índice en cuentas (Sección 9.1) y Ligadura de adaptador universal (Sección 16.1)</td></tr><tr><td>Ligase Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Ligadura de adaptador de índice en perlas (Sección 9.1) y Ligadura de adaptador universal (Sección 16.1)</td></tr><tr><td>Cloruro de litio (LiCl), grado reactivo</td><td>Bioshop</td><td>LIT704</td><td>LiCl Tampón de lavado</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas para ChIP (Dynabeads Protein G)</td><td>Dynabeads Protein G (perlas magnéticas para ChIP)</td><td>Dynabeads Protein G (perlas magnéticas para ChIP)Incubación</td> de <td>anticuerpos con perlas (Sección 5)</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas para la purificación del ADN (AMPure XP Beads)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Extracción de ADN (Sección 13.3) y limpieza de ADN (Sección 17.1)</td></tr><tr><td>Bastidor magnético (Imán DynaMag-2)</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Se utiliza en muchos pasos en las Secciones: 5 - 11, 13</td></tr><tr><td>MinElute Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28604</td><td>Purificación en gel de ADN amplificado por PCR (Sección 19.2)</td></tr><tr><td>Solución de sal sódica de N-lauroilsarcosina, solución acuosa al 30%, &ge; 97.0% (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>61747</td><td>Tampón de lisis 3</td></tr><tr><td>Etoxilato de octilfenol (IGEPAL CA630)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Tampón de lisis 1 y tampón de lavado LiCl</td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico, grado biotecnológico (25:24:1)</td><td>BioShop</td><td>PHE512</td><td>Comprobación de la sonicación (Sección 4.3.1)</td></tr><tr><td>phi29 ADN polimerasa</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>M0269L</td><td>Reacción de relleno en cordones (sección 10.2) y desnaturalización, recocido de imprimación y extensión de imprimación (sección 14.3 y 14.4)</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td>Células de recolección, reticulación y congelación (Sección 1.3) y cromatina sonicante (Sección 3.1), Incuación de anticuerpos con perlas (Sección 5.1)</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación básica PowerPac</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>control de sonicación (Sección 4.3.6) y purificación en gel de ADN amplificado LM-PCR (Sección 19.1)</td></tr><tr><td>Sistema de PCR ProFlex</td> de <td>Applied Biosystems</td><td>Sistema</td> <td>de PCR ProFlexUtilizado en las secciones: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 y 18.2</td></tr><tr><td>Tubo LoBind de proteínas, 2.0 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Incubación de anticuerpos con perlas (Sección 5.2) e inmunoprecipitación de cromatina (Sección 6.3)</td></tr><tr><td>Solución de proteinasa K,</td><td>25530049</td> de control de <td>Invitrogen</td> de grado de ARN <td>Sonicación (Sección 4.2) y elución y reticulación inversa (Sección 12.3)</td></tr><tr><td>Qubit 4.0 Fluorímetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Purificación en gel de ADN amplificado por PCR (Sección 19.3)</td></tr><tr><td>Ensayo Quibit dsDNA BR </td><td>kit Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Purificación en gel de ADN amplificado por PCR (Sección 19.3)</td></tr><tr><td>Libre de ARNASA A, Dnasa y proteasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td>Control de sonicación (Sección 4.3.2) y extracción de ADN (Sección 13.2)</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl), Biorreactivo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Tampón de lisis 1-3, tampón de lavado con alto contenido de sal</td></tr>, <tr><td>sulfato de dodecilo de sodio (SDS), grado de electroforesis</td><td>BioShop</td><td>SDS001</td><td>control de sonicación (sección 4.1), tampón de lavado con alto contenido de sal y tampón de elución ChIP</td></tr>, <tr><td>perlas de sonicación y tubos Bioruptor de 15 mL</td><td>Diagenode</td><td>C01020031</td><td>cromatina sonicante (sección 3.1 y 3.2)</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>Sección 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 y 16.2</td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de Trizma (Tris-HCl), Certificado BioPerformance, 1 M, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>T2194</td><td>10 mM Tampón Tris-HCl</td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de Trizma (Tris-HCl), Certificado BioPerformance, 1 M, pH 8.0</td><td>Sigma</td><td>T2694</td><td>Tampón de lisis 2, tampón de lisis 3, comprobación de la sonicación (sección 4.1), tampón de lavado LiCl y tampón de elución ChIP</td></tr><tr><td>Módulo de reparación final/relaves de dA Ultra II (24 rxn -> 120 rxn)</td>Mezcla de reacción de preparación final <td>E7546S</td> de <td>New England BioLabs</td><td>y mezcla de enzimas de preparación final. Reparación final y reacción de cola dA en cordones (Sección 8.2)</td></tr><tr><td>Balancín de minitubo VWR, velocidad variable</td><td>VWR</td><td>10159-752</td><td>Se utiliza en muchos pasos en las secciones: 1, 2, 5, 6 y 7</td></tr><tr><td>2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol, Triton X-100, tampón</td> de lisis <td>1 BioShop</td><td>TRX506</td> de grado reactivo<td>, cromatina sonicante (sección 3.4) y tampón de lavado con alto contenido de sal</td></tr></tbody></table>

mapeo de alta resolución de interacciones proteína-adn en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (chip-exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

La identificación de interacciones específicas proteína-ADN en el genoma es importante para entender la regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se utiliza ampliamente para identificar ubicaciones de unión a todo el genoma de proteínas que unen el ADN. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por su heterogeneidad en longitud de fragmentos de ADN sonicados y ADN de fondo no específico, lo que resulta en una baja resolución cartográfica e incertidumbre en los sitios de unión al ADN. Para superar estas limitaciones, la combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) utiliza digestión exonucleasa de 5' a 3' para recortar el ADN inmunoprecipitado de tamaño heterogéneo al sitio de enlace cruzado proteína-ADN. El tratamiento con exonucleasa también elimina el ADN de fondo no específico. El ADN preparado por la biblioteca y digerido por exonuclease puede ser enviado para secuenciación de alto rendimiento. El método ChIP-exo permite una resolución de mapeo cercana al par base con mayor sensibilidad de detección y señal de fondo reducida. A continuación se describe un protocolo ChIP-exo optimizado para células de mamíferos y secuenciación de próxima generación.

La Figura 2A ilustra los resultados de sonicación después de la lisis celular y la sonicación, con varios ciclos, de células de neuronas motoras diferenciadas de las células ES del ratón. El número óptimo de ciclos de sonicación (por ejemplo, 12 ciclos en la Figura 2A)generó una fuerte intensidad de ADN en fragmentos de ADN de 100-400 bp. Las bibliotecas ChIP-exo de alta calidad se basan en el tamaño y la cantidad de ADN de cromatina fragmentada. Por lo tanto, s...

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

La principal ventaja de nuestro método ChIP-exo es la resolución mejorada del mapeo de las interacciones proteína-ADN en la célula en comparación con el método convencional de inmunoprecipitación de cromatina. Para preparar perlas magnéticas de proteína G para ChIP, mezcle las perlas magnéticas hasta que queden homogéneas. A continuación, añada 25 microlitros de las perlas magnéticas a un tubo de baja unión a proteínas de dos mililitros.Agregue un mililitro de solución de bloqueo a las cuentas. Mezcle bien pipeteando, luego coloque el tubo en una rejilla magnética durante un minuto. Una vez que el sobrenadante esté claro, retírelo.A continuación, agregue un mililitro de solución de bloqueo a las cuentas. Coloque el tubo en una plataforma mecedora a cuatro grados centígrados y muévalo durante 10 minutos, luego gire brevemente el tubo. Coloque el tubo en la rejilla magnética y retire el sobrenadante.Agregue 500 microlitros de solución de bloqueo a las perlas magnéticas. Haga girar brevemente el anticuerpo contra el islote-1, luego agregue cuatro microgramos del anticuerpo al tubo que contiene las perlas magnéticas. Coloque el tubo que contiene las perlas magnéticas y el anticuerpo Islet-1 en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados y muévase durante seis a 24 horas.Para comenzar la inmunoprecipitación de cromatina, lave las perlas recubiertas de anticuerpos en un mililitro de solución bloqueante. Coloque el tubo que contiene las perlas recubiertas de anticuerpos en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de girar brevemente, coloque el tubo en una rejilla magnética y retire el sobrenadante.Vuelva a suspender las perlas recubiertas de anticuerpos en 50 microlitros de solución bloqueante. Añada un mililitro de lisados sonicados a las perlas recubiertas de anticuerpos, y luego incube la muestra en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de permitir que la muestra se incube durante la noche, recoja el líquido de la tapa girando brevemente el tubo, luego coloque el tubo en una rejilla magnética.Y pasado un minuto, retirar el sobrenadante con cuidado con una pipeta. A continuación, realice una serie de lavados de la siguiente manera. Agregue un mililitro de tampón de lavado en frío que contenga CPI a la muestra.Mezclar la muestra en una plataforma mecedora a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Gire brevemente el tubo de muestra, luego colóquelo en una rejilla magnética. Después de un minuto, retire el sobrenadante con una pipeta.Para la primera reacción enzimática y reparación y relaves DA, agregue 38 microlitros de agua destilada doble esterilizada en autoclave a la muestra, luego agregue la mezcla de reacción de preparación final y la mezcla de enzimas de preparación final. Mezcle el contenido del tubo pipeteando, luego incube la muestra a 20 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, lave las perlas de muestra con tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado de cloruro de litio y tampón de cloruro de hidrógeno Tris de 10 milimolares como se describió anteriormente.Para realizar la ligadura del adaptador índice, agregue 27 microlitros de tampón frío de cloruro de hidrógeno Tris de 10 milimolares a la muestra. A continuación, añada el adaptador de índice, el potenciador de la ligadura y la mezcla maestra de ligasa. Incubar la muestra a 20 grados centígrados durante 15 minutos.Nuevamente, lave las perlas de muestra con tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado de cloruro de litio y tampón de cloruro de hidrógeno Tris de 10 milimolares. A continuación, añada 47 microlitros de tampón frío de cloruro de hidrógeno Tris de 10 milimolares a la muestra. Para reparar la muesca en el ADN resultante del enlace fosfodiéster faltante, agregue 11,1 microlitros de la mezcla de relleno a la muestra.Incubar la muestra a 30 grados centígrados durante 20 minutos. Después de una serie de lavados, agregue 50 microlitros de agua fría destilada doble esterilizada en autoclave a la muestra. Para digerir el ADN ChIP en la dirección de cinco primos a tres primos, agregue el tampón de exonucleasa lambda y la exonucleasa lambda y mezcle la muestra mediante pipeteo.Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Una vez completada la digestión, repita los tres lavados por última vez. Para eluir la muestra de ChIP de las perlas, vuelva a suspender la muestra en 75 microlitros de tampón de elución ChIP y en la incubadora a 65 grados centígrados durante 15 minutos a 130 veces G. Agregue 2,5 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K a la muestra.Agite la muestra brevemente, luego incube durante la noche a 65 grados Celsius. Gire brevemente la muestra y colóquela en una rejilla magnética. Después de un minuto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.Purificar y eluir el ADN. Después de purificar el ADN eluido, transfiera 16 microlitros de la muestra de ADN extraída a un tubo de PCR. Agregue 1,2 microlitros de mezcla de recocido desnaturalizante e imprimación a la muestra.Utilizando el programa descrito en la tabla seis del manuscrito, cebadores de desnaturalización y recocido al ADN plantilla. Agregue tres microlitros de mezcla de extensión de cebador a la muestra y ejecute el programa de PCR descrito en la tabla siete del manuscrito. Agregue 4.1 microlitros de mezcla de relaves DA a la muestra y ejecute la muestra utilizando el programa de PCR en la tabla ocho del manuscrito.A continuación, añada 21,5 microlitros de mezcla de ligadura adaptadora universal a la muestra e incube durante 15 minutos a 20 grados centígrados. Agregue 29 microlitros de mezcla LM-PCR a la muestra, luego ejecute la muestra utilizando el programa de la tabla 10 del manuscrito. Después de 18 ciclos de LM-PCR, se electroforizaron muestras de ChIP-exo de neuronas motoras de ratón en un gel de agarosa al 1,5%.Los resultados para ChIP-exo Islet-1 mostraron bibliotecas de ADN amplificadas de alrededor de 200 a 400 pares de bases, lo que indica que las bibliotecas ChIP-exo fueron amplificadas con éxito por LM-PCR. La banda alrededor de 100 pares de bases representa artefactos de adaptadores y cebadores de PCR. El control sin anticuerpos demuestra que el ADN de fondo no específico fue digerido por el tratamiento con exonucleasa lambda.Utilizando ChIP-exo y ChIP-seq, se identificaron las ubicaciones enlazadas al islote 1. La señal ChIP-exo se centró en los sitios de unión del islote-1, detectando múltiples patrones de unión del factor de transcripción del islote 1 agrupados. La señal ChIP-seq mostró señales más amplias, lo que indica que ChIP-exo tenía una resolución de mapeo más alta que ChIP-seq para Islet-1.Múltiples factores de transcripción a menudo unen el ADN uno al lado del otro como un complejo proteína-ADN. ChIP-exo nos permite estudiar cómo múltiples factores de transcripción reconocen y regulan el ADN diana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este video demuestra la inmunoprecipitación de fragmentos de ADN reticulados con la proteína diana de lisados de neuronas motoras derivadas de células madre utilizando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos de proteína diana.

Inmunoprecipitación de complejos proteína-ADN diana a partir de lisado de neuronas motoras

Fuente: Méndez, F. M. et al., Inmunoprecipitación de cromatina nativa utilizando neuroesferas de tumores cerebrales murinos. J. Vis. Exp. (2018). Este video demuestra el aislamiento de complejos proteína-ADN de células de neurosfera derivadas de un tumor cerebral de ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina nativa. En él se detallan los pasos para la preparación de la cromatina, la inmunoprecipitación, el lavado y la digestión de proteínas para liberar el ADN para su análisis posterior.

Inmunoprecipitación de cromatina nativa de células de la neurosfera

La cuestión de cómo los reguladores y los estados de la cromatina cromatina afecta al genoma in vivo es fundamental para nuestra comprensión de cómo los primeros se toman las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Chip-Sec-el método más popular para investigar las características de la cromatina en un nivel se describe aquí mundial para los embriones de Xenopus.

Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones por chip-Sec

Aquí, presentamos un protocolo para lograr la resolución de pares de bases cercanos a las interacciones proteína-ADN. Esto se obtiene mediante el tratamiento con exonucleasas de fragmentos de ADN enriquecidos selectivamente por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento.

El Método chip-exo: La identificación de las interacciones proteína-ADN con zona de Base Par de precisión

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este trabajo describe un protocolo para la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) utilizando una línea de células T de ratón madura. Este protocolo es adecuado para investigar la distribución de marcas de histonas específicas en sitios específicos del promotor o en todo el genoma.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en líneas de células T de ratón

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

Aquí se presenta un protocolo para mapear la organización tridimensional del genoma con resolución de nucleosomas utilizando el método de captura de conformación cromosómica de todo el genoma Micro-C-XL.

Mapeo de las interacciones del genoma 3D de los mamíferos con Micro-C-XL

Aprende el método ChIP-Exo para mapear interacciones proteína-ADN con alta resolución en neuronas derivadas de células madre de ratón. Esta técnica mejora significativamente la resolución respecto a métodos convencionales.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo) (Video) | JoVE Journal

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

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