Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)
August 14th, 2020
La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.
La principal ventaja de nuestro método ChIP-exo es la resolución mejorada del mapeo de las interacciones proteína-ADN en la célula en comparación con el método convencional de inmunoprecipitación de cromatina. Para preparar perlas magnéticas de proteína G para ChIP, mezcle las perlas magnéticas hasta que queden homogéneas. A continuación, añada 25 microlitros de las perlas magnéticas a un tubo de baja unión a proteínas de dos mililitros.
Agregue un mililitro de solución de bloqueo a las cuentas. Mezcle bien pipeteando, luego coloque el tubo en una rejilla magnética durante un minuto. Una vez que el sobrenadante esté claro, retírelo.
A continuación, agregue un mililitro de solución de bloqueo a las cuentas. Coloque el tubo en una plataforma mecedora a cuatro grados centígrados y muévalo durante 10 minutos, luego gire brevemente el tubo. Coloque el tubo en la rejilla magnética y retire el sobrenadante.
Agregue 500 microlitros de solución de bloqueo a las perlas magnéticas. Haga girar brevemente el anticuerpo contra el islote-1, luego agregue cuatro microgramos del anticuerpo al tubo que contiene las perlas magnéticas. Coloque el tubo que contiene las perlas magnéticas y el anticuerpo Islet-1 en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados y muévase durante seis a 24 horas.
Para comenzar la inmunoprecipitación de cromatina, lave las perlas recubiertas de anticuerpos en un mililitro de solución bloqueante. Coloque el tubo que contiene las perlas recubiertas de anticuerpos en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de girar brevemente, coloque el tubo en una rejilla magnética y retire el sobrenadante.
Vuelva a suspender las perlas recubiertas de anticuerpos en 50 microlitros de solución bloqueante. Añada un mililitro de lisados sonicados a las perlas recubiertas de anticuerpos, y luego incube la muestra en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de permitir que la muestra se incube durante la noche, recoja el líquido de la tapa girando brevemente el tubo, luego coloque el tubo en una rejilla magnética.
Y pasado un minuto, retirar el sobrenadante con cuidado con una pipeta. A continuación, realice una serie de lavados de la siguiente manera. Agregue un mililitro de tampón de lavado en frío que contenga CPI a la muestra.
Mezclar la muestra en una plataforma mecedora a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Gire brevemente el tubo de muestra, luego colóquelo en una rejilla magnética. Después de un minuto, retire el sobrenadante con una pipeta.
Para la primera reacción enzimática y reparación y relaves DA, agregue 38 microlitros de agua destilada doble esterilizada en autoclave a la muestra, luego agregue la mezcla de reacción de preparación final y la mezcla de enzimas de preparación final. Mezcle el contenido del tubo pipeteando, luego incube la muestra a 20 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, lave las perlas de muestra con tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado de cloruro de litio y tampón de cloruro de hidrógeno Tris de 10 milimolares como se describió anteriormente.
Para realizar la ligadura del adaptador índice, agregue 27 microlitros de tampón frío de cloruro de hidrógeno Tris de 10 milimolares a la muestra. A continuación, añada el adaptador de índice, el potenciador de la ligadura y la mezcla maestra de ligasa. Incubar la muestra a 20 grados centígrados durante 15 minutos.
Nuevamente, lave las perlas de muestra con tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado de cloruro de litio y tampón de cloruro de hidrógeno Tris de 10 milimolares. A continuación, añada 47 microlitros de tampón frío de cloruro de hidrógeno Tris de 10 milimolares a la muestra. Para reparar la muesca en el ADN resultante del enlace fosfodiéster faltante, agregue 11,1 microlitros de la mezcla de relleno a la muestra.
Incubar la muestra a 30 grados centígrados durante 20 minutos. Después de una serie de lavados, agregue 50 microlitros de agua fría destilada doble esterilizada en autoclave a la muestra. Para digerir el ADN ChIP en la dirección de cinco primos a tres primos, agregue el tampón de exonucleasa lambda y la exonucleasa lambda y mezcle la muestra mediante pipeteo.
Incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Una vez completada la digestión, repita los tres lavados por última vez. Para eluir la muestra de ChIP de las perlas, vuelva a suspender la muestra en 75 microlitros de tampón de elución ChIP y en la incubadora a 65 grados centígrados durante 15 minutos a 130 veces G. Agregue 2,5 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K a la muestra.
Agite la muestra brevemente, luego incube durante la noche a 65 grados Celsius. Gire brevemente la muestra y colóquela en una rejilla magnética. Después de un minuto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.
Purificar y eluir el ADN. Después de purificar el ADN eluido, transfiera 16 microlitros de la muestra de ADN extraída a un tubo de PCR. Agregue 1,2 microlitros de mezcla de recocido desnaturalizante e imprimación a la muestra.
Utilizando el programa descrito en la tabla seis del manuscrito, cebadores de desnaturalización y recocido al ADN plantilla. Agregue tres microlitros de mezcla de extensión de cebador a la muestra y ejecute el programa de PCR descrito en la tabla siete del manuscrito. Agregue 4.1 microlitros de mezcla de relaves DA a la muestra y ejecute la muestra utilizando el programa de PCR en la tabla ocho del manuscrito.
A continuación, añada 21,5 microlitros de mezcla de ligadura adaptadora universal a la muestra e incube durante 15 minutos a 20 grados centígrados. Agregue 29 microlitros de mezcla LM-PCR a la muestra, luego ejecute la muestra utilizando el programa de la tabla 10 del manuscrito. Después de 18 ciclos de LM-PCR, se electroforizaron muestras de ChIP-exo de neuronas motoras de ratón en un gel de agarosa al 1,5%.
Los resultados para ChIP-exo Islet-1 mostraron bibliotecas de ADN amplificadas de alrededor de 200 a 400 pares de bases, lo que indica que las bibliotecas ChIP-exo fueron amplificadas con éxito por LM-PCR. La banda alrededor de 100 pares de bases representa artefactos de adaptadores y cebadores de PCR. El control sin anticuerpos demuestra que el ADN de fondo no específico fue digerido por el tratamiento con exonucleasa lambda.
Utilizando ChIP-exo y ChIP-seq, se identificaron las ubicaciones enlazadas al islote 1. La señal ChIP-exo se centró en los sitios de unión del islote-1, detectando múltiples patrones de unión del factor de transcripción del islote 1 agrupados. La señal ChIP-seq mostró señales más amplias, lo que indica que ChIP-exo tenía una resolución de mapeo más alta que ChIP-seq para Islet-1.
Múltiples factores de transcripción a menudo unen el ADN uno al lado del otro como un complejo proteína-ADN. ChIP-exo nos permite estudiar cómo múltiples factores de transcripción reconocen y regulan el ADN diana.
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Visión general
Este estudio presenta un método de mapeo genómico que mejora la resolución de las interacciones proteína-ADN en neuronas de mamíferos. Al utilizar ADN inmunoprecipitado de cromatina tratado con digestión de exoneuklasa seguido de secuenciación de alto rendimiento, el método logra una resolución de mapeo cercana a la base de pares.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Genómica
- Regulación génica
Antecedentes
- Entender las interacciones proteína-ADN es crucial para la regulación génica.
- Los métodos convencionales tienen limitaciones en la resolución del mapeo.
- ChIP-exo ofrece capacidades de detección mejoradas.
- Este método es particularmente útil en el estudio de neuronas de mamíferos.
Propósito del estudio
- Mejorar la resolución del mapeo de las interacciones proteína-ADN.
- Proporcionar un método confiable para el mapeo genómico.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de regulación génica.
Métodos utilizados
- Inmunoprecipitación de cromatina seguida de digestión de exoneuklasa.
- Secuenciación de alto rendimiento para la adquisición de datos.
- Preparación de cuentas magnéticas de proteína G para ChIP.
- Soluciones de mezcla y bloqueo para una unión óptima.
Principales resultados
- Se logró una resolución cercana a la base de pares en el mapeo.
- Se demostró una alta relación señal-ruido en los resultados.
- Se validó el método en contextos neuronales de mamíferos.
- Se proporcionaron conocimientos sobre las interacciones proteína-ADN.
Conclusiones
- El método ChIP-exo mejora significativamente la resolución del mapeo.
- Esta técnica es beneficiosa para el estudio de la regulación génica.
- Las aplicaciones futuras pueden mejorar nuestra comprensión de las funciones neuronales.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of protein-DNA interactions enables precise target validation in early discovery by clarifying transcription factor binding sites with near base-pair accuracy. This reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies and supports predictive confidence in lead identification for neurological disease models. The method enhances de-risking of therapeutic hypotheses by distinguishing specific from non-specific genomic signals.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory mechanisms in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Provides high-sensitivity detection of protein-DNA binding with reduced background noise.
- Predictive Value: Supports functional target validation by mapping clustered transcription factor binding patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution binding profiles for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible DNA libraries suitable for downstream sequencing workflows.
- Scalability Value: Enables platform reuse across multiple transcription factors in neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage binding data to disease-relevant gene regulation in stem cell-derived neurons.
- Operational Value: Ensures continuity from target identification to preclinical validation via consistent genomic readouts.
- Risk Mitigation: Supports de-risking of mechanistic models by eliminating false-positive binding signals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by delivering precise genomic binding data that informs target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-resolution mapping of transcription factor occupancy.
- Screening: Enables assay readiness via standardized, exonuclease-digested DNA libraries with uniform fragment sizes.
- Analytics: Delivers quantitative binding signals that allow comparison of protein-DNA interactions across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating binding sites in disease-relevant neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable genomic mapping capability for multiple targets in neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through near base-pair mapping resolution.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled exonuclease digestion and library preparation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in binding site identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on high-confidence genomic binding data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin immunoprecipitation and enzymatic DNA processing.
- Dependent on access to magnetic bead handling, exonuclease enzymes, and high-throughput sequencing.
- Needs cross-team standardization for antibody validation and wash stringency.
- Adaptation considerations include optimization for different transcription factors and neuronal subtypes.
- Practical limitations include input DNA quality and antibody specificity affecting signal clarity.
