Name: Inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprende a inducir lesiones completas de transección medular en ratones C57BL/6 mediante laminectomía precisa con taladro fino. Este protocolo quirúrgico estandarizado garantiza alta reproducibilidad y supervivencia para modelar respuestas al tratamiento en neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado por un estipendio de estudiante internacional (PhD) de la Universidad Griffith a RR, una beca de la Fundación Perry Cross a JE y JSJ, una beca de la Fundación Clem Jones a JSJ y JE, y una subvención de la Comisión de Seguros de Accidentes de Motor de Queensland a JSJ y JE.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de ética animal de la Universidad Griffith (ESK/04/16 AEC y MSC/04/18 AEC) bajo las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia.
1. Procedimiento de instalación animal para la cirugía
<ol><li>Anestesar y estabilizar al animal.<ol>
<li>Utilice ratones C57BL/6 hembras de 8 a 10 semanas de edad. Utilice 5% de isoflurano en 1 L/min de oxígeno para la inducción de la anestesia. Para el mantenimiento de la anestesia, utilice 1.5–2% de isoflurano en 1 L/min de oxígeno. Confirme la anestesia apropiada estableciendo una falta de reflejo de dolor en la cola y las patas traseras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Administrar buprenorfina (0,03 mg/kg de peso corporal) para analgesia y enrofloxacino (10 mg/kg de peso corporal) para la cobertura de antibióticos, por vía subcutánea según el peso corporal. Meloxicam (2 mg/kg de peso corporal) se puede administrar para la analgesia a largo plazo si es necesario.</li>
	<li>Mantenga la temperatura corporal del animal a 37 oC con una almohadilla calefactora<ol>
<li>Afeitar el pelaje de la espalda para exponer el área quirúrgica sobre la columna dorsal. Retire el pelaje afeitado del área quirúrgica antes de esterilizar el lugar de la incisión. Esterilice la zona afeitada con hisopos de algodón estéril empapados en líquido antiséptico de yodo povidona y espíritu quirúrgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pegue las patas del ratón en el área quirúrgica para estabilizar al animal (Figura 1A). Coloque una cortina de ventana ovalada sobre el ratón (Figura 1B).</li>
</ol>2. Laminectomía
<ol><li>Haga una incisión vertical en la línea media a nivel vertebral T10 usando un bisturí quirúrgico.<ol>
<li>Localice el proceso espinoso de la vértebra T10 para determinar el sitio de laminectomía. El cuerpo de la vértebra se encuentra ligeramente craneal en la punta del proceso espinoso8 (ver Figura 2). La punta descansa aproximadamente en el punto medio de la vértebra T118.</li>
		<li>Haga la incisión de 2,5 cm de largo, de modo que la columna vertebral de la vértebra T10 esté aproximadamente en la mitad de la longitud de la incisión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reflejar la piel y retraer con retractores.<ol>
<li>Utilice los fórceps rectos para levantar la piel de la fascia subyacente. Esto creará espacio para que se coloquen los retractores; mantendrán abierto el campo quirúrgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar la disección contundente del tejido subcutáneo y la fascia para exponer los procesos espinosos.<ol>
<li>Utilice el borde romo del bisturí para hacer una pequeña incisión de línea media en el tejido subcutáneo y la fascia subyacente para exponer las espinas de las vértebras T9–T11. Utilice los fórceps de punta fina (no afilados) para realizar una disección contundente y reflejar la fascia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Divide y separa los músculos para-espinosos para exponer las láminas.<ol>
<li>Usa la punta contundente del bisturí para dividir los músculos del tronco dorsal y los músculos para-espinosos a lo largo de las espinas de las vértebras T9-T11. Utilice los fórceps finos contundentes para realizar la disección contundente de los músculos en capas y exponer las láminas de las vértebras. Esto debería minimizar cualquier sangrado. NOTA: Si hay algún sangrado, utilice riego de solución salina caliente (37 oC) y hisopos de algodón para controlarlo y eliminar la sangre del campo quirúrgico.</li>
		<li>Utilice los mismos fórceps para hacer pequeños bolsillos alrededor de los procesos transversales de la vértebra T10. Utilice los fórceps curvos para estabilizar el cuerpo vertebral T10 enganchando sus puntas bajo los procesos transversales, en los bolsillos creados (Figura 1C).</li>
		<li>Enjuague bien las láminas T10 con solución salina tibia y limpie suavemente con hisopos de algodón para visualizar claramente la superficie ósea. Asegúrese de que no queden accesorios musculares y ligamentos a lo largo de la superficie bilateralmente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice un taladro con una punta fina (0,55 mm de diámetro, 7 mm de longitud) para romper las láminas bilateralmente.<ol>
<li>Utilice la punta de la broca para trazar un camino vertical desde el espacio intervertebral T9–T10 hasta el espacio intervertebral T10–T11 a lo largo de ambas láminas T10, sin encender el taladro. Esto es para asegurarse de que la broca no captura ningún tejido (Figura 1D).</li>
		<li>Ahora encendiendo el taladro, cavar lentamente y cuidadosamente una zanja vertical en la lámina derecha de la vértebra T10. Esta parte de la laminectomía debe crear un defecto quirúrgico preciso en todo el grosor del hueso en una línea vertical recta. Mantenga el agarre con los fórceps curvos para mantener la vértebra estable.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asegúrese de que la punta del taladro no penetre a través del hueso y lesione la médula espinal. Repita el mismo proceso en el lado izquierdo de la lámina, manteniendo la vértebra estable con los fórceps curvos. Irrigar con solución salina tibia para lavar los fragmentos óseos restantes.</li>
	<li>Levante y retire la parte posterior del arco neural (Figura 1F).<ol>
<li>Utilice los fórceps de punta fina en ángulo para agarrar el proceso espinoso y eliminar todo el segmento dorsal de las láminas separados por la perforación bilateral. Irrigar y frotar de nuevo si hay algún sangrado, para visualizar claramente la médula espinal expuesta debajo de la ventana de laminectomía(Figura 1E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transección
<ol><li>Inducir la lesión de la médula espinal mediante la transección de la cuerda expuesta con una sola rebanada de la hoja.<ol>
<li>Utilice la hoja estrecha y redonda para cortar el cordón en el centro de la ventana de laminectomía. Asegúrese de barrer los huecos laterales de la columna vertebral para inducir una lesión de transección completa(Figura 1G).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirme la integridad de la lesión por transección utilizando los fórceps de punta fina contundentes y retire las conexiones restantes en el sitio de transección.</li>
	<li>Controle el sangrado si existe, antes de cerrar las capas quirúrgicas.</li>
	<li>Utilice la solución salina caliente para regar y eliminar cualquier sangrado que se produzca de los tocones del cordón transectado. Use un hisopo de algodón para aplicar una presión suave para lograr hemostasia si es necesario. Tenga cuidado de no comprimir la médula espinal.</li>
</ol>4. Cierre y atención postoperatoria inmediata
<ol><li>Reúne los músculos y sutura en capa.<ol>
<li>Una vez que se logra la hemostasia en el sitio de la transección, libere el agarre de los fórceps curvos en las vértebras T10. Reúne los bordes de los músculos diseccionados a lo largo de la línea media para lograr una buena aposición.</li>
		<li>Suturar los músculos en una capa usando 5-0 poliglactin 910 suturas absorbibles. Asegúrese de que la curvatura natural de la columna vertebral no cause ninguna tensión en la línea de sutura o abra las suturas, exponiendo el sitio de laminectomía.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cierre el tejido subcutáneo y la piel.<ol>
<li>Utilice 5-0 suturas de seda no absorbibles para cerrar la incisión de la piel. Asegúrese de que no haya sangrado, coágulos o restos debajo de la piel antes del cierre. Un riego final con solución salina caliente puede ser necesario en este paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detengan la anestesia. Observar al animal durante 10-30 minutos hasta la recuperación. El animal debe permanecer en la almohadilla de calentamiento durante este tiempo. Proporcione gel de agua y alimentos hidratados en la jaula.</li>
	<li>Para la atención postoperatoria, incluya buprenorfina (dos veces al día), enrofloxacino (una vez al día) durante los dos primeros días de profilácticamente. Además, vacíe manualmente la vejiga al menos dos veces al día, adhiriéndose a las directrices del comité de ética animal. NOTA: Los animales de este experimento fueron evaluados dos veces al día por su salud y bienestar general, que incluían la comprobación de dolor persistente (para dar dosis adicionales de buprenorfina) o infección (enrofloxacino adicional), su estado de nutrición e hidratación (dar líquido inyectable si está deshidratado) y cualquier signo de autotomía (proporcionar cuidado de la herida si autotomía menor). Se recomienda encarecidamente que estos aspectos de la atención postoperatoria, incluidas las decisiones de eutanasia, se determinen con la orientación del comité institucional de ética animal.</li>
</ol>5. Evaluación del modelo de lesión
<ol><li>Establecimiento de la pérdida de la función motora.<ol>
<li>Evaluar el comportamiento motor en los ratones lesionados 2, 7, 14, 21 y 28 días después de la lesión en un campo abierto utilizando la Escala de Ratón Basso (BMS) para determinar la pérdida de la función9 (Figura 3C–E).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirmación histológica de lesiones<ol>
<li>Cosechar las médulas espinales lesionadas con las columnas vertebrales después de la eutanasia (hecho con dióxido de carbono en este experimento, según lo aprobado por el comité de ética animal).</li>
		<li>Fijar el tejido por inmersión durante la noche en 4% de paraformaldehído y descalcificar los huesos mediante tratamiento con 20% de ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA) durante 3 semanas, reemplazando EDTA fresca cada 48 h.</li>
		<li>Preparar las espinas descalcificadas para la crio-sección y cortarlas en secciones de 30 m de espesor.</li>
		<li>Monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina para inmunomantelación con anticuerpos anti-GFAP y Hoechst 33342.</li>
		<li>Imagen de las diapositivas en un microscopio fluorescente (Figura 3A) y realizar mediciones del tamaño de la lesión utilizando el software de análisis de imágenes (por ejemplo, el software de análisis Nikon - NIS Elements [Figura 3B]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharif-Alhoseini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+spinal+cord+injury%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Animal models of spinal cord injury: a systematic review.</a> Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).</li>
<li>Lee, D. H., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+axon+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Animal models of axon regeneration after spinal cord injury.</a> Neuroscience Bulletin. 29 (4), 436-444 (2013).</li>
<li>Sharif-Alhoseini, M., Rahimi-Movaghar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharif-Alhoseini%2C+M+%22Topics+in+Paraplegia%22">Topics in Paraplegia</a>. Dionyssiotis, Y. , IntechOpen. (2014).</li>
<li>Talac, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+spinal+cord+injury+for+evaluation+of+tissue+engineering+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies.</a> Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).</li>
<li>Nakae, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+animal+model+of+spinal+cord+injury+as+an+experimental+pain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The animal model of spinal cord injury as an experimental pain model.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 939023(2011).</li>
<li>Kwon, B., Oxland, T., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+used+in+spinal+cord+regeneration+research%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Animal models used in spinal cord regeneration research.</a> Spine. 27, 1504-1510 (2002).</li>
<li>Kundi, S., Bicknell, R., Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+current+mammalian+models%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: current mammalian models.</a> American Journal of Neuroscience. (4), 1-12 (2013).</li>
<li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li>
<li>Basso, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basso+Mouse+Scale+for+locomotion+detects+differences+in+recovery+after+spinal+cord+injury+in+five+common+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).</li>
<li>Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+from+spinal+cord+injury%3A+a+new+transection+model+in+the+C57Bl%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse.</a> Journal of Neuroscience Research. 67 (3), 337-345 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este método induce una lesión completa del tipo de transección a nivel vertebral T10 en ratones, lo que resulta en una paraplejia completa del animal, por debajo del nivel de lesión. En general, este método resulta en un sangrado mínimo, daños colaterales insignificantes y una lesión estable y reproducible. En comparación con los métodos de transección publicados anteriormente sin laminectomía10,este método ofrece los beneficios en términos de visualización directa sin manipular la curvatura de la...

La lesión de la médula espinal (SCI) es un problema médico complejo que resulta en cambios drásticos en la salud y el estilo de vida. No existe una cura para la SCI, y la fisiopatología de sci no se entiende a fondo. Los modelos animal SCI, en particular los modelos de roedores, ofrecen una herramienta invaluable para probar nuevos tratamientos, y se han utilizado para explorar SCI durante décadas. Hasta la fecha, más del 72% de los estudios preclínicos de SCI han empleado modelos de ratas, en comparación con sólo un 16% que han utilizado ratones1. Aunque las ratas, debido a su mayor tamaño y tendencia a formar caries similares a los ICA humanos, han sido tradicionalmente los animales modelo preferidos para el estudio de nuevos enfoques terapéuticos, los ratones (incluyendo muchos modelos de ratón transgénicos) ahora se utilizan con más frecuencia para estudiar los mecanismos celulares y moleculares del SCI2. El modelo de ratón ofrece beneficios adicionales en términos de manejo más fácil, tasas de reproducción más rápidas y costos más bajos que las ratas; los ratones también presentan un alto grado de similitud genómica con los seres humanos1,2,3. La principal desventaja del modelo de ratón se ha identificado como el tamaño significativamente más pequeño que crea desafíos para las intervenciones quirúrgicas para la creación y el tratamiento de lesiones de la médula espinal4,5.
Hay una brecha en la literatura existente que pone de relieve la necesidad de un protocolo quirúrgico robusto y reproducible para inducir SCI estable en el modelo de ratón. Por lo tanto, proporcionamos un enfoque quirúrgico novedoso y preciso en este protocolo para superar estas limitaciones. Este protocolo proporciona directrices en profundidad para inducir una lesión de tipo transección en ratones, ya que este tipo de lesión ha sido reconocido como el más adecuado para estudiar los cambios regenerativos y degenerativos después de una lesión6,así como la neuroplasticidad, los circuitos neuronales y los enfoques de ingeniería tisular7. Hemos optado por inducir la lesión en la región torácica inferior, ya que el SCI de nivel torácico se utiliza más comúnmente en la literatura1.

<table><tbody><tr><td>Baytril inyectable 50 mg/mL, 50 mL</td><td>Provet</td><td>BAYT I</td><td>Medicamento para el cuidado postoperatorio</td></tr><tr><td>Betadine 500 mL</td><td>Provet</td><td>BETA AS</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Portaagujas Castroviejo, con bloqueo</td><td>ProSciTech</td><td>T149C</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de circonita cerámica reutilizable, redonda con lados afilados, de un solo filo, en ángulo</td><td>ProSciTech</td><td>TXD101A-X</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón reutilizables ( 5pcs)</td><td>Multigate</td><td>21-893</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Dremel Micro</td><td>DREMEL</td><td>8050-N/18</td><td>Herramienta rotativa inalámbrica</td></tr><tr><td>Pinzas de vendaje finas</td><td>Multigate</td><td>06-306</td><td>Brocas desechables de un solo uso</td></tr><tr><td></td><td>Kemmer Pr&auml; zision</td><td>SM 32 M 0550 070</td><td>Reutilizable</td></tr><tr><td>Pinza de #7b Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont reutilizables, estilo 5</td><td>ProSciTech</td><td>T05-822</td><td></td></tr><tr><td>Recortadora de pelo</td> reutilizable <td>WAHL</td><td>WA9884-312</td><td>Zero Overlap Hair Trimmer</td></tr><tr><td>Tijeras de iris, Ti, puntas afiladas, rectas, 90mm</td><td>ProSciTech</td><td>TY-3032</td><td>Reutilizable</td></tr><tr><td>Isoestesia de isoflurano NXT 250</td><td>Provet</td><td>ISOF 00 HS</td><td>Agente anestésico</td></tr><tr><td>Colibri Retractor - 4cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td> reutilizable <td>ProSciTech</td><td>T133</td><td>Reutilizable</td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos de látex Signature talla 7.5</td><td>Medline</td><td>MSG5475</td><td>Consumible</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio 0.9%</td><td>STS</td><td></td><td>PHA19042005 Consumible</td></tr><tr><td>Pack Apósito Estéril Multigate</td><td></td><td>08-709</td> Líquido Estéril <td>Desechable de un solo uso</td></tr><tr><td>Cortina Impermeable 60x60 cm</td><td>Multigate</td><td>29-220</td><td>Aguardiente quirúrgico desechable de un solo uso</td></tr><tr><td>100 mL</td><td>Provet</td><td># SURG SP</td><td>Material de sutura consumible</td></tr><tr><td>- SILK BLK 45CM 5/0 FS-2</td><td>Johnson & Johnson Medical</td><td>682G</td><td>Material de sutura de sutura de seda</td></tr><tr><td>- Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2</td><td>Johnson & Johnson Medical</td><td>VCP421H</td><td>Vicryl Suture</td></tr><tr><td>Temgesic 0,3 mg en 1 mL, x 5 ampollas (fármaco de clase S8)</td><td>Provet</td><td>TEMG I</td><td>Fármaco para el cuidado postoperatorio</td></tr></tbody></table>

inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

La lesión de la médula espinal (SCI) conduce en gran medida a la pérdida irreversible y permanente de la función, más comúnmente como resultado de un trauma. Se están investigando varias opciones de tratamiento, como los métodos de trasplante celular, para superar las discapacidades debilitantes derivadas del SCI. La mayoría de los ensayos preclínicos en animales se llevan a cabo en modelos de roedores de SCI. Mientras que los modelos de ratas de SCI han sido ampliamente utilizados, los modelos de ratón han recibido menos atención, a pesar de que los modelos de ratón pueden tener ventajas significativas sobre los modelos de ratas. El pequeño tamaño de los ratones equivale a reducir los costos de mantenimiento animal que para las ratas, y la disponibilidad de numerosos modelos de ratón transgénicos es ventajosa para muchos tipos de estudios. Inducir lesiones repetibles y precisas en los animales es el principal desafío para la investigación de SCI, que en pequeños roedores requiere cirugía de alta precisión. El modelo de lesión de tipo transección ha sido un modelo de lesión de uso común durante la última década para la investigación terapéutica basada en trasplantes, sin embargo, no existe un método estandarizado para inducir una lesión completa de tipo de transección en ratones. Hemos desarrollado un protocolo quirúrgico para inducir una lesión de tipo de transección completa en ratones C57BL/6 a nivel vertebral torácico 10 (T10). El procedimiento utiliza un pequeño taladro de punta en lugar de rongeurs para eliminar con precisión la lámina, después de lo cual se utiliza una hoja delgada con filo de corte redondeado para inducir la transección de la médula espinal. Este método conduce a lesiones reproducibles de tipo transección en pequeños roedores con un daño muscular y óseo colateral mínimo y, por lo tanto, minimiza los factores de confusión, específicamente cuando se analizan los resultados funcionales conductuales.

El método resultante, tal como se muestra en la Figura 1,implica una estabilización adecuada del ratón (Figura 1A) y una buena visualización de la columna vertebral y el tejido paraspinos (Figura 1B). El proceso espinoso y las láminas se pueden visualizar claramente con una mínima disección muscular y pérdida de sangre(Figura 1C,zona resaltada). La perforación de punta fina se realiza como se muestra en...

Este protocolo describe cómo crear una laminectomía precisa para la inducción de lesiones medulares estables de tipo transección en el modelo de ratón, con un daño colateral mínimo para la investigación de lesiones de la médula espinal.

Inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

Este protocolo proporciona una lesión precisa y controlada quirúrgicamente para inducir una transección completa de la médula espinal en ratones con una alta reproducibilidad y tasas de supervivencia muy altas. El uso de un taladro fino para la lesión ósea minimiza el daño al tejido circundante, permitiendo que las respuestas de la lesión y el tratamiento se modelen con mayor precisión. Para realizar una laminectomía, después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en una hembra anestesada de ocho a 10 semanas de edad C57 negro 6 ratón, afeitar la piel de la espalda para exponer el área quirúrgica sobre la columna dorsal y esterilizar la zona afeitada con hisopos de algodón estéril empapados en povidona yodo antiséptico líquido y espíritu quirúrgico.Usando un bisturí, haz una incisión vertical de línea media a nivel vertebral T10 y usa fórceps rectos para levantar la piel de la fascia subyacente para facilitar la colocación del retractor. Para exponer las espinas de las vértebras T9 a T11, utilice el borde romo del bisturí para hacer una pequeña incisión de línea media en el tejido subcutáneo y fascia subyacente y utilice fórceps no afilados de punta fina para difundirse y reflejar la fascia. Para exponer las láminas, utilice la punta contundente del bisturí para dividir el tronco dorsal y los músculos paraspinos a lo largo de las espinas del T9 a través de las vértebras T11 y utilice los fórceps finos contundentes para diseccionar los músculos de las capas para exponer las láminas de las vértebras.Utilice los mismos fórceps para hacer pequeños bolsillos alrededor de los procesos transversales de la vértebra T10 y enganchar las puntas de los fórceps curvos bajo los procesos transversales dentro de los bolsillos creados para estabilizar el cuerpo vertebral T10. Enjuague bien las láminas T10 con solución salina tibia y use hisopos de algodón para limpiar suavemente la superficie ósea, teniendo cuidado de que no queden accesorios musculares o ligamentos a lo largo de la superficie bilateral. Para romper las láminas bilateralmente, utilice una punta de broca de siete milímetros de diámetro y siete milímetros de longitud para trazar un camino vertical desde el espacio intervertebral T9/T10 hasta el espacio intervertebral T10/T11 a lo largo de ambos laminados T10 con el taladro apagado.Cuando el camino haya sido trazado, encienda el taladro y haga lentamente y cuidadosamente una zanja vertical en la lámina derecha de la vértebra T10, utilizando los fórceps curvos para mantener la vértebra estable. Después de repetir el proceso en el lado izquierdo de la lámina, irrigar el tejido con solución salina tibia para lavar los fragmentos óseos restantes. Mantener un buen agarre en la columna vertebral con una mano es esencial para este paso.También es importante sentirse cómodo y seguro con el uso del taladro. A continuación, utilice los fórceps de punta fina en ángulo para agarrar el proceso espinoso y eliminar todo el segmento dorsal de las láminas separados por la perforación bilateral. Luego, irrigar y hisopo según sea necesario para permitir una visualización clara de la médula espinal dentro de la ventana de laminectomía.Para inducir la lesión de la médula espinal dentro de la cuerda expuesta, utilice una cuchilla estrecha y redonda con filo para cortar la cuerda en el centro de la ventana de laminectomía, teniendo cuidado de barrer los huecos laterales de la columna vertebral para inducir una lesión de transección completa. Para confirmar la integridad de la lesión por transección, utilice los fórceps de punta fina contundentes para eliminar las conexiones restantes en el sitio de transección. Una vez que se ha logrado la hemostasia en el sitio de la transección, suelte el agarre del forcep curvo en la vértebra T10 y reúna los bordes de los músculos diseccionados a lo largo de la línea media para lograr una buena aposición.Usando 5/0 poliglactin 910 suturas absorbibles, suturar los músculos en capas, asegurándose de que la curvatura natural de la columna vertebral no causa ninguna tensión en la línea de sutura o abrir las suturas. Luego, utilice suturas de seda no absorbibles 5/0 para cerrar el tejido subcutáneo y la piel, teniendo cuidado de que no haya sangrado, coágulos o restos que queden debajo de la piel antes del cierre. Para evaluar si este método para inducir la lesión de la médula espinal de tipo transección en ratones es reproducible y consistente, la médula espinal lesionada se puede analizar mediante inmunohistoquímica y se pueden realizar pruebas conductuales en los ratones.El inmunoetiquedo contra el marcador de astrocitos, proteína ácida fibribrillaria glial, facilita la demarcación del límite de la médula espinal intacta. En esta sección longitudinal, el lugar de la lesión situado se puede visualizar entre los tocones del cordón como se esperaba. Un defecto de tamaño consistente se puede inducir en el sitio de transección con una distancia mínima media de 550,4, más o menos 17,3 micrómetros.Los datos conductuales que despliegan la escala de ratón Basso de una prueba de campo abierto muestran que los ratones lesionados no presentan ningún movimiento de las extremidades posteriores después de la lesión. Por lo tanto, el protocolo produce una lesión completa y fiable del tipo de transección que resulta en una pérdida completa de la función por debajo del nivel de lesión que no conduce a la reversión espontánea de la parálisis. Tenga cuidado de perforar en línea recta con una mano estable, ya que puede ser muy difícil reparar la ventana de laminectomía una vez que se ha perforado incorrectamente.Después de la inducción de la lesión de la médula espinal, se pueden aplicar varias opciones de tratamiento, como la administración de medicamentos y el trasplante celular para identificar posibles terapias que mejoren la recuperación de lesiones de la médula espinal.

induction-of-complete-transection-type-spinal-cord-injury-in-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Un examen longitudinal de la pérdida ósea en los fémures y tibias de ratones adultos se llevó a cabo después de una lesión de la médula espinal utilizando secuencial de dosis baja de rayos X de los análisis. La pérdida de hueso tibia se detectó durante todo el estudio, mientras que la pérdida ósea en el fémur no se detectó hasta 40 días después de la lesión.

Evaluación longitudinal de ratón posteriores pérdida de masa ósea del miembro después de una lesión de la médula espinal utilizando Novel, En vivo Metodología

Fuente: Elzat, E. Y. Y., et al., Establecimiento de un modelo de lesión medular por contusión en ratón basado en una técnica mínimamente invasiva. J. Vis. Exp. (2022). Este video muestra el método para inducir una lesión por contusión a nivel de la médula espinal T9 en un modelo de ratón, utilizando una plataforma coaxial para lesiones de la médula espinal. Se deja caer un peso sobre la médula espinal a nivel T9 que crea una contusión que inmediatamente causa decoloración e hinchazón del tejido.

Inducción de una contusión de la médula espinal en un modelo de ratón utilizando una plataforma coaxial para lesiones de la médula espinal

Fuente: Kumar, S., et. al. Modelo de ratón de úlceras por presión después de una lesión de la médula espinal. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra una inducción detallada de la lesión de la médula espinal en ratones. El ratón anestesiado se disecciona para exponer las vértebras T9-T10 y se extirpan sus apófisis espinosas. A continuación, se secciona la médula espinal expuesta para infligir la lesión. A continuación, se cierra el área quirúrgica y se permite que el ratón se recupere.

Generación de un modelo de ratón con una lesión medular

Controlado lesiones laceración cervical en ratones

Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

La fototrombosis es un procedimiento mínimamente invasivo y altamente reproducible para inducir isquemia focal en la médula espinal y sirve como modelo de lesión de la médula espinal en ratones.

Photothrombosis inducida por isquemia focal como un modelo de lesión de médula espinal en ratones

Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (LME) reproducible en el ratón neonatal. El modelo proporciona una plataforma ventajosa para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

Presentamos un modelo de lesión en la médula espinal basado en el desplazamiento del tejido que puede producir una lesión consistente de la médula espinal contusa en ratones adultos.

Un modelo de lesión de la médula espinal contundente basado en el desplazamiento de tejidos en ratones

Las técnicas mínimamente invasivas y un dispositivo de laboratorio simple mejoran la reproducibilidad del modelo de lesión de la médula espinal al reducir el daño operatorio a los animales de experimentación y permitir el mantenimiento de la morfología anatómica. El método vale la pena porque los resultados confiables y el procedimiento reproducible facilitan las investigaciones de los mecanismos de reparación de enfermedades.

Establecimiento de un modelo de lesión de la médula espinal por contusión en ratones basado en una técnica mínimamente invasiva

El protocolo actual, que simula el síndrome del cordón central (CCS) en ratones, ha mejorado la repetibilidad y minimizado el daño operativo a los animales de experimentación, evitando alterar excesivamente la estructura anatómica. La estrategia de este estudio es ventajosa porque permite investigar los mecanismos de lesión al producir resultados consistentes.

Establecimiento del modelo de síndrome de cordón central en ratón C57BL/6J

Aquí se presenta un novedoso dispositivo automatizado de contusión por lesión de la médula espinal para ratones, que puede producir con precisión modelos de contusión por lesión de la médula espinal con diversos grados.

Impactador automatizado para el modelo de lesión medular contusiva en ratones

Aprende a inducir lesiones completas de transección medular en ratones C57BL/6 mediante laminectomía precisa con taladro fino. Este protocolo quirúrgico estandarizado garantiza alta reproducibilidad y supervivencia para modelar respuestas al tratamiento en neurociencia.

Inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones

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