Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

El objetivo general del siguiente experimento de diseño genéticamente rastreable, Caenorhabditis elegans, es identificar las interacciones de chaperonas específicas de tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que combina ensayos fáciles de usar, como el ajuste de la IA del Golán, y lecturas de comportamiento para exponer nuevas interacciones específicas de tejidos. Para una sincronización embrionaria no estresante, use un palillo de lombriz para mover alrededor de 100 huevos de una placa de lombriz no sincronizada a una placa NGM recién asentada y cultive los animales de acuerdo con el programa experimental apropiado.

Cuando los animales lleguen al primer día de puesta de huevos, agregue lentamente un mililitro de tampón M9 al plato, distante del césped bacteriano, y gire el plato para que el tampón cubra completamente el plato. Incline el plato hacia un lado para eliminar el líquido y lavar los animales del plato. Cuando todos los gusanos se hayan lavado de la placa, use una punta de pipeta de plástico estándar para cortar un cuadrado de agar alrededor de donde se concentran los huevos y coloque la pieza de agar en una placa de NGM recién colocada.

Cultivar los huevos en las mismas condiciones de cultivo. Al final de la incubación, la placa debe cubrirse con huevos sincronizados. Después de lavar todos los animales del plato como se acaba de demostrar, agregue un mililitro de tampón M9 fresco y use un raspador de células para liberar los huevos del plato.

Cuando se hayan desprendido todos los huevos, transfiera todo el volumen de tampón de la placa a un tubo cónico para la centrifugación. Centrifugar el tubo y desechar el sobrenadante. Después de retirar el sobrenadante, agregue hasta un mililitro de tampón M9 fresco a la placa y pipetea para volver a suspender los huevos.

Lave los huevos cinco veces más como se acaba de demostrar. Después del último lavado, la pelletza de huevo debe aparecer blanca y se pueden eliminar todos los microlitros de sobrenadante, excepto los últimos 200. Para cultivar nematodos sincronizados para un experimento, coloque una gota de unos 30 huevos cerca del césped bacteriano y cada placa de ARN de interferencia asentada y unos 30 huevos en una placa asentada con un vector vacío que contenga bacterias.

A continuación, cultivar los animales en las condiciones de cultivo adecuadas según el protocolo experimental. Para evaluar la letalidad embrionaria de los animales sincronizados, cuando los animales comiencen a poner huevos, transfiera unos 100 huevos a un plato vacío y distribuya los huevos en filas para simplificar el conteo. Después de 24 a 48 horas, anote el porcentaje de huevos sin eclosionar.

Como referencia, compare los huevos de animales experimentales con los huevos de animales tratados con bacterias de control de vectores vacíos. Para establecer un ensayo de parálisis, cultive animales sincronizados con la edad con bacterias de control de vectores vacías, hasta que los animales alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos. Use un marcador fino para dibujar una línea en la parte posterior de un plato de agar NGM regular y coloque de cinco a diez animales en la línea marcada.

Establezca un temporizador de 10 minutos y anote el porcentaje de animales que permanecen en la línea como gusanos paralizados. Como referencia, compare estos datos con el porcentaje de animales mutantes criados con bacterias de control de vectores vacíos. Para la validación de la eliminación de proteínas, coloque de 250 a 300 huevos sincronizados en una placa de ARN de interferencia NGM de 60 milímetros asentada con el ARN bicatenario correspondiente que expresa o el vector vacío que contiene bacterias, y cultive los huevos durante el período experimental apropiado.

Al final de la incubación, transfiera un total de 200 animales adultos jóvenes a la tapa de un tubo de 1,5 mililitros que contiene 200 microlitros de PBST mantenidos a la temperatura de cultivo de los animales. Cierre la tapa con cuidado y centrifugue los animales a 1000 veces G durante 1 minuto. Al final de la centrifugación, agregue 800 microlitros de PBST fresco al tubo y vuelva a centrifugar los gusanos.

Retire con cuidado los 900 microlitros superiores del sobrenadante y lave los nematodos en PBST fresco 3 veces más como se acaba de demostrar. Después del último lavado, retire todos menos los últimos 100 microlitros del sobrenadante y agregue 25 microlitros de tampón de muestra 5X a los animales. Caliente las muestras durante 10 minutos a 92 grados centígrados y 1000 revoluciones por minuto, antes de cargar 20 microlitros de cada muestra en un gel de página SDS.

A continuación, realice el análisis de Western blot utilizando los anticuerpos adecuados para determinar la estabilidad relativa de la proteína de interés, y utilice software densitométrico para determinar la intensidad de las prohibiciones. HSP6 derribado durante el desarrollo da como resultado una fuerte detención del desarrollo en animales de tipo salvaje. Al mismo tiempo, HSP6 desactivado en una cepa de ARN de interferencia específica del músculo que expresa RDE1 de tipo salvaje en el tejido muscular no causa detención del desarrollo.

Mientras que HSP6 derribó una cepa de ARN específica del intestino que expresa RDE1 de tipo salvaje en las células intestinales, lo que da como resultado una fuerte detención del desarrollo y el fenotipo. Por lo tanto, una mutación en HSP6 MG585 que causa un retraso leve en el crecimiento puede usarse para detectar el agravamiento o el alivio de las interacciones de las chaperonas mediante el cruce de una cepa portadora de ese gen mutado en una cepa de ARN de interferencia específica intestinal y la detección de la biblioteca de ARN de interferencia de chaperonas. La organización de miosinas y los animales mutantes UNC45 tratados con ARN de interferencia STI1 AHSA1 o DAF41 es similar a la de los gusanos de tipo salvaje en la cuarta etapa larvaria.

Aunque los mutantes exhiben sarcómeros alterados después de alcanzar la edad adulta. Por el contrario, tanto los animales mutantes UNC45 tratados con un control de vector vacío como los animales de tipo salvaje no se ven afectados. Las interacciones genéticas no son indicativas de interacción física.

Por lo tanto, se deben realizar experimentos de seguimiento utilizando el cribado de interacciones genéticas para validar y examinar directamente la naturaleza de las interacciones identificadas.