Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.

Este modelo Hep G2 proporciona un sistema de pruebas in vitro alternativo relevante para evaluar de manera más confiable la posible inducción de daño fijo en el ADN después de la exposición a largo plazo a nanomateriales con el objetivo de minimizar la necesidad de pruebas en animales. El modelo de esferoide Hep G2 posee la capacidad de permanecer viable y funcional durante un período de 14 días, así como de mantener un nivel adecuado de proliferación. Esto respalda las pruebas de una variedad de criterios de valoración bioquímicos y de genotoxicidad, incluido el ensayo de micronúcleos.

Antes de intentar este protocolo, te sugiero que primero hagas algunas carreras de práctica. Tenga cuidado al sembrar o cambiar los medios de las células, ya que estos requieren un enfoque delicado. Comience agregando 100 microlitros de PBS estéril a temperatura ambiente a los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos.

Invierta la tapa de la placa y pipetee con cuidado 20 gotas de microlitros de la suspensión celular en el centro de cada ranura de pocillo de la tapa. Utilice una pipeta multicanal, añadiendo de dos a cuatro gotas a la vez, para garantizar la precisión de la colocación. Solo siembra cuatro esteroides a la vez y asegúrate de que las puntas de las pipetas estén alineadas antes de comenzar.

El ángulo en el que sostenga el multicanal marcará la diferencia en la forma en que se forman los esferoides. Asegúrese de que las gotas estén centradas dentro de las ranuras de los pocillos de la tapa, luego voltee suavemente la tapa sobre el plato para que las gotas cuelguen sobre los pocillos con PBS. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres días antes de la transferencia de esferoides a agarosa.

Después de la incubación, retire la placa de la incubadora y levante con cuidado la tapa de la placa, deseche el PBS, golpee la placa para eliminar cualquier líquido residual y deje que las placas se sequen al aire durante dos o tres minutos. Después de derretir la agarosa, gírela suavemente para eliminar las burbujas y agregue 50 microlitros en la base de cada pocillo. Deje la placa a temperatura ambiente durante dos minutos, luego agregue 100 microlitros de DMEM precalentado encima de la capa sólida de agarosa en cada pocillo.

Vuelva a colocar la tapa con estas gotas de esferoides en la parte superior de la placa para que los esferoides vuelvan a colgar, luego centrifugue la placa durante tres minutos a 200 veces G para transferir los esferoides a los pocillos individuales de la placa. Incube la placa durante otras 24 horas para permitir que los esferoides se asienten. Después de la dispersión de los nanomateriales diseñados, o ENM, diluirlos hasta la concentración final deseada con DMEM precalentado.

Aspire 50 microlitros de medio de cada pocillo con los esferoides y reemplácelo con 50 microlitros de medio con el ENM. Para recolectar los esferoides, utilice una pipeta de 200 microlitros para aspirar los 100 microlitros de medio de cultivo celular con el tejido esferoide de cada pocillo, teniendo cuidado de evitar el contacto con la agarosa. Recoja los esferoides en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros.

Centrifugar la suspensión de esferoide a 230 veces G durante cinco minutos, luego retire el sobrenadante y guárdelo a menos 80 grados Celsius hasta un análisis adicional. Lave la pelletización de esferoides en un mililitro de PBS estéril a temperatura ambiente, luego centrifugue a 230 veces G durante tres minutos y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender los esferoides en 500 microlitros de solución de tripsina-EDTA al 0,05% e incube durante seis a ocho minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de la incubación, pipetee suavemente las células de Hep G2 tripsilizadas hacia arriba y hacia abajo para disociarlas completamente y volver a suspenderlas antes de neutralizarlas con un mililitro de DMEM. Centrifugar la suspensión celular a 230 veces G durante cinco minutos, desechar el sobrenadante y volver a suspender la pastilla celular en dos mililitros de PBS. Para crear una configuración de embudo de cubeta, coloque el portaobjetos de microscopio preparado en el soporte metálico, coloque una tarjeta de filtro encima del portaobjetos y luego asegure el embudo de cubetas en la parte superior.

Coloque los embudos de la cubeta en la citocentrífuga con el embudo hacia arriba para que se puedan agregar 100 microlitros de suspensión celular directamente a cada uno. A continuación, proceda a fijar las diapositivas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Preparar una solución de tinción de Giemsa al 20% diluida en tampón fosfatasa.

Pipetea suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclarla, luego fíltrala con papel de filtro doblado en un embudo. Utilice una pipeta Pasteur para añadir de tres a cinco gotas de solución filtrada de Giemsa al cytodot en cada portaobjetos y déjelo actuar durante ocho a 10 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en dos lavados sucesivos con tampón de fosfatasa.

A continuación, enjuágalos brevemente con agua fría para eliminar el exceso de manchas y déjalos secar al aire. Antes de cualquier evaluación toxicológica in vitro, es importante comprobar que los esferoides 3D de HepG2 se han formado correctamente. Cuatro días después de la siembra, se deben formar esferoides compactos de forma esférica con una superficie lisa y sin proyecciones visuales.

Aquí se muestran esferoides de buena y mala calidad cuatro días después de la siembra. Por lo general, del 90 al 95% de los esferoides formados por placa se formarán correctamente y serán viables para una mayor experimentación. La viabilidad y la funcionalidad similar al hígado se evaluaron durante un período de cultivo de 14 días para determinar la longevidad del modelo de esferoide hepático y establecer si podía respaldar la evaluación de riesgos a largo plazo o basada en productos químicos.

La concentración de albúmina se mantuvo constante durante todo el período de cultivo, mientras que la producción de urea por esferoide aumentó antes de comenzar a disminuir a los 14 días. Para la evaluación de la genotoxicidad, se utilizó el ensayo de micronúcleos para determinar la presencia de micronúcleos después de exposiciones agudas y a largo plazo a ENM. Los esferoides fueron expuestos a dos ENMs, dióxido de titanio y plata.

Se observó una tendencia similar a la genotoxicidad después de la exposición aguda a ambos ENM, pero la respuesta de genotoxicidad elevada no fue evidente después de una exposición prolongada de cinco días. Siguiendo este método, tanto el sobrenadante como los esferoides se pueden recolectar para una multitud de criterios de valoración bioquímicos. Estos incluyen viabilidad celular, ensayos de función hepática, análisis SID 450, marcadores inflamatorios deficientes y expresión génica.

Esta técnica se está probando actualmente en una serie de laboratorios de investigación por contrato que quieren aplicarla a las pruebas rutinarias de geotoxicidad tanto de productos químicos como de nanomateriales. Esto tiene el potencial de reducir la dependencia de los enfoques de prueba in vivo.