Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Este protocolo aborda dos aspectos importantes, la caracterización de una membrana integral esencial, la apolipoproteína aciltransferasa de las bacterias, y el desarrollo del ensayo en formato HDS para el cribado de inhibidores de la enzima. El método es muy sensible y adecuado para fines de detección. Puede contribuir al desarrollo de posibles nuevos antibióticos.

Este vídeo ayudará a destacar los pasos críticos de este protocolo, como la mezcla, el vórtice, la sonicación, mientras se trabaja con suspensiones no homogéneas que contienen lípidos y detergentes. Demostrando el procedimiento estarán Karine Nozeret, Aurelia Pernin, ambas son compañeras de mi grupo. Comience preparando la mezcla de reactivos para el ensayo de apolipoproteína y aciltransferasa o LNT.

Mezcle alquino POPE y FSL-1-biotina con tampón de reacción LNT en tubos de 1,5 mililitros a un volumen final de 18 microlitros. Prepare mezclas de reactivos por triplicado para todas las condiciones probadas. Sonicar las mezclas de reactivos durante tres minutos en un baño de agua ultrasónico e incubarlas a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

A continuación, añada LNT activa o inactiva hasta una concentración final de un nanogramo por microlitro, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante 16 horas en un mezclador térmico con tapa calentada. Mientras tanto, prepare una solución madre de estreptavidina de dos miligramos por mililitro.

Y dilúyelo a 10 microgramos por mililitro para crear una solución que funcione. Agregue 100 microlitros de la solución a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Luego, seque los pozos al aire durante la noche incubando la placa a 37 grados centígrados sin tapa.

Al día siguiente, prepare soluciones madre de 5 milimolares de Azido-FAM, 50 milimolares de TCEP, dos milimolares de TBTA y 50 milimolares de sulfato de cobre pentahidratado. Realice la química de clic añadiendo 0,2 microlitros de material Azido-FAM, 0,4 microlitros de material TCEP y 0,2 microlitros de material TBTA a los tubos de reacción LNT de 1,5 mililitros. Agita la solución en vórtice durante cinco segundos.

A continuación, añada 0,4 microlitros de sulfato de cobre de caldo. Vórtice durante otros cinco segundos e incube la reacción durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Mientras se incuba la mezcla de química de clic, lave los pocillos de las placas recubiertas de estreptavidina tres veces con 200 microlitros de PBST1.

Transfiera 18 microlitros de la mezcla química de clic a un pocillo recubierto de estreptavidina y agregue 100 microlitros de PBST1 para unir el producto N-acil-FSL-1-biotina FAM a la placa. Agregue fluoresceína de biotina a la placa como un control positivo para la unión de estreptavidina y la lectura de fluorescencia. Luego incube la placa a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad, mientras agita a 300 RPM.

Después de la incubación, utilice una pipeta electrónica multicanal para lavar manualmente la placa seis veces con 200 microlitros de PBST2. Enjuague tres veces con la pipeta. Lávalo tres veces con 200 microlitros de PBS y enjuágalo tres veces más.

Agregue 200 microlitros de PBS a cada pocillo y detecte la fluorescencia a 520 nanómetros en un lector de microplacas. Guarde todos los resultados en una hoja de cálculo y, a continuación, calcule la desviación estándar para cada reacción, así como los valores P para los controles negativos y las muestras positivas con una prueba T no apareada. El ensayo LNT in vitro descrito aquí utiliza fosfolípidos que contienen un ácido graso alquino y FSL-1-biotina como sustratos para formar alquino FSL-1-biotina.

Tras una reacción química de clic con Azido-FAM, este producto se marca con fluorescencia y es detectable por espectrometría de fluorescencia. Las condiciones de reacción se optimizaron para una lectura de fluorescencia máxima a 520 nanómetros. Los controles negativos incluyeron reacciones sin enzima, con una variante inactiva de la enzima, o con inhibidor específico de tiol, MTSES.

La fluoresceína de biotina se utilizó como control interno para la señal de fluorescencia máxima. Con el fin de desarrollar un ensayo de cribado de alto rendimiento, las reacciones se realizaron directamente en 384 placas de pocillos. Se automatizaron los pasos de lavado y se redujo la cantidad de reactivos.

La reacción fue sensible y reproducible, con una diferencia significativa en la señal fluorescente entre el control negativo y la enzima activa. Para el cribado de alto rendimiento, el factor primo Z determina si una respuesta en un ensayo es lo suficientemente grande para fines de cribado. El factor primo Z promedio fue mayor que 0.6 para el ensayo LNT realizado en un formato de 384 pocillos, lo que sugiere que fue sobresaliente.

El ensayo de tubo de este vídeo se ha desarrollado en un formato multiplaca que es compatible con HDS. Se puede utilizar para estudiar otras aciltransferasas de una variedad de organismos.