Seguimiento de linaje y análisis clonal en el desarrollo de la corteza cerebral mediante el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM)
8 de mayo de 2020
Se presenta un protocolo para realizar el rastreo de linajes y el análisis genético funcional de genes candidatos a un solo nivel de células utilizando el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM). El análisis clonal de MADM proporciona un marco cuantitativo para medir el comportamiento proliferativo, la producción celular y la relación de linaje de los progenitores individuales y sus células hijas.
El análisis de mosaico con tecnología Double Markers es un método potente que puede proporcionar información altamente cuantitativa sobre el comportamiento de proliferación y las salidas de bodega de las células madre de los individuos. Una característica única de esta técnica, es que permite el trazado de linajes y el análisis genético funcional de genes candidatos en el nivel de una sola célula.demontrating to procedure será, Carmen Streicher, su técnico, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc y Andy Hansen, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para inducir eventos de recombinación MADM en ratones experimentales, utilice una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 25 para administrar una sola inyección de tamoxifeno intraperitoneal en una presa de tiempo para embarazada. Desde el análisis clonal de MADM hasta los puntos de tiempo posnatales. En los días embrionarios 18 a 19, coloque un ratón embarazada en posición supina y desinfecte el pelaje con 70% de etanol. Haga una pequeña incisión en la piel en la parte inferior del abdomen por encima del útero y haga una segunda incisión a través de los músculos y la pared muscular abdominal para revelar el peritoneo. Use tijeras para separar el útero de los tejidos circundantes y coloque el útero intacto en un guante con agua tibia. A continuación, utilice tijeras y dedos de punta fina para abrir cuidadosamente las paredes uterinas para liberar los embriones. Limpie los cachorros presionando suavemente los pechos de vez en cuando para iniciar la respiración antes de transferir los animales prenatales a una madre adoptiva. Para recoger el tejido clon neuronal MADM coloque un animal anestesiado en la posición supina en una bandeja de cirugía de perfusión y desinfecte el pelaje con 70%etanol. Usa tijeras y fórceps para hacer una incisión a través de la piel y una incisión a través de la capa muscular. Cuando la cavidad torácica es visible, olfatee y levante el diafragma para revelar el corazón y recorte y fije cuidadosamente la caja torácica a la bandeja quirúrgica.inserte una aguja conectada a un tubo de bomba peristáltica lleno de PBS en el ventrículo izquierdo inferior del corazón y use pequeñas tijeras Iris para hacer una incisión en el extremo posterior de la aurícula derecha. Perca el sistema cardiovascular con el PBS seguido inmediatamente por perfusión con hielo frío recién preparado 4%paraformaldehído en PBS. Cuando la perfusión esté completa, retire el cerebro a través de una disección cuidadosa y coloque el órgano cosechado en al menos cinco veces el volumen cerebral de 4%paraformaldehído fresco durante la noche a las 4
Visión general
Este estudio presenta un protocolo para el rastreo de linaje y el análisis genético funcional de genes candidatos a nivel de célula única utilizando el Análisis Mosaico con Marcadores Dobles (MADM). El análisis clonal MADM permite la medición cuantitativa del comportamiento proliferativo y la producción celular de progenitores individuales y sus células descendientes.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Rastreo de linaje
- Análisis genético
- Biología de células madre
Antecedentes
- La tecnología MADM es instrumental para comprender la proliferación celular.
- El método permite el rastreo a nivel de célula única.
- Las aplicaciones incluyen la evaluación de producciones celulares y relaciones de linaje.
Métodos utilizados
- Análisis Mosaico con Marcadores Dobles (MADM)
- Modelo experimental: Ratones
- Las técnicas incluyen inyecciones intraperitoneales y perfusión de tejidos.
Principales resultados
- Permitió un examen detallado del comportamiento de los progenitores.
- Proporcionó información sobre las relaciones de linaje de las células hijas.
- Demostró un método confiable para el análisis genético funcional.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un protocolo integral para utilizar MADM en el análisis genético.
- Los hallazgos contribuyen significativamente al campo de la biología del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) enables unprecedented single-cell resolution lineage tracing and clonal analysis in the developing cerebral cortex, directly addressing the challenge of mapping neural stem cell fate and division patterns. This capability enhances predictive confidence in early neurodevelopmental target validation and supports mechanistic de-risking for CNS portfolio decisions. MADM's quantitative and qualitative outputs position it as a critical tool for functional genetic interrogation in neurobiology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of neural stem cell lineage transitions and division modes.
- Supports functional validation of candidate genes in neurodevelopmental pathways.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing control and mutant subclones in vivo.
- Facilitates high-confidence target selection for CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell lineage maps for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of progenitor proliferation and fate specification.
- Supports assay standardization by enabling comparative analysis within the same tissue environment.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neurodevelopmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lineage tracing outputs with disease-relevant neural circuit formation.
- Enables continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets based on in vivo functional evidence.
- Provides translational biomarker insights through clonal analysis of neural progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
MADM-based lineage tracing integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS-focused pipelines.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution hypothesis testing of neural stem cell fate and division patterns.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible lineage data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides optical and statistical outputs for comparing control and mutant progenitor behaviors.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping lineage outcomes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any murine stem cell niche with appropriate CreERT2 drivers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural lineage studies.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and clonal analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation, in vivo lineage tracing, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to murine models with CreERT2 drivers and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible clonal analysis and data interpretation.
- Adaptable to various stem cell niches with appropriate genetic drivers and tissue handling protocols.
- Limited to murine systems where genetic tools and tissue access are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
