Un sistema gnotobiótico para el estudio del ensamblaje del microbioma en la filosfera y en la fermentación vegetal

Usando este protocolo, podemos abordar preguntas clave con respecto a cómo los microbios se ensamblan e interactúan en la filosfera. Tiene el beneficio añadido de que mediante el uso del extracto vegetal estéril, podemos vincular la estructura de las comunidades de la esfera filo a su función durante la fermentación vegetal. Estas técnicas permiten a los científicos probar cómo interactúan los microbios en la esfera del filo y luego rastrear cómo estas comunidades de esferas filosas pueden afectar la fermentación.

Para esterilizar la superficie las semillas de repollo, comience colocando 100 semillas en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Añadir un mililitro de 70% de etanol al tubo y vórtice durante cinco minutos. A continuación, utilice una pipeta para desechar el etanol.

Añadir un mililitro de 50% de lejía y vórtice el tubo durante cinco minutos, luego desechar la lejía. Enjuague las semillas cuatro veces, añadiendo un mililitro de agua desionizada autoclavizada que vórtice el tubo, luego desechando el agua. Después del último enjuague, remoje las semillas en agua desionizada esterilizada durante dos a ocho horas para suavizar la capa de semillas antes de plantar.

Pesar 10 gramos de arcilla de calcio limpia en un tubo de vidrio de 15 por 2,5 centímetros. Agregue aproximadamente nueve mililitros de caldo de MS preparado a cada tubo para cubrir la arcilla cálcrica. Tapar con holgura los tubos de vidrio con tapas de tubo de ensayo de 22 milímetros de dos vías.

Autoclave los tubos a 121 grados centígrados durante 60 minutos. Al retirar los tubos del autoclave, empuje las tapas sobre los tubos de vidrio para sellarlos y, a continuación, enfríe los tubos a temperatura ambiente antes de usarlos. Cuando los tubos se han enfriado, utilice fórceps extra largos para colocar suavemente una semilla de repollo estéril en el centro de cada tubo.

Encaje los tubos en una bandeja de siete vías y coloque la bandeja debajo de los bastidores de luz con un ciclo de luz de 16 horas a 24 grados centígrados. Las semillas desarrollarán su primera hoja verdadera después de cinco días, que es la primera hoja vascular después de que se hayan formado los cotiledones. Tiene un borde arrugado y está cubierto de tricombs.

Para probar la esterilidad del repollo libre de gérmenes, agarre suavemente la base de la planta con fórceps esterilizados y extráigalo. Antes de retirar completamente el repollo del tubo, corte cuidadosamente las raíces con tijeras de disección esterilizadas. A continuación, compactar las hojas de repollo en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros.

Añadir 400 microlitros de PBS a cada tubo de micro centrífuga y utilizar un micro pestle estéril para homogeneizar el repollo. Cuchilla 100 microlitros de la col homogeneizan sobre placas de agar, asegurándose de utilizar una punta de pipeta de orificio ancho. Para hacer reservas de glicerol de cepas inoculantes, raya suavemente las colonias individuales en dos o tres placas nuevas del mismo medio.

Remar las colonias durante dos a cinco días, luego rasparlas de las placas en un tubo cónico de 15 mililitros con 15 mililitros de 15% de glicerol. Vórtice el tubo a fondo para mezclar. Aliquot un mililitro del glicerol mezclado en un tubo de micro centrífuga y almacenarlo 80 grados Celsius hasta que esté listo para usar junto con los 14 mililitros restantes de stock de glicerol.

Una semana antes de su uso, descongelar la alícuota de un mililitro sobre hielo y colóquela en varias diluciones diferentes para determinar la concentración del stock de inoculación. Cuando esté listo para inocular el repollo, descongele el caldo de glicerol sobre hielo y diluya hasta la concentración deseada. Agregue 10 mililitros del stock diluido a la botella de la bomba estéril y bombee cinco pulverizaciones en un vaso de precipitados de recolección de residuos grande.

Retire la tapa del tubo de repollo e incline el repollo hacia la botella de pulverización. Rocíe cada repollo con tres bombas de la solución de inoculación y, a continuación, cosecha un subconjunto de las coles para evaluar la concentración real de inoculación de entrada. Para cosechar el repollo, retírelo del tubo con fórceps esterilizados.

Corte las raíces con tijeras de disección estériles y colóquela cuidadosamente en un tubo de micro centrífuga estéril prepesado. Registre el peso del repollo para futuros cálculos. Añadir 400 microlitros de PBS a cada tubo con el repollo y molerlo 30 veces con un micro peste, a continuación, placar el repollo homogeneizar utilizando puntas de pipeta de orificio ancho.

Retire y deseche las hojas más externas del repollo y corte todo el repollo restante para caber en una licuadora. Licúe con una pulpa fina y pese la homogeneidad del repollo. Añadir dos mililitros de agua destilada por gramo de repollo.

A continuación, filtre la suspensión de repollo a través de dos capas de filtros de café de cesta. Dispensar la suspensión en tubos centrífugos y centrifugarlo a 20.000 veces G durante 20 minutos o hasta que las partículas grandes se asienten fuera de la solución. Retire el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar a los restos de repollo peletados.

Para recrear las condiciones de fermentación con concentraciones de sal estándar, añada un 2% de peso al volumen de cloruro de sodio al extracto. Bilder el extracto vegetal con un filtro de 0,2 micrómetros unido a un vacío, dispensarlo en tubos estériles y congelarlo a menos 80 grados Centígrados. El método de esterilización de semillas fue probado con varias coles Napa y todos demostraron tasas de crecimiento similares.

Sin embargo, otras especies de brassica dieron un éxito limitado porque las plantas tenían bajas tasas de germinación después de la esterilización o el tallo se alarga rápidamente para hacer una planta espinosamente insalubre. Los aislados microbianos se inocularon como aislados de una sola cepa o en combinación con otro aislado. Se analizaron un total de 15 coles libres de gérmenes para cada tratamiento y se cosecharon inmediatamente, a los cuatro días o a los 10 días después de la inoculación.

Los aislados demostraron un rápido crecimiento en la repollo napa Phyllosphere. Dos levaduras y tres bacterias fueron inoculadas en tres tipos diferentes de extracto vegetal estéril o SVE hecho de repollo rojo, verde y napa. El crecimiento de las inoculadas se registró durante 14 días mediante el enchapado puntual de cinco microlitros de cada tratamiento en placas de agar MRS o YPD.

Las mediciones del pH a lo largo de la fermentación mostraron que las bacterias del ácido láctico eran capaces de acidificar el SVE a niveles por debajo del pH cuatro, lo que indica un fermento que es seguro para el consumo. Estos métodos se han aplicado específicamente al microbioma de repollo, pero podrían ser útiles en otros sistemas vegetales. Puede ser difícil mantener el sistema estéril, nuestros protocolos de esquema son detallados, pero encontramos que cada paso es importante.