Fabricación de guías de onda de modo cero para microscopía de molécula única de alta concentración
May 12th, 2020
Aquí se describe un método de litografía de la nanoesfera para la fabricación paralela de guías de onda de modo cero, que son matrices de nanoaperturas en un cubrebocas de microscopía de vidrio revestido de metal para imágenes de una sola molécula en concentraciones nano a micromolar de fluoróforos. El método aprovecha el autoensamblaje de cristal coloidal para crear una plantilla de guía de onda.
El protocolo de litografía de nanoesferas presentado aquí para fabricar guías de onda de modo cero es un método accesible y de bajo costo que no requiere herramientas o instalaciones de fabricación especializadas. Este método será útil para la biofísica de moléculas individuales y permitirá a más investigadores realizar experimentos de moléculas individuales en concentraciones biológicamente relevantes de reactivos fluorescentes. Para crear una superficie limpia para la deposición evaporativa de partículas coloidales, coloque cubreobjetos de vidrio de borosilicato óptico en los insertos ranurados de un frasco de vidrio Coplin.
Llene el frasco de tinción con suficiente acetona para cubrir los cubreobjetos y cubra el frasco. Sonicar el frasco durante 10 minutos a 40 grados centígrados. Vierta la acetona y enjuague los cubreobjetos tres veces con agua destilada.
Después de repetir la sonicación y la acetona, llene el frasco con suficiente hidróxido de potasio para cubrir los cubreobjetos. Sonicar el frasco nuevamente, tapado, durante 20 minutos a 40 grados centígrados. Enjuague los cubreobjetos con agua destilada seis veces, luego soniquelos en etanol durante 10 minutos a 40 grados centígrados.
Después de lavar los cubreobjetos tres veces con agua destilada, recoja suavemente cada cubreobjetos por el borde con pinzas. Seque cada cubreobjetos con gas nitrógeno y coloque cada cubreobjetos limpio y seco y su propia placa de Petri. Centrífuga de 50 microlitros de perlas de poliestireno no funcionalizado de una micra.
Deseche el sobrenadante, dejando la menor cantidad de agua posible. Vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de disolvente, luego mezcle bien mediante pipeteo. Para configurar una cámara de humedad para la deposición, coloque seis placas de Petri en fila.
Coloque un cubreobjetos en cada placa de Petri y deje las tapas ligeramente entreabiertas con los cubreobjetos colocados para exponerlos al medio ambiente. Centre un higrómetro y un pequeño ventilador eléctrico detrás de las placas de Petri, luego registre la humedad relativa en el laboratorio. Llene un vaso de precipitados de 200 mililitros con 150 a 200 mililitros de agua a aproximadamente 75 grados centígrados y coloque el vaso detrás del ventilador.
Encienda el ventilador y luego cubra las placas de Petri, el ventilador, el vaso de precipitados y el higrómetro con un recipiente de almacenamiento de plástico transparente volcado. Cuando la humedad relativa alcance el 70 al 75%, levante ligeramente el recipiente de almacenamiento de plástico y cierre rápidamente las tapas de las placas de Petri para evitar que los cubreobjetos se humedezcan demasiado. Cuando la humedad relativa en la cámara alcance el 85%, pipetee cinco microlitros de la suspensión de cuentas en el centro de cada cubreobjetos.
Cubra cada placa de Petri inmediatamente después de la deposición y mantenga todo cubierto en el recipiente de almacenamiento entre deposiciones. Las deposiciones de cordones deben completarse lo más rápido posible para minimizar la pérdida de humedad. Si las deposiciones son demasiado secas o húmedas, la humedad de la cámara es la variable más importante a optimizar.
Cuando se completen las seis deposiciones, registre la humedad relativa en la cámara y deje que las gotas de perlas se esparzan y sequen durante cinco minutos. Para proporcionar una superficie de temperatura uniforme para el recocido de las perlas de poliestireno, coloque una placa de aluminio plana y fresada encima de una placa calefactora de cerámica estándar y ajuste la temperatura de la placa calefactora a 107 grados Celsius, la temperatura de transición vítrea del poliestireno. Coloque un cubreobjetos que contenga la plantilla de cuentas en la placa de aluminio caliente.
Después de recocerlo durante 20 segundos, retire el cubreobjetos de la placa de aluminio y colóquelo rápidamente sobre una superficie de aluminio a temperatura ambiente para que se enfríe. Usando deposición evaporativa térmica, deposite 300 nanómetros de cobre a dos angstroms por segundo sobre cubreobjetos que contienen las plantillas de cuentas. Esto generará publicaciones en los intersticios entre las cuentas.
Para eliminar el exceso de cobre de las cuentas, presione suavemente un trozo de cinta adhesiva sobre la superficie y luego retire lentamente la cinta. Disuelva las perlas de poliestireno colocando los cubreobjetos en toleune y dejándolos toda la noche. Manipulando las fundas con cuidado, enjuáguelas una vez con cloroformo y dos veces con etanol.
Secar las plantillas con nitrógeno. Colóquelos en un limpiador de plasma de oxígeno durante 30 minutos para eliminar el polímero residual y los contaminantes. Usando deposición evaporativa térmica, deposite tres nanómetros de una capa de adhesión de titanio a un angstrom por segundo, luego deposite de 100 a 150 nanómetros de aluminio a cuatro angstroms por segundo alrededor y encima de los postes de cobre.
Asegúrese de que las muestras no estén girando durante la deposición, como se hace automáticamente en algunas unidades de deposición. Para disolver los postes de cobre, remoje los cubreobjetos en grabador de cobre durante dos horas. Después de enjuagar los cubreobjetos con agua destilada, séquelos con nitrógeno y luego pula suavemente la superficie con papel para lentes para exponer los postes que aún estén cubiertos de revestimiento.
Remoje los cubreobjetos en grabador de cobre durante otras dos horas, luego enjuáguelos nuevamente con agua destilada y séquelos con nitrógeno. Después de la pasivación de la superficie, los cubreobjetos de guía de onda de modo cero se pueden emparejar con portaobjetos de cuarzo utilizando cinta adhesiva de doble cara para hacer cámaras de flujo microfluídicas para imágenes de moléculas individuales. El éxito del autoensamblaje de la plantilla coloidal depende fundamentalmente de la humedad relativa.
En una plantilla bien formada, la región de las cuentas es circular con bordes definidos por un anillo opaco de varias capas. En las plantillas bien formadas, la mayoría de las plantillas deben contener cuentas hexagonalmente compactas. Habrá algunos defectos entre los granos debido al atasco durante la sedimentación evaporativa.
Después de la deposición de cobre y la disolución de las perlas de poliestireno, los postes de cobre deben tener menos de 150 nanómetros de diámetro. Para una profundidad de deposición de cobre de 300 nanómetros, los postes tienen alrededor de 250 nanómetros de altura. Después de la deposición del revestimiento de aluminio y la posterior disolución de los postes de cobre, las guías de onda deben ser visibles mediante microscopía de fuerza atómica y estar espaciadas a unos 550 nanómetros de distancia.
Al recocer las plantillas de poliestireno durante 20 segundos, se produjeron guías de onda de aluminio con un diámetro de 118 nanómetros, lo suficientemente pequeñas como para cortar la propagación de la luz visible. Un campo típico de ZMW para la obtención de imágenes contiene 3.000 guías de onda en un campo de visión de 40 por 80 micras. Se realizó FRET de una sola molécula para probar la funcionalidad de ZMW.
Las trazas de FRET de una sola molécula fueron detectables en todas las concentraciones de fluorforo Cy5 ambiental analizadas. En comparación, las moléculas individuales solo serían detectables en la iluminación TERF con concentraciones picomolares a nanomolares bajas. Después de la fabricación de la guía de onda en modo cero, los dispositivos se pueden pasivar con polímeros para reducir las interacciones no específicas durante la obtención de imágenes de una sola molécula.
Los fondos de vidrio de las guías de onda de modo cero también se pueden grabar ligeramente para mejorar la emisión de una sola molécula. En general, este nuevo método de fabricación de guías de onda en modo cero permitirá a los investigadores investigar más fácilmente los procesos bioquímicos dinámicos, como la transcripción o la traducción, a concentraciones y tasas más cercanas a las de la célula.
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Descripción general
Este artículo describe un método de litografía de nanosferas para la fabricación paralela de guías de onda de modo cero, que permite la obtención de imágenes de moléculas individuales a bajas concentraciones de fluoróforos. El método utiliza el autoensamblaje de cristales coloidales para crear una plantilla de guía de onda sobre un portaobjetos de vidrio.
Componentes clave del estudio
Área de la Ciencia
- Biofísica
- Nanotecnología
- Obtención de imágenes de moléculas individuales
Antecedentes
- Las guías de onda de modo cero son esenciales para estudiar moléculas individuales.
- Los métodos de fabricación tradicionales pueden ser costosos y requieren herramientas especializadas.
- Este método tiene como objetivo simplificar el proceso.
- El autoensamblaje coloidal es una técnica prometedora para crear nanoestructuras.
Propósito del estudio
- Presentar un método accesible para la fabricación de guías de onda de modo cero.
- Permitir que más investigadores realicen experimentos de moléculas individuales.
- Facilitar estudios a concentraciones biológicamente relevantes de reactivos fluorescentes.
Métodos utilizados
- Uso de portaobjetos de vidrio borosilicato óptico.
- Sonicación en acetona para la limpieza de la superficie.
- Deposición evaporativa de partículas coloidales.
- Creación de una plantilla de guía de onda para la obtención de imágenes.
Resultados principales
- El método es de bajo costo y no requiere herramientas especializadas.
- Produce guías de onda efectivas para la obtención de imágenes de moléculas individuales.
- Los investigadores pueden lograr la obtención de imágenes a concentraciones de nano a micromolares.
- El protocolo es sencillo y reproducible.
Conclusiones
- Este método de litografía de nanosferas democratiza el acceso a las técnicas de obtención de imágenes de moléculas individuales.
- Abre nuevas vías para la investigación en biofísica de moléculas individuales.
- Los estudios futuros pueden aprovechar este método para diversas aplicaciones en biología.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables single molecule imaging at micromolar fluorophore concentrations, overcoming a key limitation in biochemical assays where background fluorescence restricts usable concentrations to pico- to nanomolar ranges. By facilitating the study of molecular processes at cellular-relevant concentrations and rates, it supports more physiologically relevant target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The accessibility of this low-cost fabrication approach expands the utility of zero mode waveguides beyond specialized core facilities to broader biopharma R&D laboratories.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses and pathway clarification by allowing single molecule observation at concentrations that reflect physiological ligand levels.
- Operational Value: Reduces reliance on expensive nanofabrication equipment, making single molecule enzymology accessible to more discovery teams.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking through direct visualization of single molecule interactions under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a platform for preparing validated biological systems that enable reliable compound evaluation at higher, more relevant fluorophore concentrations.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through parallel fabrication of thousands of zero mode waveguides using common lab equipment.
- Scalability: Supports platform reuse and scalability for downstream screening workflows by generating uniform waveguide arrays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates the study of dynamic biochemical processes such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell, improving relevance to disease models.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of single molecule FRET signals at micromolar concentrations, which are unattainable with traditional total internal reflection fluorescence (TERF) illumination.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, single molecule readouts that clarify mechanism and reduce ambiguity in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification, enabling biophysical characterization that informs compound selection and optimization prior to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by allowing direct observation of single molecule behavior in complex environments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible nanostructures with quantitative outputs that enable comparison of ligand binding or enzymatic activity across conditions.
- Analytics: Provides single molecule fluorescence and FRET readouts that offer high-resolution kinetic and mechanistic insights beyond ensemble averages.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling studies at near-physiological concentrations and molecular crowding conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fabrication capability that can be shared across departments, reducing dependency on external nanofabrication services.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct single molecule visualization.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput via parallel fabrication using accessible equipment like thermal evaporators and hot plates.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency and enables better go/no-go decisions by generating reliable biophysical data earlier in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic clarity that reduces late-stage attrition due to unexpected biological behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in colloidal self-assembly, thermal evaporation, and surface cleaning protocols.
- Depends on access to a thermal evaporator, hot plate, sonicator, and basic chemistry lab equipment for metal deposition and etching.
- Necessitates standardization of humidity-controlled bead deposition to ensure consistent waveguide template formation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different substrate materials or waveguide metals (e.g., aluminum vs. gold).
- Includes practical limitations such as sensitivity to relative humidity during bead self-assembly and the need for careful handling to avoid template defects.
