Name: Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende a usar un separador acústico para clarificar cultivos de células CHO en bioprocesos continuos. Este método ofrece menor riesgo de contaminación y eficiencia superior a técnicas tradicionales como centrifugación.

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Los autores desean agradecer a Nilou Sarah Arden y Zhong Zhao por su revisión constructiva de este manuscrito. Los autores también desean agradecer a Lindsey Brown por sus aportes esenciales durante este proyecto. El financiamiento interno parcial y el apoyo para este trabajo fueron proporcionados por el Programa de Ruta Crítica de CDER (CA # 1-13) y el Programa de Excelencia del Centro de Innovación y Ciencia de Fabricación de CDER (Berilla-CoE-19-49). Este proyecto fue apoyado en parte por el Programa de Pasantías / Participación en Investigación en la Oficina de Productos Biotecnológicos, Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación a través de un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la FDA.
Esta publicación refleja los puntos de vista del autor y no debe interpretarse como una representación de los puntos de vista o políticas de la FDA.

1. Preparación de AWS
NOTA: Este protocolo fue desarrollado utilizando una cámara acustoforética. Sin embargo, el AWS a escala de banco tiene cinco sondas de turbidez que pueden operar 4 cámaras acustoforéticas en serie si es necesario.
<ol><li>Conecte los cables de turbidez en sus respectivos puertos etiquetados como F, 1, 2, 3, 4 (por ejemplo, la sonda de turbidez 1 en la Figura 1c y el puerto 1 en la Figura 2a)y los cables BNC de alimentación de la cámara a la parte posterior del sistema AWS etiquetados como 1, 2, 3, 4(Figura 2b). NOTA: No conecte el otro extremo del cable BNC de alimentación de la cámara (Figura 3c) a la parte posterior de la cámara acustoforética (Figura 3d) hasta el paso 2.6 cuando la cámara esté llena de líquido. Si la alimentación de la cámara se enciende sin líquido en la cámara, dañará el transductor piezoeléctrico de la cámara y dejará de funcionar.</li>
	<li>Inserte las sondas de turbidez en el medidor de turbidez y la carcasa del termómetro y apriete los tornillos(Figura 1c y Figura 3).</li>
	<li>Conecte el tubo de alimentación a la entrada del puerto de turbidez de alimentación (Figura 4a) a través de la bomba de alimentación (Figura 1b a 1c).</li>
	<li>Conecte el tubo en Y desde la salida del puerto de turbidez de alimentación(Figura 4b)a los puertos de entrada de la cámara acustoforética(Figura 4c).</li>
	<li>Conecte el tubo de la etapa 1 desde el puerto de desechos de la cámara acustoforética (Figura 4d) a través de la bomba de la etapa 1 a un recipiente de recolección de celdas (Figura 1d a través de 1e a 1f).</li>
	<li>Conecte el tubo desde el puerto de permeado de la cámara acustoforética (Figura 4e) a la entrada del puerto de turbidez de la sonda1 (Figura 4f).</li>
	<li>Conecte el tubo de cosecha desde fuera del puerto de turbidez de la sonda1 (Figura 4g) a un recipiente de recolección de productos (Figura 1c a 1g).</li>
</ol>2. Prepara el sistema con HCCF
NOTA: Este protocolo se desarrolló utilizando células CHO-K1 cultivadas en un medio definido químicamente (ActiCHO P con 6 mM L-glutamina) produciendo el modelo de anticuerpo monoclonal IgG1 VRC0113 y puede necesitar ser ajustado para otras líneas celulares y productos. El HCCF utilizado en este protocolo se obtuvo al final de 7-8 días de cultivos CHO-K1 a partir de un matraz agitador o un proceso de biorreactor.
<ol><li>Encienda el AWS activando los interruptores de encendido en la parte posterior y delantera del AWS.</li>
	<li>Encienda la computadora y haga doble clic en el icono del escritorio para el software asociado (consulte tabla de materiales). Desde el panel "Lecturas", pulse el botón "Iniciar prueba" para iniciar la grabación de datos(Figura 5). Una vez que se inicia el registro de datos, todos los datos recopilados se registrarán en una hoja de cálculo exportable hasta que se detenga la prueba.</li>
	<li>Conecte el extremo del tubo de alimentación en el recipiente HCCF que se está agitando.</li>
	<li>Inicie la bomba de alimentación introduciendo la velocidad de la bomba en la pantalla "Controles" dentro de la " Imagen de labomba de alimentación" y pulse "Intro" en el teclado. Asegúrese de que el "Icono de flecha de direcciónde la bomba " (en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj) esté correctamente seleccionado en el cuadro gris a la derecha de la imagen de la bomba de alimentación para bombear HCCF desde el recipiente a la cámara acustoforética. Haga clic en el "Icono detriángulo " junto a las palabras "Encender" dentro del cuadro gris debajo de la imagen de la bomba de alimentación para "Iniciar" la bomba (Figura 6a). NOTA: La velocidad máxima de la bomba es de 10 L/h (167 mL/min), pero se recomienda que el caudal nominal, 60 mL/min, se utilice para este paso para llenar rápidamente la tubería y la cámara sin correr el riesgo de llenar en exceso la cámara antes de comenzar la separación.</li>
	<li>Monitoree las mediciones de turbidez de alimentación observando el "Panel de Reducción porcentual" ( Figura5c) durante el llenado de la cámara acustoforética. Los valores de turbidez se mantendrán constantes durante la carga de la cámara si el HCCF se mezcla lo suficiente en el recipiente HCCF.</li>
	<li>Una vez que el líquido esté por encima del transductor piezoeléctrico en la parte posterior de la cámara acustoforética, presione "Apagar" dentro de la caja gris debajo de la imagen de la bomba de alimentación para detener la bomba. Conecte el cable de alimentación BNC (Figura 3c) a la cámara acustoforética (Figura 3d). NOTA: El volumen de retención de cada cámara acustoforética es de alrededor de 190 ml.</li>
</ol>3. Funcionamiento de AWS
<ol><li>Una vez que la cámara acustoforética esté llena y el cable de alimentación BNC esté conectado a la parte posterior de la cámara acustoforética, cambie la velocidad de la bomba de alimentación a la velocidad de funcionamiento deseada(Figura 6a y Tabla 1). Se deben probar varias velocidades de bomba de alimentación para identificar los parámetros de funcionamiento ideales para un proceso determinado.</li>
	<li>Encienda la potencia piezoeléctrica del escenario1 deslizando la barra del módulo de alimentación a 10 W(Figura 6d)y presionando el icono "Encender "en el lado derecho del cuadro del Escenario 1(Figura 6c). Según lo sugerido por el fabricante, use 10 W, la configuración de potencia recomendada para las celdas CHO. Esto generará una frecuencia fija de 2 MHz para su operación. Después de varios segundos, las células comenzarán a agruparse visiblemente en los nodos de onda en la cámara acustoforética(Figura 7a).</li>
	<li>Una vez que las células comienzan a asentarse en el fondo de la cámara acustoforética(Figura 7b),inicie la bomba de etapa 1 con una velocidad adecuada basada en la densidad de la celda y la velocidad de la bomba de alimentación(Figura 6b). Sobre la base de la hoja de cálculo de optimización y operación de estado estacionario del fabricante, la velocidad de la bomba de la etapa 1 se puede calcular en función de la masa de la celda empaquetada y la tasa de flujo de alimentación utilizando la siguiente ecuación <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>Para calcular la masa celular empaquetada, tara una escala con un tubo vacío de 15 ml (u otro tubo compatible con centrifugación). Llene el tubo con material de alimentación y registre el peso total del tubo con alimentación. Centrifugar el tubo durante 10 min a 3.700 x g. Decanta el sobrenadante en un recipiente separado. Mida el peso del tubo con el pellet celular. El porcentaje de masa celular empaquetada de la materia prima de alimentación = (peso del tubo decantado/peso del tubo lleno) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monitorizar el perfil de turbidez de la turbidez en estadio1 a medida que el desbordamiento de la cámara acustoforética entra en la sonda de turbidez1 (Figura 8).</li>
	<li>A medida que la separación celular continúe, la eficiencia de la eliminación celular <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> aumentará.</li>
	<li>Además, controle la diferencia de temperatura entre la alimentación y la etapa1, ya que aumentará a medida que continúe la separación celular(Figura 9). La temperatura puede aumentar cuando se utiliza una alimentación de mayor densidad celular, pero generalmente se puede reducir alterando la tasa de flujo de alimentación. NOTA: Cuando se utilizan múltiples cámaras acustoforéticas, se puede conectar secuencialmente el tubo de la cámara acustoforética anterior a través de sondas de turbidez a la entrada de la cámara acustoforética actual. Además, se puede conectar el tubo de etapa desde el fondo de las cámaras acustoforéticas a través de bombas de etapa a los recipientes de recolección de células. Un total de cuatro cámaras acustoforéticas se pueden conectar en serie para una eficiencia óptima de eliminación celular si es necesario.</li>
</ol>4. Finalización de AWS
<ol><li>Cuando termine la carrera, detenga la alimentación y la bomba de la etapa 1 presionando Apagar dentro de la caja gris debajo de la bomba de alimentación y las imágenes de la bomba de la etapa 1, respectivamente, para detener las bombas.</li>
	<li>Apague la alimentación de la cámara presionando Apagar en el lado derecho de la caja de la Etapa 1 y desconecte el cable de alimentación BNC.</li>
	<li>Tome el material de cosecha del producto recolectado para procedimientos de clarificación y purificación adicionales, como métodos de filtración en profundidad y cromatografía. Deseche el material de cosecha celular.</li>
	<li>Drene el líquido restante en la cámara acustoforética colocando el tubo de desechos en un recipiente vacío, desconectando el tubo de la entrada de la cámara acustoforética y los puertos de permeo y liberando el tubo de desecho del cabezal de la bomba.</li>
	<li>Vuelva a conectar el tubo, vuelva a colocar el tubo de desecho en el cabezal de la bomba y fluya a través del agua DI desde el extremo del tubo de alimentación utilizando una velocidad de bomba de alimentación de 60 ml / min y una velocidad de bomba de etapa 1 de 60 ml / min. Continúe durante 15-20 minutos. Descarta el flujo a través.</li>
	<li>Bombee alcohol isopropílico (IPA) al 70% a través del tubo y la cámara utilizando la bomba de alimentación durante 15-20 min. Descarta el flujo a través.</li>
	<li>Repita el procedimiento de limpieza con agua DI para limpiar los tubos y la cámara utilizando la bomba de alimentación durante 15-20 min. Descarta el flujo a través.</li>
	<li>Desmonte el tubo de las sondas de turbidez y cámaras acustoforéticas y limpie el área con 70% de IPA.</li>
	<li>Desmonta las sondas de turbidez y limpia el interior de las sondas de turbidez con un 70% de IPA. Deje que todas las piezas se sequen al aire y luego vuelva a ensamblarlas para el siguiente uso. NOTA: Las cámaras acustoforéticas se fabrican para un solo uso, pero se pueden reutilizar si se manipulan y limpian adecuadamente como se describe en este protocolo.</li>
</ol>

<ol><li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+primary+recovery%3A+centrifugation+and+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li>
<li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li>
<li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShukla%2C+AA+%22Harvest+and+recovery+of+monoclonal+antibodies%3A+cell+removal+and+clarification.+Second+ed%22">Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed</a>. 2, Wiley. 55-79 (2017).</li>
<li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li>
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<li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention%3A+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li>
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<li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors%5BTitle%5D)+AND+%22169th+Meeting+of+the+Acoustical+Society+in+America%22%5BJournal%5D)">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li>
<li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237(2013).</li>
<li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Device%22%5BJournal%5D)">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li>
<li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , 9738866 (2017).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li>
<li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+cell+filter%3A+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li>
<li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722(2019).</li>
<li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li>
<li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en los productos descritos en este manuscrito y no tienen nada más que revelar.

Se describe un protocolo paso a paso para la implementación de un AWS a escala de banco en la clarificación primaria de un modelo de anticuerpo monoclonal de HCCF de una línea celular CHO. Como se muestra en los resultados representativos, el uso de AWS en la clarificación primaria dio como resultado una aclaración de celdas y una recuperación del producto efectivas. Además, el bajo nivel de mantenimiento y los requisitos operativos y la capacidad de ampliación permiten un mayor potencial de aplicación en la aclaración primaria.
Es importante destacar que los resultados representativos sugieren que la velocidad de la bomba de alimentación es crítica para la separación de las células. Además, debido a las limitaciones en la detección de alta densidad celular en la medición de la turbidez, la densidad de la célula de trabajo es otro factor a considerar al utilizar un sistema AWS. Debido a que la sonda de turbidez estará saturada cuando se ejecute material de alimentación de alta densidad celular, puede ser mejor calcular la eficiencia de separación celular midiendo las densidades celulares del material de alimentación y el fluido de cultivo celular clarificado fuera de línea. Con una medición precisa de la clarificación fuera de línea, una estrategia de proceso que se puede considerar para resolver estos problemas es usar múltiples cámaras en serie. Aunque este protocolo se centra principalmente en el uso de una sola cámara, este sistema puede operar tres cámaras adicionales para la clarificación secuencial de las células que pueden afectar mínimamente la condición de las células y dar como resultado una alta recuperación del producto. Además, otros parámetros, como la potencia para AWS y los caudales de eliminación de celdas, se pueden optimizar aún más para tipos de celdas o modos de operación específicos. En general, se recomienda una optimización de los parámetros de operación y la estrategia utilizando estas consideraciones antes de la implementación de AWS.
Entre muchos potenciales de aplicación, el uso de AWS en el bioprocesamiento continuo es prometedor. Debido a que AWS puede reemplazar la centrifugación y reducir drásticamente el área de superficie del filtro14,el uso de AWS permitiría un flujo constante de material libre de células para los procesos posteriores de filtración y cromatografía que son compatibles con la biofabricación continua. Debido a esta compatibilidad y a la disponibilidad de la tecnología de perfusión para una alta densidad celular (por ejemplo, >50 x 106 células/ml) y una mayor duración del cultivo (por ejemplo, >14 días), AWS tiene el potencial de desarrollar una nueva estrategia de sangrado celular continuo además de la clarificación primaria.
En algunos casos, hasta el 30% de la proteína terapéutica producida se elimina durante la operación en estado estacionario en el material de sangrado celular15,16. Además, para que los anticuerpos monoclonales eliminados se agrupen con el material cosechado estándar, se deben cumplir ciertos atributos de calidad. Cuando no se cumplen estas especificaciones, el resultado puede ser un rechazo del material que puede afectar el rendimiento del producto. Para compensar dicha pérdida de producto, se puede implementar una clarificación continua del material de sangrado celular utilizando AWS en una condición de estado estacionario durante un proceso de perfusión a largo plazo17. Esta estrategia puede reducir la pérdida de producto en el material de sangrado y utilizar más de la proteína producida. Además, las celdas después de la clarificación continua mediante AWS podrían volver a agregarse al biorreactor si se desea para una mayor densidad celular y productividad. Por lo tanto, la clarificación continua del material de purga celular con AWS puede ofrecer una oportunidad para aumentar el rendimiento y/o disminuir el área de superficie del filtro secundario en un proceso determinado.
En resumen, la utilidad de AWS no se limita a una simple aclaración primaria, sino que puede tener utilidad para aplicaciones en bioprocesamiento continuo que puede mejorar la tasa de fabricación y la flexibilidad operativa.

Un paso crítico en un proceso de biofabricación que involucra proteínas terapéuticas secretadas es la eliminación de biomasa del fluido de cultivo celular cosechado (HCCF). Tradicionalmente, los biofabricantes han adoptado la centrifugación seguida de la filtración en profundidad como sus principales métodos de clarificación en la producción de anticuerpos monoclonales1. Sin embargo, la centrifugación puede conducir a un alto estrés cortante en las células, lo que resulta en un aumento de los desechos celulares en el HCCF. Esto puede conducir potencialmente a ensuciamiento del filtro durante la filtración y dar lugar a contaminantes adicionales después de la filtración que posteriormente pueden reducir la eficiencia de la cromatografía aguasabajo 1,2,3. Además, la personalización de las centrifugadoras para un determinado proceso puede ser costosa y puede requerir conexiones adicionales a sistemas de limpieza in situ y esterilización in situ que también pueden ser un factor limitante para la escalabilidad. El uso de filtros de profundidad puede compensar las limitaciones de la centrifugación y también aprovechar la tecnología de un solo uso4. Sin embargo, los filtros de profundidad se utilizan principalmente como clarificación secundaria porque no pueden soportar altas densidades de cultivo celular5. Alternativamente, se han empleado dispositivos de retención celular de filtración de flujo tangencial (TFF) para mitigar el estrés cortante, pero pueden experimentar desafíos como la polarización de la membrana y los bajos rendimientos de cosecha6. Los problemas anteriores que surgen del uso de la centrifugación más la filtración de profundidad o TFF crean una oportunidad para la mejora del proceso de clarificación primaria de HCCF.
La separación acústica se introdujo como una tecnología que se puede utilizar para cosechar proteínas secretadas de cultivos celulares con productos proteicos de alta calidad7,8. La separación acústica se logra a través de la propagación y reflexión de ondas estacionarias multidimensionales que interactúan con fluidos suspendidos y partículas retenidas9,10. Estas partículas experimentan tres fuerzas: arrastre de fluidos, gravedad y radiación acústica. Cuando cada una de las fuerzas se oponen por igual entre sí, alcanzando el equilibrio, las partículas quedan suspendidas y atrapadas dentro de la onda estacionaria ultrasónica10. En una suspensión de cultivo celular, las células se mantienen dentro de este plano de nodo de presión de ondas estacionarias, el nodo crece a medida que las células se fusionan y, finalmente, estos grupos de nodos celulares caen de la fuerza gravitacional9. Estas células sedimentadas se eliminan de los medios, lo que permite que los medios clarificados se bombeen para su posterior procesamiento aguas abajo. La utilización de ondas ultrasónicas como método de separación ha comenzado a traducirse en aplicaciones biológicas que van desde la separación de partículas lipídicas y glóbulos rojos11 hasta el cultivo celular de perfusión de mamíferos12. Con sus capacidades relativas para reducir los costos, la mano de obra y el estrés celular al evitar la centrifugación, la filtración en profundidad o TFF, los biofabricantes están explorando las aplicaciones potenciales del uso de la separación acústica.
Este estudio proporciona un protocolo general para operar un separador de ondas acústicas (AWS) de sobremesa para la clarificación del cultivo celular CHO, presenta datos representativos y demuestra cómo lograr una clarificación celular efectiva y la recuperación del producto.

<table><tbody><tr><td>cámara acustoforética</td><td>Pall</td><td>CAS-AC-K1 Kit de cámara acústica de cadencia</td> ActiCHO P GE SH31025.01 medio en polvo AWS Pall CAS-SYS (60500101-SP)Software de separación acústica de cadencia Pall Interfaz de separador acústico de cadencia versión 1.0.4 Celdas CHO-K1 VRC VRC01 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computadora</td><td>Dell</td><td>Latitude 3470</td><td>Windows 7, sistema operativo de 64 bits</td></tr><tr><td>Isopropanol (70%)</td><td>LabChem</td><td>LC157605</td><td>20L preparado 70% IPA</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-005-CV</td><td>200 mM solución madre</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 14 tubos</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-14</td> tubos de <td>silicona curados con peróxido, 25 pies</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 tubos</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-16</td><td>Tubo de silicona curado con peróxido, 25 pies</td></tr><tr><td>Juego de tubos</td><td>Pall</td><td>CAS-FP-K1 Juego de tubos</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de turbidez</td><td>Pall</td><td>CAS-TS-S1 (60500106)</td><td></td></tr></tbody></table>

clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con cho utilizando un separador acústico

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

La clarificación primaria es un paso esencial en un proceso de biofabricación para la eliminación inicial de células de productos terapéuticos dentro del fluido de cultivo celular cosechado. Si bien los métodos tradicionales como la centrifugación o la filtración se implementan ampliamente para la eliminación de células, el equipo para estos procesos tiene grandes huellas y la operación puede implicar riesgos de contaminación y ensuciamiento del filtro. Además, los métodos tradicionales pueden no ser ideales para esquemas de bioprocesamiento continuo para la clarificación primaria. Por lo tanto, se investigó una aplicación alternativa utilizando ondas acústicas (sonoras) para separar continuamente las células del fluido de cultivo celular. En este estudio se presenta un protocolo detallado para el uso de un separador de ondas acústicas (AWS) a escala de banco para la separación primaria del fluido de cultivo que contiene un anticuerpo IgG1 monoclonal de una cosecha de biorreactores de células CHO. Los datos representativos se presentan desde AWS y demuestran cómo lograr una aclaración de celdas y recuperación de productos efectivas. Por último, se analizan las posibles aplicaciones de AWS en el bioprocesamiento continuo. En general, este estudio proporciona un protocolo práctico y general para la implementación de AWS en la clarificación primaria para cultivos celulares CHO y describe con más detalle su potencial de aplicación en el bioprocesamiento continuo.

Como se describe en el protocolo, el AWS se utilizó para aclarar HCCF a una densidad de 12,4 x 106 celdas/ml, como se muestra en la Figura 1. La bomba de alimentación se ajustó a 3,5 ml / min (5 L / día), lo que representa una tasa de sangrado celular dentro del rango adecuado presumible para un cultivo de 10-20 L. A medida que el HCCF entró en la cámara AWS, las mediciones de turbidez de la sonda de turbidez de alimentación se mantuvieron consistentes, alrededor de 1.000-1.100 NTU, y las mediciones de la sonda de turbidez de la sonda de sonda1 se mantuvieron alrededor de 40-50 NTU(Figura 8). Usando las dos mediciones, la eficiencia de eliminación de células
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
se calculó y promedió el 95%. Se encontró que una medición de turbidez de 40-50 NTU era el nivel mínimo de turbidez alcanzable y, por lo tanto, no era factible una mayor separación de una cámara DE AWS adicional en serie.
Si bien el AWS podría separarse con alta eficiencia a tasas de flujo más bajas, mantener el HCCF durante más tiempo dentro de la cámara causó aumentos de temperatura, lo que debe ser una consideración al seleccionar tasas de flujo más bajas. La Figura 9 es un ejemplo de la diferencia de temperatura del HCCF antes de entrar en la cámara acustoforética y después de la separación acústica a un caudal de alimentación de 3,5 mL/min, que mostró un aumento de temperatura de &gt;6 °C debido al tiempo prolongado dentro de la cámara acústica.
Otra consideración importante al ejecutar cosechas de alta densidad celular (es decir, &gt;20 x 106 células / ml) es la saturación de las sondas de turbidez. Las mediciones de turbidez para la sonda de turbidez de alimentación se saturaron en más de 4.400 NTU(Figura 10),lo que puede resultar en una subestimación en el cálculo de la eficiencia de eliminación celular.
Para probar el efecto de las diferentes velocidades de alimentación en la clarificación celular, se midió la eficiencia de eliminación de células a diferentes velocidades de alimentación. Como se muestra en la Figura 11,la eficiencia de eliminación de celdas disminuyó significativamente de ~ 100% a 57% a medida que aumentaba la velocidad de la bomba de alimentación. En general, cuanto más lenta sea la velocidad de la bomba de alimentación, mejor será la clarificación de la celda. Sin embargo, se recomienda la optimización de la velocidad de alimentación para cada aplicación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Figura 1: Configuración de AWS. Una vez que las bombas se encendieron con el software(a ), el HCCF se canalizó a través de una bomba de alimentación (b) a través de la sonda de turbidez de alimentación (c) y luego a la cámara AWS (d). Dentro de la cámara, las fuerzas acústicas atraparon las células del flujo en los nodos de las ondas y causaron aglomeraciones. La disminución de la flotabilidad hizo que las células cayeran a través de la fuerza gravitacional, y las células se eliminaron del puerto de desechos de la cámara acustoforética a través de la bomba de etapa 1 (e) a una botella de cosecha celular (f) mientras que el material clarificado salió a la sonda de turbidez de la sonda(c)a través del puerto de permeado de la cámara a una botella de cosecha de producto (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Figura 2: Parte posterior del sistema AWS. Las sondas de turbidez y las cámaras están conectadas a sus respectivospuertos en la parte posterior del sistema AWS a través de cables Ethernet (a) y BNC(b)de alimentación de cámara. Además, la computadora está conectada a través del cable ethernet de la PC (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Figura 3: Sondas de turbidez y carcasa. Cada sonda de turbidez(a ) debe insertarse correctamente en el medidor de turbidez y la carcasa del termómetro respectivos (b) y apretarse con los tornillos. El cable BNC de alimentación de la cámara (c) debe conectarse a la parte posterior de la cámara acustoforética (d) solo después de que el transductor piezoeléctrico de la cámara se llene de líquido. Las sondas se indican de la siguiente manera: F = turbidez de alimentación, 1 = turbidez de la sonda 1, y 2, 3 y 4 son sondas no utilizadas (o se pueden usar para serializar el procedimiento). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Figura 4: Conexión entre la carcasa de turbidez y la cámara acustoforética. El tubo de alimentación está conectado a la entrada del puerto de turbidez dealimentación( a ) a través de la bomba de alimentación. La salida del puerto de turbidez de alimentación (b) se conecta a los puertos de entrada de la cámara acustoforética (c) a través de tubos en y. El tubo de la etapa 1 se conecta desde el puerto de desechos de la cámara acustoforética (d) a través de la bomba de la etapa 1 a un recipiente de recolección de celdas. El puerto de permeado de la cámara acustoforética (e) está conectado a la entrada del puerto de turbidez de la sonda1 (f). El tubo de cosecha está conectado desde fuera del puerto de turbidez de la sonda1 (g) a un recipiente de recolección de productos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Figura 5: Panel de lecturas en el software Del separador acústico. El programa cuenta con dos paneles, "Lecturas" y "Controles". Dentro del panel "Lecturas", se monitorean la turbidez(a ), la temperatura (b) y el porcentaje de reducción (c). Para iniciar la grabación de datos, se debe hacer clic en el botón "Iniciar prueba"(d),que cambiará el color del botón a verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Figura 6: Panel de controles en el programa. Dentro del panel "Controles", las bombas se pueden encender o apagar, y la velocidad de bombeo se puede cambiar para la alimentación (a) y otras etapas (b). Además, la alimentación de la cámara en el transductor piezoeléctrico se puede encender o apagar(c)y cambiarse con una barra deslizante(d). Los experimentos utilizaron 10 W, porque es el ajuste de potencia recomendado para las células CHO según lo recomendado por el fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Figura 7: Cámara de AWS. Una vez que las células estaban dentro de la cámara, las fuerzas acústicas atrapaban las células en nodos de ondas y hacían que las células se agruparan (a). Estos grupos celulares aumentaron de tamaño hasta que perdieron su flotabilidad y finalmente se asentaron por la fuerza gravitacional (b). A continuación, las células asentadas se retiraron del puerto de desechos de la cámara acustoforética a través de la bomba de etapa 1 a una botella de cosecha de células (c). El producto salió de la cámara a través del puerto de permeado (d), mientras que HCCF llenó continuamente la cámara a través de los puertos de entrada (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Figura 8: Mediciones de turbidez para un cultivo celular CHO de 12 x10 6 celdas/ml con una velocidad de bomba de alimentación de 3,5 ml/min. La turbidez de alimentación (azul) fue de aproximadamente 1,000 NTU y el permeado que salió del medidor de turbidez de etapa 1 (naranja) fue de 40 a 60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Figura 9: Mediciones de temperatura para un cultivo de células CHO de 12 x10 6 celdas/ml con una velocidad de bomba de alimentación de 3,5 ml/min. La temperatura de alimentación (azul) fue de aproximadamente 21 ° C y el permeado que salió del medidor de turbidez de la etapa 1 (naranja) fue de aproximadamente 27 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Figura 10: Ejemplo de medición de turbidez para una muestra de alta densidad celular. Cuando la densidad celular fue de &gt;20 x 106 células/ml, la medición de la turbidez de alimentación se saturó al valor máximo de 4.400 NTU, lo que resultó en una subestimación de la eficiencia de eliminación celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Figura 11: Comparación de la eficiencia de eliminación de células. A medida que aumentaba la velocidad de alimentación, la separación celular disminuía. Por lo tanto, a medida que aumentaba la velocidad de alimentación, la eficiencia de clarificación celular disminuía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parámetro</td>
			<td>Especificación</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gasto</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rango de presión</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura del fluido de alimentación</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura de funcionamiento</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Condiciones de funcionamiento. Las condiciones de funcionamiento recomendadas por el fabricante de AWS para el caudal, el rango de presión, el fluido de alimentación y la temperatura de funcionamiento.

Aquí se presenta un protocolo para la clarificación primaria del cultivo celular CHO utilizando un separador acústico. Este protocolo se puede utilizar para la clarificación primaria de cultivos de matraz de agitación o cosechas de biorreactores y tiene la aplicación potencial para la clarificación continua del material de purga celular durante las operaciones de biorreactor de perfusión.

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Nuestro protocolo demuestra cómo utilizar un separador de ondas acústicas a escala de banco para la separación primaria de las células CHO del líquido de cultivo recolectado que contiene un anticuerpo monoclonal modelo. La separación de ondas acústicas proporciona algunas ventajas en comparación con los métodos tradicionales de clarificación primaria, como la centrifugación y la filtración, como el tamaño reducido, el bajo riesgo de contaminación y la reducción del riesgo de ensuciamiento del filtro. Dado que la separación de ondas acústicas proporciona un flujo continuo de material libre de células para los posteriores procesos de filtración y cromatografía, existe potencial para su aplicación en el bioprocesamiento continuo.Para preparar el separador de ondas acústicas, conecte los cables de turbidez a sus respectivos puertos y conecte los cables BNC de alimentación de la cámara a la parte posterior del sistema de separación de ondas acústicas. Inserte las sondas de turbidez en el medidor de turbidez y en la carcasa del termómetro y apriete los tornillos. Conecte el tubo de alimentación a la entrada del puerto de turbidez de alimentación a través de la bomba de alimentación.Y conecte el tubo en Y desde la salida del puerto de turbidez de alimentación hasta el puerto de entrada de la cámara acustoforética. Conecte la tubería de la etapa 1 desde el puerto de desechos de la cámara acustoforética a un recipiente de recolección de celdas a través de la bomba de la etapa 1 y conecte la tubería desde el puerto de permeado de la cámara acustoforética a la entrada del puerto de turbidez de la sonda 1. Luego, conecte la tubería de cosecha desde el puerto de turbidez de la sonda 1 a un recipiente de recolección de producto.Para cebar el sistema con el fluido de cultivo celular recolectado, encienda el separador de ondas acústicas y abra el programa de software asociado. En el panel Lecturas, haga clic en Iniciar prueba para iniciar el registro de datos. Y conecte el extremo del tubo de alimentación al recipiente de fluido de cultivo celular recolectado que se está agitando.Para poner en marcha la bomba de alimentación, introduzca la velocidad de la bomba y pulse Intro. Confirme que la flecha de dirección de la bomba esté correctamente orientada para garantizar que el fluido de la célula se bombee desde el recipiente hasta la cámara acustoforética y haga clic en el icono del triángulo para iniciar. Controle las mediciones de turbidez de alimentación en el panel de reducción de porcentaje durante el llenado de la cámara acustoforética.Si el fluido de cultivo celular recolectado se mezcla lo suficiente dentro del recipiente de fluido celular, los valores de turbidez serán consistentes durante la carga de la cámara. Una vez que el líquido esté por encima del transductor piezoeléctrico en la parte posterior de la cámara acustoforética, haga clic en Apagar para detener la bomba. Y conecte el otro extremo del cable de alimentación BNC a la cámara acustoforética.Una vez que la cámara acustoforética esté llena y encendida, cambie la velocidad de la bomba de alimentación a la velocidad de funcionamiento deseada. Para encender la alimentación piezoeléctrica de la etapa 1, deslice la barra en el módulo de potencia a 10 vatios y haga clic en Encender.Una vez que las celdas comiencen a asentarse en el fondo de la cámara acustoforética, encienda la bomba de la etapa 1 con una tasa adecuada basada en la densidad de la celda y la velocidad de la bomba de alimentación, mientras observa de cerca las cámaras del separador de ondas acústicas y ajusta las tasas de la bomba según sea necesario. Para calcular la masa de celda empaquetada, tara una báscula con un tubo vacío de 15 mililitros y llene el tubo con material de alimentación.Después de registrar el peso total del tubo con alimentación, centrifugar el tubo y decantar el sobrenadante en un nuevo recipiente. Mida el peso del tubo con el pellet de celda. Luego, monitoree el perfil de turbidez de la etapa 1 a medida que el desbordamiento de la cámara acustoforética ingresa a la sonda de turbidez 1.Cuando termine la ejecución, detenga las bombas de alimentación y de la etapa 1 y apague la alimentación de la cámara. Desconecte el cable de alimentación BNC y recoja el material de recolección del producto para el análisis posterior. Para drenar el líquido restante de la cámara acustoforética, coloque el tubo de desagüe en un recipiente vacío.Desconecte el tubo de los puertos de entrada y permeado de la cámara acustoforética, y libere el tubo de desecho del cabezal de la bomba. Cuando la cámara esté vacía, vuelva a conectar la tubería, vuelva a colocar la tubería de desecho en el cabezal de la bomba y use una velocidad de bombeo de alimentación y etapa 1 de 60 mililitros por minuto para enjuagar el agua desionizada del extremo de la tubería de alimentación durante 15 a 20 minutos. Al final del enjuague con agua, bombee alcohol isopropílico al 70% a través del tubo y la cámara durante 15 a 20 minutos, seguido de un enjuague adicional con agua desionizada de 15 a 20 minutos.En este análisis representativo, a medida que el fluido celular recolectado ingresaba a la cámara separadora de ondas acústicas, las mediciones de turbidez de la sonda de turbidez de alimentación permanecieron consistentes, alrededor de 1000 a 1100 NTU. Y las mediciones de la sonda de turbidez 1 se mantuvieron alrededor de 40 a 50 NTU. Mantener el fluido celular recolectado dentro de la cámara durante períodos de tiempo más largos provoca aumentos de temperatura, como en este ejemplo de una diferencia de temperatura superior a seis grados Celsius del fluido celular recolectado antes de ingresar a la cámara acustoforética y después de la separación acústica.Otra consideración importante cuando se ejecutan cosechas de alta densidad celular es la saturación de las sondas de turbidez, ya que las mediciones de turbidez para la sonda de turbidez de alimentación se saturan por encima de 4600 NTU, lo que probablemente resulte en una subestimación en el cálculo de la eficiencia de eliminación de celdas. Además, la eficiencia de eliminación de celdas disminuye significativamente de aproximadamente 100% a 57% a medida que aumenta la velocidad de la bomba de alimentación, con una velocidad de bombeo de alimentación más lenta que generalmente se correlaciona directamente con una mejor clarificación de la celda. A medida que los fabricantes de productos biotecnológicos avanzan hacia la fabricación continua, el uso de la tecnología de ondas acústicas puede tener aplicaciones adicionales para el bioprocesamiento continuo y las operaciones de biorreactores de profusión.

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