Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

El protocolo estandarizado se puede utilizar para evaluar la migración celular endógena y se puede aplicar a varios tipos de células, así como a fenotipos esqueléticos. La ventaja de esta técnica es que permite rastrear la migración celular in vivo para células individuales en lugar de una población de células en respuesta a una lesión y/o tratamiento con citocinas. Antes de comenzar el procedimiento, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en el ratón anestesiado y aplique ungüento en los ojos del animal.

A continuación, haga una incisión transversal de menos de un centímetro desde la oreja inmediatamente medial a la derecha hacia la oreja izquierda y haga una segunda incisión desde la incisión inicial, aproximadamente dos o tres milímetros más allá del ojo derecho hacia la nariz. Use fórceps para separar la piel del periostio y use tijeras para cortar suavemente el tejido conectivo para separar la piel del periostio de la calvaria. Con un hisopo de algodón estéril, aplique un ungüento oftálmico en la parte superior del colgajo de piel y doble suavemente el colgajo sobre el ojo izquierdo.

La intersección de las suturas sagital y coronal debe estar claramente expuesta. Enjuague la superficie abierta con PBS estéril para limpiar el área de sangre y cabello residual y coloque la punta de un bisel de uno a dos anchos de aguja hacia la nariz desde la sutura coronal y de uno a dos anchos de aguja a la derecha de la sutura sagital. Usando una cantidad muy pequeña de presión hacia abajo, gire cuidadosamente la jeringa en el sentido de las agujas del reloj una vez y en el sentido contrario a las agujas del reloj varias veces.

A continuación, utilice una aguja de calibre 27 para ensanchar la microfractura a aproximadamente 40 micrómetros. Si quedan fragmentos óseos, enjuague la microfractura con PBS. Si aún quedan fragmentos de hueso, use una aguja de calibre 29 para extraer los fragmentos con cuidado.

Para el tratamiento con CCL5, utilice una solución CCL5 de 100 nanogramos por mililitro y una matriz de membrana basal para obtener una solución quimioatrayente de trabajo de 10 nanogramos por mililitro. Para tratar la lesión, cargue una pipeta de 220 microlitros con cinco microlitros de la solución y aplique dos microlitros de la quimiocina a la sutura. A continuación, deje que la matriz se solidifique y cubra suavemente la calvaria con el colgajo de piel para asegurarse de que el tejido no se deshidrate durante el tratamiento de quimiocina de una hora.

Para obtener imágenes intravitales de la migración perióstica de células madre en tiempo real, antes de mover el ratón al microscopio, aplique una presión suave en la parte posterior de la cabeza del ratón para comprobar el plano visual de la pantorrilla. Si el avión no está nivelado, gire suavemente el sistema de sujeción del ratón hacia la izquierda o la derecha para ajustar la posición. A continuación, cubra toda la calvaria con un colgajo de piel con metilcelulosa estéril al 2% en agua y coloque el ratón en la platina de microscopio motorizado del eje XYZ.

Con la luz epifluorescente, alinee el ratón de modo que quede frente al microscopio y que la intersección de las suturas coronal y sagital sea el punto de referencia central de la platina. A continuación, coloque una cubierta de cristal en la zona de la imagen y vuelva a comprobar la alineación. Para obtener imágenes de lapso de tiempo de la migración hacia adentro y hacia afuera de la sutura, seleccione una lente de inmersión en agua de bajo aumento para escanear la pantorrilla.

Adquiera una imagen de referencia de la intersección de las suturas sagital y coronal y, utilizando las señales SHG y fluorescentes de las células, localice cada sitio de lesión y registre las coordenadas XYZ, así como las distancias de las suturas sagitales y coronales. Seleccione una ubicación en las suturas coronales o sagitales para obtener imágenes a largo plazo y obtenga una imagen ZStack detallada de esta área como referencia durante la toma de imágenes. Utilice la configuración del software de lapso de tiempo para grabar una imagen cada minuto durante al menos una hora, comparando el campo de visión actual con el campo de visión inicial en el tiempo entre instantáneas.

Si los campos de visión son diferentes, utilice la imagen ZStack para determinar en qué dirección se debe ajustar el campo de visión. Recientemente, se generaron ratones reporteros de GMP alfa-SMA de tomate Mx1 en los que las células madre esqueléticas periósticas están marcadas por un doble marcaje alfa-SMA positivo para Mx1. Se observa poca o ninguna migración de células madre esqueléticas periósticas alfa-SMA positivas a Mx1 durante un período de imágenes de una hora, 24 horas después de la colocación de la sutura.

El tratamiento con quimiocinas CCL5 de un defecto de la pantorrilla 24 horas después de la lesión induce una migración direccionalmente distinta desde la sutura coronal hacia el sitio de la lesión. En este análisis representativo, dentro de una hora de la imagen, una de las células madre esqueléticas periósticas Mx1 positivas para alfa-SMA migró aproximadamente 50 micrómetros hacia la lesión. El aspecto más importante de este protocolo es limitar el tratamiento con CCL5 al sitio de la lesión para estimular la migración específica de la célula.

Una vez finalizado este procedimiento, se puede continuar con el tratamiento localizado durante una semana. Una microtomografía computarizada se puede utilizar para evaluar la cicatrización de lesiones en la pantorrilla y la deposición de minerales.