Name: Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a investigar el efecto del extracto de humo de cigarrillo en la colonización bacteriana de Pseudomonas en células epiteliales pulmonares. Este protocolo detallado permite evaluar la carga bacteriana tras la exposición al humo.

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Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud R01 HL125435 y HL142997 (a CZ).

1. Preparación 100% CSE
<ol><li>Dibuje 10 ml de medios de cultivo celulares libres de suero (DMEM/F12 para células BEAS-2B; medio basal de células epiteliales de las vías respiratorias para células HSAEC) en una jeringa de 60 ml.</li>
	<li>Fi reversely attach an appropriately trimmed 1 mL pipette tip to the nozzle of the syringe as an adapter to hold the cigarette (3R4F).</li>
	<li>Retire el filtro del cigarrillo. Coloque un cigarrillo en el adaptador de punta y peina el cigarrillo.</li>
	<li>Dibuje 40 ml de aire que contenga humo en 10 ml de medios libres de suero. Mezclar el humo con el medio agitando vigorosamente (30 s por dibujo).</li>
	<li>Repita el paso 1.4 aproximadamente 11x en 7 min hasta que el cigarrillo se queme por completo.</li>
	<li>Filtrar los 10 ml de medios ahumados con un filtro de 0,22 m para excluir cualquier microorganismo y partículas insolubles. Transfiera a un tubo estéril cerrado. Preparar el 100% CSE no más de 30 min antes del ensayo posterior.</li>
</ol>2. Cultura Pseudomonas
<ol><li>Inocular congelado P. aeruginosa (deformación PAO1) o P. fluorescens Migula (desgasitar PAO143) en una placa de agar de caldo de soja tríptico (TSB) para cultivo nocturno a 37oC. NOTA: Para obtener suficientes bacterias para el cultivo, esparza tantas bacterias en la placa de agar TSB como sea posible.</li>
	<li>Recoger un frotis bacteriano e incubar en 20 ml de TSB con 5% de glicerol como fuente de carbono.</li>
	<li>Agitar la suspensión bacteriana en una incubadora de 37oC a 200 rpm durante 1 h hasta que el OD600 valor sea 0,6. ADVERTENCIA: No deje que la velocidad de agitación supere las 200 rpm. Las velocidades de agitación más altas pueden dañar la morfología de la flagela bacteriana e impactar la invasión bacteriana en la epitelia pulmonar. Del mismo modo, limitar el tiempo de agitación a 1 h para obtener bacterias altamente invasivas. Mida el valor deOD 600 para estimar el número de bacterias. Un OD600 a 1 corresponde a 10unidades formadoras de colonias (CFU)/ml.</li>
</ol>3. Cultivo celular epitelial pulmonar humano y tratamiento con EEB
<ol><li>Cultivo de células BEAS-2B humanas en medio HITES (500 mL de DMEM/F12, 2,5 mg de insulina, 2,5 mg de transferrina, 2,5 mg de selenita sódica, 2,5 mg de transferrina, 10 m de hidrocortisona, 10 m β-estradiol, 10 mM HEPES y 2 mM de L-glutamina) complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) descrito anteriormente24.</li>
	<li>Cultivo de células epiteliales de vías respiratorias primarias humanas (HSAEC) en el medio de cultivo de células epiteliales de las vías respiratorias (500 ml de medio basal de células de las vías respiratorias, 500 g/ml de HSA, ácido linoleico de 0,6 m, Lecitina de 0,6 g/ml, 6 mM de L-glutamina, 0,4% de extracto P, 1,0 m de epinefrina, 5 g/ml de transferrina, 10 nM T3, hidrocortisona de 1 g/ml, ng ng/ml de rh/ mL y insulina de 5 g/ml). Incubar las células a 37oC en un 5% de CO2.</li>
	<li>Disociar las células con 1 ml de 0,25% de trippsina durante 5 min hasta que las células se desprenden completamente de la parte inferior de la placa.</li>
	<li>Añadir 10 ml de medio HITES completo para neutralizar la trippsina y recoger las células en un tubo de 15 ml. Centrifugar a 4oC a 300 x g durante 5 min. ADVERTENCIA: Controle cuidadosamente el tiempo para la digestión de la trippsina por microscopía, ya que la sobredigestión puede causar la muerte celular.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 2 ml de medio HITES con 10% de FBS.</li>
	<li>Pipetear 10 l de la suspensión celular anterior sobre la placa e insertarla en un contador de células automatizado para obtener la concentración en células/ml.</li>
	<li>Placa BEAS-2B células a una concentración de 3 × 105 células/ml en 6 placas de pozo en un volumen total de 2 ml en medio HITES complementado con 10% de FBS para cultivo nocturno.</li>
	<li>Tratar las células a aproximadamente 80% de confluencia, o 5 x 105 células/ml, con 4% CSE durante 3 h. Antes del tratamiento con CSE, cambie el medio con el medio HITES con el 1% de FBS.</li>
</ol>4. Infección bacteriana
<ol><li>Añadir P. aeruginosa o P. fluorescens Migula (1 ×10 7 CFU/mL) a cada pozo de las células tratadas con CSE e incubar durante 1 h a 37oC en 5% co2.</li>
	<li>Aspirar los sobrenadantes y reemplazarlos con 2 ml de medio HITES fresco para tratar con 4% de CSE y 100 g/ml de gentamicina. NOTA: La gentamicina se utiliza porque no puede penetrar las membranas celulares epiteliales pulmonares humanas. Por lo tanto, puede matar todas las bacterias en el medio, pero no las que invadieron las células epiteliales pulmonares.</li>
	<li>Después de 1 h de tratamiento con CSE/gentamicina a 37oC en 5% de CO2,aspirar los sobrenadantes y lavar las células 3x con PBS para la posterior determinación de la concentración bacteriana. NOTA: Para confirmar las bacterias internalizadas, se observaron células infectadas con P. fluorescens Migula con etiqueta GFP bajo microscopía fluorescente.</li>
</ol>5. Determinación de la concentración bacteriana utilizando el método de placa de caída
<ol><li>Para determinar la carga bacteriana en las células infectadas con el método de placa de gota, lave las células tratadas con gentamicina 2x con 2 ml de PBS frío.</li>
	<li>Agregue 1 ml de búfer de lelisis de celda (0,5% tritón X-100 en PBS) a cada pozo.</li>
	<li>Diluir los lysates celulares que contienen las bacterias internalizadas en un gradiente (1:10, 1:100, 1:1,000 y 1:10,000) para la siguiente inoculación a la placa de agar TSB.</li>
	<li>Después de 16 h de incubación, obtener los resultados de la CFU mediante el conteo de las colonias bacterianas.</li>
</ol>6. Detección RT-qPCR de rRNA bacteriana 16S
<ol><li>Tratar las células epiteliales pulmonares infectadas por Pseudomonas(1 x 106 células/ml) con gentamicina como se ha descrito anteriormente. Aspirar el medio y lavar las células 2x con 2 ml de PBS frío.</li>
	<li>Añadir 0,35 ml del tampón de lelisis de tiocianato de guanidiodium por pozo de una placa de 6 pozos. Recoger las células con un rascador de células. Pipetear el licate en un tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente con la pipeta.</li>
	<li>Añadir el mismo volumen (0,35 ml) de etanol recién preparado al 70% de etanol en el izado y mezclar bien. Transfiera todas las muestras a una columna de centrifugado colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar a 10.000 g para 30 s a 20–25 oC. A continuación, deseche el búfer en el tubo de recogida.</li>
	<li>Lave la columna con 0,7 ml de tampón de lavado 1. Centrifugar la columna a 10.000 x g durante 30 s. Lavar la columna 2x con 0,5 ml de tampón para lavar el ARN ligado a la membrana. Repita la centrifugación a 10.000 x g durante 2 min.</li>
	<li>Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. Añadir de 30 a 50 l de agua libre de RNase. Centrífuga a 10.000 g g durante 1 min. Recoger el flujo a través y medir la concentración de ARN.</li>
	<li>Realizar una reacción de transcripción inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Mezclar 1 g de ARN total con 10 ml de tampón de reacción, 1 ml de transcriptasa inversa y agua libre de RNase para una reacción de 20 ml. Llevar a cabo la reacción de transcripción inversa a 37 oC durante 1 h y luego 95 oC durante 5 min.</li>
	<li>Mezclar las plantillas de ADNc (1 l de cada reacción de transcripción inversa anterior), 5 l de la mezcla maestra que contiene tinte SYBR, 1 l de cada imprimación específica de 200 nM y agua en una mezcla de 20 ml para el siguiente análisis de PCR, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. NOTA: Las siguientes son las imprimaciones dirigidas al rRNA 16S de P. aeruginosa:adelante 5o-CAAAACTACTGATATAGAGTACG-3o; reverso 5o-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3o. GAPDH se utilizó como control de carga con los siguientes imprimadores: adelante: 5o-GGCATGGACTGGTCATGA-3o; reverso: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3o.</li>
	<li>Utilice el método de TC comparativo para determinar la expresión.</li>
</ol>7. Detección de Pseudomonas fluorescentes con citometría de flujo
<ol><li>Tratar las células epiteliales pulmonares infectadas por Pseudomonasfluorescentes anteriores (1 x 106 células/ml) con gentamicina como se describió anteriormente. Aspirar el medio y lavar las células 2x con 2 ml de PBS frío.</li>
	<li>Analice las muestras con un citómetro de flujo a una longitud de onda de 509 nm para la detección de GFP. Termine cada lectura en 100.000 recuentos. Analizar los datos adquiridos con software relacionado.</li>
</ol>

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<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La invasión bacteriana en células epiteliales pulmonares es un paso crucial en la patogénesis de las infecciones bacterianas. El proceso de invasión bacteriana en las células se puede dividir en los tres pasos siguientes: En primer lugar, las bacterias entran en contacto y se adhieren a la superficie de la célula epitelial utilizando su flagelo. En segundo lugar, las bacterias se someten a interiorización o penetran en la membrana celular. Finalmente, las bacterias replican y colonizan las células si escapan con éxito de...

El tabaquismo afecta la salud pública de millones de personas en todo el mundo. Muchas enfermedades notorias, incluyendo el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se han notificado relacionadas con el tabaquismo1,2. Fumar cigarrillos aumenta la susceptibilidad a las infecciones microbianas agudas en el sistema respiratorio3,4,5. Además, la creciente evidencia demuestra que fumar cigarrillos mejora la patogénesis de muchos trastornos crónicos6,,7,,8. Por ejemplo, fumar cigarrillos puede aumentar las infecciones virales o bacterianas que causan exacerbación de la EPOC9. Entre los patógenos bacterianos que contribuyen etiológicamente a la exacerbación aguda de la EPOC, un patógeno del bacilo gramnegativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,provoca infecciones que se correlacionan con los malos pronósticos y las mayores mortalidades10,11. La exacerbación de la EPOC empeora la enfermedad al acelerar la progresión patológica. No existen terapias eficaces contra la exacerbación de la EPOC, excepto para el manejo antisintomático12. La exacerbación de la EPOC promueve la mortalidad de los pacientes, disminuye la calidad de vida y aumenta la carga económica para la sociedad13.
Las vías respiratorias son un sistema abierto, sometido continuamente a diversos patógenos microbianos presentes externamente. Los patógenos bacterianos oportunistas se detectan generalmente en las vías respiratorias superiores, pero a veces se observan en las vías respiratorias inferiores14,15. En los modelos animales P. aeruginosa se puede detectar en sacos alveolares tan pronto como 1 h después de la infección16. Como un mecanismo de defensa importante, las células inmunitarias como los macrófagos o los neutrófilos eliminan las bacterias de las vías respiratorias. Las células epiteliales pulmonares, como la primera barrera fisiológica, desempeñan un papel único en la defensa del huésped contra las infecciones microbianas. Las células epiteliales pulmonares pueden regular la invasión microbiana, la colonización o la replicación independientemente de las células inmunitarias17. Algunas moléculas encontradas en las células epiteliales, incluyendo PPARg, ejercen funciones antibacterianas, regulando así la colonización bacteriana y la replicación en las células epiteliales pulmonares18. Fumar cigarrillos puede alterar las moléculas y afectar la función normal de defensa en las células epiteliales pulmonares19,20. Estudios recientes informaron de la exposición directa del humo del cigarrillo a las células epiteliales pulmonares utilizando el aparato robótico de fumar21,22. Sin embargo, la exposición al humo se puede realizar de otras maneras, incluida la aplicación de la EEB. La preparación de la EEB es un enfoque reproducible con posibles aplicaciones en otros tipos de células, incluidas las células endoteliales vasculares que están indirectamente expuestas al humo del cigarrillo.
Este informe describe un protocolo para generar extracto de humo de cigarrillo para alterar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares. La EEB aumenta la carga bacteriana de P. aeruginosa,y puede contribuir a la recurrencia de infecciones bacterianas generalmente observadas en la exacerbación de la EPOC. Se utiliza un método convencional para la preparación de la EEB. Las células epiteliales pulmonares, en su etapa de crecimiento exponencial, se tratan con 4% de EEB durante 3 h. Alternativamente, las células epiteliales pulmonares cultivadas en monocapa pueden exponerse directamente al humo del cigarrillo en una interfaz aire-líquido. Las células tratadas con CSE se enfrentan a los desafíos con Pseudomonas en una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las bacterias se propagan a una velocidad de agitación particular para asegurar que la morfología de su flagela permanezca intacta para conservar toda su capacidad invasiva. La gentamicina se emplea para matar las bacterias que quedan en el medio de cultivo, reduciendo así la contaminación potencial durante la posterior determinación de la carga bacteriana. El protocolo también utiliza Pseudomonasetiquetada por GFP, que ha sido utilizado como una poderosa herramienta en el estudio de la infección por Pseudomonas en diferentes modelos. Una cepa representativa es Migula23de P. fluorescen. El grado de infección o carga bacteriana después del tratamiento de la CSE se determina de tres maneras: el método de placa de caída con recuento de colonias, PCR cuantitativo utilizando imprimaciones específicas de Pseudomonas 16S rRNA, o citometría de flujo en células infectadas con Pseudomonasfluorescentes. Este protocolo es un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td> medio basal de células epiteliales de las vías respiratorias <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de bacterias</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kit de crecimiento de células epiteliales bronquiales</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Sistema</td> <td>de PCR en tiempo realBio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIT de ARN a ADN de alta capacidad</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES medio</td><td>ATCC ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>células BEAS-2B humanas</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas primarias humanas</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Nikkon</td> Lector <td>Nikkon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OD Imprimaciones</td><td>científicas</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>PCR</td> de EE. UU. <td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC 47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>Pseudomonas fluorescens Migula</td><td>ATCC</td><td>ATCC 27853</td><td>P.aeruginosa GFP</td></tr><tr><td>Cigarrillos de grado de investigación (3R4F)</td><td>Universidad de Kentucky</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Transprent PET Transwell Inserto</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

El tabaquismo es la principal causa etiológica para el enfisema pulmonar y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Fumar cigarrillos también promueve la susceptibilidad a las infecciones bacterianas en el sistema respiratorio. Sin embargo, los efectos del tabaquismo en infecciones bacterianas en células epiteliales pulmonares humanas aún no se han estudiado a fondo. Aquí se describe un protocolo detallado para la preparación de extractos para fumar cigarrillos (CSE), tratamiento de células epiteliales pulmonares humanas con EEB, y la determinación de infecciones bacterianas e infecciones. CSE se preparó con un método convencional. Las células epiteliales pulmonares fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células tratadas con CSE fueron, entonces, infectadas con Pseudomonas a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las cargas bacterianas de las células fueron determinadas por tres métodos diferentes. Los resultados mostraron que la EEB aumentó la carga de Pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este protocolo, por lo tanto, proporciona un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.

Un diagrama se utiliza para ilustrar el protocolo en la figura 1. Las células EPIteliales pulmonares BEAS-2B fueron tratadas con CSE y desafiadas con Pseudomonas. Pseudomonas en el medio de cultivo fueron asesinados por la gentamicina añadida y las células fueron sometidas al ensayo de placa de caída, la detección RT-qPCR de Pseudomonas ribosoma 16S ARN, y la citometría de flujo. En comparación con el control, el tratamiento con EEB aumentó sustancialmente la infec...

Aquí se describe un protocolo para estudiar cómo el extracto de humo de cigarrillo afecta la colonización bacteriana en las células epiteliales pulmonares.

Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Este protocolo utiliza tres enfoques para determinar si el humo del cigarrillo afecta la carga bacteriana pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este método se puede expandir a celdas endoteliales u otros grifos de celda. La preparación de la extracción de humo de cigarrillo, la infección bacteriana y la determinación con una carga bacteriana están bien descritas en detalle en este video.Este procedimiento es muy fácil de seguir para los nuevos usuarios. Dibuje 10 mililitros de medio de cultivo celular libre de suero en una jeringa de 60 mililitros. Fije el extremo estrecho de un borde a la punta de la pipeta de un mililitro a la boquilla de la jeringa, como adaptador para sujetar el cigarrillo.Retire el filtro del cigarrillo y conecte el cigarrillo al adaptador. No más de 30 minutos antes de realizar el ensayo peina el cigarrillo y extrae 40 mililitros de humo que contenga aire en la jeringa. Mezclar el humo con el medio agitando la jeringa vigorosamente.Repita el proceso de dibujo hasta que el cigarrillo se queme por completo, lo que requerirá unos 11 sorteos en aproximadamente siete minutos. Para eliminar microorganismos y partículas insolubles del medio, filtre a través de un filtro de 0,22 micras. A continuación, transfiera el medio a un tubo estéril cerrado.Inocular un caldo de soja tríptico o un plato de barrena TSB con una cepa de pseudomonas seleccionada. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Preparar un tubo que contenga 20 mililitros de TSB con 5% de glicerol como fuente de carbono.Recoger un frotis de la placa de barrena e inocular el TSB. Incubar la suspensión de pseudomonas en un agitador de 37 grados Celsius a 200 RPM, durante aproximadamente una hora, hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros sea 0,6. Después de cultivar células epiteliales pulmonares como se describe en el manuscrito, agregue un mililitro de 0.25%trypsin a las células.Después de aproximadamente cinco minutos, cuando las células se hayan separado completamente de la parte inferior de la placa, agregue 10 mililitros de medio Alturas completo para neutralizar la trippsina. Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Luego, centrifuga las células durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados y 300 veces G.Retire y deseche el sobrenadante.Luego, vuelva a suspender las células en mililitros de alturas medio con 10%FBS. Pipetear 10 microlitros de la suspensión de la célula epitelial en una placa nueva. Utilice un contador de células automatizado para obtener la concentración celular.Placar las células epiteliales pulmonares a una concentración de tres veces 10 a las quintas células por mililitro, en un volumen total de dos mililitros de medio por pozo. Incubar los platos durante la noche. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80%confluencia, reemplace el medio por el medio Alturas, más 1%FBS.A continuación, añadir 4%CSE a los pozos e incubar las placas durante tres horas. Agregue una pseudomonas a cada pozo de células epiteliales pulmonares tratadas con CSE. Luego, incuba las placas durante una hora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.A continuación, reemplace el medio en las seis placas de pozo por dos mililitros de nuevo medio Heights, que contiene 4%CSE y 100 microgramos por mililitro de gentamicina. Después de incubar las placas durante una hora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, aspirar el medio de los pozos. Lave dos veces las células tratadas con gentamicina con dos mililitros de PBS frío.La carga de bacterias en las células epiteliales pulmonares se puede detectar mediante el método de placa de caída, qRT-PCR o citometría de flujo. Añadir un mililitro de tampón de lisis celular a cada pozo de células epiteliales pulmonares. Reparar diluciones en serie del lysate celular, que van del uno al 10 al uno a 10.000.A continuación, inocular la placa de sinfín de TSB. Después de 16 horas de incubación, determinar cuántas unidades formadoras de colonias estaban presentes en las células epiteliales pulmonares, contando el número de colonias bacterianas. Añadir 0,35 mililitros del tampón de lisis de tiocianato de guanidinio a cada pozo de células epiteliales pulmonares.Recoger las células con un rascador de células. Pipetear el licate en un tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente con la pipeta. Añadir 0,35 mililitros de recién preparados al 70% de etanol al izado y mezclar bien.Transfiera todas las muestras a una columna de centrifugado colocada en un tubo de recogida de dos mililitros. Centrifugar el tubo de recogida durante 30 segundos a 10.000 veces G y 20 a 25 grados centígrados. Deseche el tampón en el tubo de recogida y lave la columna con 0,7 mililitros de tampón de lavado.Centrifugar la columna a 10.000 veces G durante 30 segundos. Lave la columna dos veces con 0,5 mililitros de tampón. Repita la centrifugación a 10.000 veces G durante dos minutos.Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida de 1,5 mililitros y agregue de 30 a 50 microlitros de agua sin RNase. Después de centrifugar el tubo a 10.000 veces G durante un minuto, recoja el flujo a través y mida la concentración de ARN. Para prepararse para una reacción de transcripción inversa de 20 microlitros, hace que un microgramo de ARN total con 10 microlitros de tampón de reacción, un microlitro de transcriptasa inversa y agua libre de RNase.Llevar a cabo la reacción de transcripción inversa a 37 grados Celsius durante una hora y luego a 95 grados Celsius durante cinco minutos, de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, mezcle un microlitros de cada muestra de ADNc con cinco microlitros de la mezcla maestra que contienen tinte cibernético y un microlitro de cada imprimación específica de 200 nanomolares. Añadir agua para un volumen total de 20 microlitros.Realizar análisis de PCR, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Y luego utilice el método de TC comparativo para determinar la expresión. En las células BEAS-2B, la viabilidad no cambió considerablemente cuando las células fueron tratadas con 4%CSE durante tres horas.Una hora como infección por pseudomonas tampoco afectó sustancialmente la viabilidad. Finalmente, utilizan la gentamicina para matar pseudomonas en el medio de cultivo no tuvieron un efecto estadísticamente significativo en la viabilidad celular. Según lo medido por el método de la placa de caída, la infección bacteriana en las células BEAS-2B se incrementó sustancialmente con el tratamiento con EEB.Lo mismo ocurre con el tratamiento de la CSE de HSAEC. La infección bacteriana de las células BEAS-2B tratadas con EEB también se evaluó mediante el uso de RT-PCR para cuantificar la cantidad de ARN 16S presente, lo que indicó un aumento de Pseudomonas aeruginosa. Las células BEAS-2B tratadas con CSE e infectadas con Pseudomonas fluorescens Migula fueron analizadas por citometría de flujo a 509 nanómetros.El resultado también indicó que el tratamiento con EEB aumenta la infección bacteriana. Los resultados de la microscopía fluorescente mostraron que las bacterias etiquetadas por GFP co-localizadas con células BEAS-2B en un experimento de infección de Pseudomonas fluorescens Migula. Las células podrían estar expuestas al humo del cigarrillo con robots fumando, lo que puede imitar el comportamiento humano y hacer posible estudiar directamente los efectos del humo del cigarrillo en las células epiteliales pulmonares.Esta técnica podría utilizarse para explorar un humo de cigarrillo en otros grifos celulares en el contexto de una infección pulmonar. El enfoque descrito para ser la base para el desarrollo de terapias efectivas contra una lesión pulmonar dorsal fumadora de cigarrillos y C0PD extra

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Células epiteliales pulmonares pueden ser aislados de las vías respiratorias de los ratones y se cultivan en la interfaz aire-líquido como un modelo de epitelio respiratorio diferenciados. Un protocolo es descrito para el aislamiento, el cultivo y la exposición de estas células al humo del cigarrillo convencional, con el fin de estudiar la respuesta molecular a esta toxina ambiental.

Aislamiento de ratón las células epiteliales respiratorias y la exposición al humo del cigarrillo Experimental de la interfaz de aire líquido

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

Se describe el método de agar-perlas para establecer la infección de las vías respiratorias persistente a largo plazo crónica de Pseudomonas aeruginosa en el modelo de ratón.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

El objetivo de este protocolo es proporcionar métodos automatizados para cuantificar las patologías pulmonares crónicas en un modelo murino de EPOC. El protocolo incluye la exposición de ratones al humo del cigarrillo (CS), la medición de la función pulmonar, el inflado de los pulmones y el uso de métodos de morfometría para medir el enfisema y la remodelación de las vías respiratorias pequeñas en ratones.

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

El objetivo de este protocolo es exponer modelos organotípicos de tejido bronquial y nasal en 3D humanos al humo de cigarrillo (CS) convencional en la interfaz aire-líquido. A continuación, se investiga el impacto de la CS en los tejidos mediante un ensayo de actividad del citocromo P450, una medición del latido de los cilios y un enfoque de biología de sistemas.

Evaluación del Impacto de la exposición repetida de Organotípicos 3D bronquiales y nasales Modelos Tissue Culture Whole humo del cigarrillo

Utilizando ensayos ex vivo optimizados de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), demostramos que una preparación de productos de tabaco combustible suprime marcadamente las citocinas secretadas intracelularmente mediadas por receptores y la capacidad citolítica de las PBMC efectoras. Estos ensayos rápidos pueden ser útiles para la evaluación de productos y la comprensión de los posibles efectos a largo plazo de la exposición al tabaco.

Métodos para evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de Combustible Tabaco Preparativos del producto

Mientras que el estudio in vitro de las interacciones huésped-patógeno permite la caracterización de respuestas inmunes específicas, se requieren modelos in vivo para observar los efectos de respuestas complejas. Utilizando la exposición a Candida albicans seguida de una infección pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, establecimos un modelo murino de interacciones microbianas implicadas en la patogenicidad de la neumonía asociada a la ventilación.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Aquí se presenta un protocolo útil para la fijación pulmonar que crea una condición estable para la evaluación histológica de muestras pulmonares a partir de un modelo de ratón de enfisema. La principal ventaja de este modelo es que puede fijar muchos pulmones con la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación.

Fijación pulmonar bajo presión constante para la evaluación del enfisema en ratones

Este protocolo demuestra el estudio de los efectos patofisiológicos del humo de cigarrillo (CS) con un sistema de la exposición de la inhalación del entero-cuerpo (WBI) (WBIS) construido internamente. Este sistema puede exponer a los animales al CS bajo condiciones repetibles controladas para la investigación de efectos CS-mediados sobre enfisema y hematopoyesis del pulmón.

Exposición al humo del cigarrillo en ratones usando un sistema de inhalación de todo el cuerpo

Aquí se presenta un método reproducible, asequible y robusto para el aislamiento y la expansión de células epiteliales bronquiales primarias para biobancos a largo plazo y la generación de células epiteliales diferenciadas por cultivo en la interfaz aire-líquido.

Aislar células epiteliales bronquiales del tejido pulmonar resecado para biobancos y establecer cultivos de interfaz aire-líquido bien diferenciados

En este trabajo describimos un modelo in vitro para aislar y diferenciar células epiteliales murinas de las vías respiratorias, centrándonos en su aclimatación al extracto crónico de humo de cigarrillo (CSE). El modelo podría utilizarse para caracterizar de forma exhaustiva el impacto multiómico de la CSE, lo que posiblemente proporcione información sobre las respuestas celulares bajo una exposición crónica al humo.

Modelo in vitro para el estudio de la diferenciación y los cambios de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas estimuladas con extracto de humo de cigarrillo

Aprende a investigar el efecto del extracto de humo de cigarrillo en la colonización bacteriana de Pseudomonas en células epiteliales pulmonares. Este protocolo detallado permite evaluar la carga bacteriana tras la exposición al humo.

Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares

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