Name: Preparación de extractos celulares mediante criogrinding en un molino congelador automatizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min
Description: Aprende a preparar extractos celulares de levadura mediante criomolienda automatizada a -196°C. Este método preserva la integridad de proteínas y macromoléculas funcionales para estudios bioquímicos y purificación de complejos proteicos.

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La investigación en el laboratorio de Gunjan es apoyada por la financiación de los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Nacional de Ciencias y el Departamento de Salud de Florida. Agradecemos al estudiante de pregrado John Parker por la asistencia técnica.

1. Preparación de palomitas de maíz de levadura
<ol><li>Cultivar células de levadura en 0,5 L de medios YPD a una densidad de 1 x 107 células/ml. Cuente las células utilizando un contador coulter o cualquier otro medio.</li>
	<li>Células centrífugas durante 10 min a 2.400 g y 4oC.</li>
	<li>Lave cada muestra una vez con 500 ml de agua desionizada en frío de 18 mega Ohm Milli-Q.</li>
	<li>Pellets de resuspendición en 15 mL de tampón de lisis helada [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0.1% Tween, 10% glicerol, con agente reductor 10 mM 10 mM β-mercaptoetanol, cóctel inhibidor de la proteasa, inhibidor de 10 M de inhibidor de proteasoma MG-132, inhibidor de la deacetilasa de 1 mM de butirato sódico e inhibidores de la fosfatasa (1 mM de vanadato de sodio, fluoruro de sodio de 50 mM, 50 mM de sodio β glucerofosfato)]. Consulte la Tabla de materiales para obtener más información. Mantenga las células resuspendidas sobre hielo hasta que las muestras estén listas para el siguiente paso. NOTA: Se puede utilizar una amplia variedad de tampones de lysis que contienen una serie de detergentes no iónicos con las muestras e inhibidores específicos incluidos en él en función de la aplicación posterior. La inclusión de inhibidores proteasas y proteasomales es crucial para prevenir la degradación de las proteínas, especialmente una vez que los extractos se descongelan.</li>
	<li>Haga palomitas de maíz de levadura congeladas agregando lentamente la suspensión celular una gota a la vez usando una pipeta serológica preenfriada en uno o más tubos centrífugos de 50 ml mantenidos en hielo seco y llenos de LN2 hasta justo debajo del borde. Rebane el nitrógeno líquido en el tubo con frecuencia para compensar su pérdida debido a la rápida evaporación. Trabajar en un área bien ventilada para evitar los peligros asociados con la asfixia de nitrógeno.<ol>
<li>En lugar de un tubo de 50 ml, utilice varios tubos de 50 ml atados entre sí (o cualquier recipiente con una boca grande, como una botella de centrífuga de plástico grande que pueda tolerar temperaturas criogénicas) para la preparación de maíz pop(Figura 1A). Cuanto mayor sea el recipiente y su apertura, más fácil será la preparación de palomitas de maíz, ya que esto evita que las palomitas de maíz formen grandes agregados. Un rango de tamaño de 0,3-0,5 cm para las palomitas de maíz es ideal para lograr una molienda/pulverización adecuada utilizando el molino del congelador (Figura 1B).</li>
		<li>Asegúrese de que el LN2 se ha evaporado completamente de los tubos que contienen las palomitas de maíz antes de almacenarlas a -80 oC. Es posible detenerse después de preparar las palomitas de maíz de levadura, ya que son estables durante varios años cuando se mantienen a -80 oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig01.jpg"> Figura 1: Preparación de palomitas de maíz de levadura. (A) La levadura "popcorn" se hace por la congelación por gota de la suspensión celular en LN2. Utilizamos tubos de uno a tres tubos de 50 ml unidos con una banda de goma y colocados en un cubo de hielo lleno de hielo seco. Los tubos se llenan con LN2 hasta justo debajo de sus llantas y se rema con nitrógeno líquido con frecuencia para mantenerlos casi llenos hasta que toda la suspensión celular se había convertido en palomitas de maíz (B) El tamaño de las palomitas de maíz es un determinante importante de la eficiencia óptima de molienda. El rango de tamaño de las palomitas de maíz debe estar entre 0,3 y 0,5 cm de diámetro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Criogrinding
<ol><li>Para empezar, asegúrese de que hay suficiente LN2 disponible para enfriar el molino del congelador, moler viales, suministros y para operar la máquina para todas las muestras. Para menos de cinco muestras, 30-35 L de LN2 debe ser suficiente. Llene la cámara del molino del congelador con LN2 hasta la línea de llenado. ADVERTENCIA: Todos los pasos que impliquen LN2 deben realizarse en un área bien ventilada y el molino congelador en sí debe estar situado en dicha zona para evitar el riesgo de asfixia. Use equipo de protección personal que incluya calzado adecuado, abrigo de laboratorio, gafas de seguridad, una capa base de guantes de nitrilo, luego guantes térmicos, seguidos de otro par de guantes de nitrilo. Tenga mucho cuidado al manipular LN2.</li>
	<li>Cierre lentamente la tapa del molino del congelador, evitando el chapoteo de LN2 y espere unos minutos para que la máquina se enfríe. Puede ser necesario rellenar la cámara con LN2 para compensar la pérdida debida a la evaporación antes de pasar al siguiente paso. NOTA: Rellene LN2 según sea necesario solo hasta la línea de llenado. No llene demasiado la cámara, ya que esto puede ser peligroso y perjudicial para la máquina. Los sistemas de recarga automatizados están disponibles para el molino congelador que puede reponer el LN2 evaporador según sea necesario directamente desde un tanque de almacenamiento conectado al molino del congelador.</li>
	<li>Pre-enfriar los grandes viales de molienda y la barra del impactador magnético sumergiéndolos en LN2 mantenidos en una pequeña dewar separada. Decantar todo el LN2 cuando el LN2 deja de burbujear. A continuación, agregue las palomitas de maíz de muestra/levadura al vial de molienda y séllela firmemente con los dos tapones de acero inoxidable.<ol>
<li>No llene más de un tercio del vial de molienda con la muestra, ya que puede reducir la eficiencia de la molienda. En su lugar, las muestras más grandes se pueden procesar dividiéndolas en dos o más viales y moliéndolas secuencialmente. Los viales de molienda más pequeños se pueden utilizar para muestras más pequeñas (hasta 3 ml).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque el vial de molienda en la cámara del molino del congelador y ciérralo en su lugar. Cierre la tapa.</li>
	<li>Para la levadura en ciernes, moler las muestras para un total de tres ciclos durante 2 minutos/ciclo (con 2 min de descanso para enfriar entre ciclos) a una tasa de trituración de 14. Cuando la máquina se detenga después de completar los ciclos, abra lentamente la tapa del molino del congelador y desbloquee cuidadosamente el vial con el lito de celda congelada en polvo y retírelo del molino del congelador. Si se utilizan varios viales pequeños, trabaje rápidamente para extraer un vial a la vez y colocarlos en hielo seco. NOTA: Por lo general, no es necesario ajustar los parámetros de molienda cuando se utilizan viales de diferentes tamaños con el mismo tipo de muestra. Sin embargo, los parámetros de molienda, como el número de ciclos y la velocidad de molienda, deben determinarse empíricamente para diferentes tipos de muestras, dependiendo de la facilidad con la que se licen. La mayoría de las células de mamíferos y tejidos blandos se licen en 1-2 ciclos a una tasa de aplastamiento de 10. Las muestras más difíciles de allicer como bacterias, levaduras, larvas de mosca y moscas de la fruta adulta requieren 3-6 ciclos a la velocidad máxima, mientras que los tejidos duros como huesos, dientes, etc. pueden requerir hasta 10 ciclos. Una pequeña alícuota de la muestra descongelada se puede ver bajo el microscopio antes y después de la molienda para contar el número de células intactas no alicenciadas para determinar la eficiencia de la lysis. Se ha publicado anteriormente un excelente análisis del impacto de los parámetros de criogrinding en la liberación de proteínas y ADN de levadura en ciernes15.</li>
	<li>Trabajando rápidamente para no permitir que la muestra se descongele, desenrosque cuidadosamente una de las piezas finales (seleccione la que parece haberse soltado un poco durante la molienda) utilizando la herramienta de apertura. Luego, usa un par de fórceps largos (que están pre-enfriados en un cubo con hielo seco) para eliminar la barra del impactador. Recoger la muestra pulverizada invirtiendo y tocando el vial de molienda en un plato de pesaje de poliestireno pre-enfriado con LN2 y mantenido en hielo seco.</li>
	<li>Una vez que todo el lesato de célula congelada en polvo se ha recuperado del vial de molienda, verter el lesate en polvo de la placa de pesaje de nuevo en el tubo de 50 ml y proceder inmediatamente al paso de descongelación lento descrito a continuación para obtener mejores resultados. Alternativamente, almacene el izado en polvo congelado durante la noche a -80 oC, aunque esto puede resultar en cierta degradación.</li>
	<li>Prepare un cubo de hielo con un 50% de purines de hielo y agua y colóquelo en una placa de agitación con un agitador magnético. Sumerja una rejilla de alambre u otro estante adecuado en la suspensión de hielo para sujetar las muestras.<ol>
<li>Luego, descongela lentamente las muestras en un baño de lodo de hielo con agitación constante de la suspensión usando un agitador magnético. Agregue más hielo para reemplazar el hielo derretido (es posible que sea necesario desechar algo de agua para evitar que el cubo de hielo se desborde). Dado que varios inhibidores tienen una vida media corta en tampones acuosos, agregue un cóctel inhibidor de la proteasa adicional (ver Tabla de materiales)y un inhibidor del proteasoma MG-132 de 10 M al lisosato una vez que las muestras comiencen a descongelarse (después de aproximadamente 30 minutos).</li>
		<li>Retire el hielo formado en el exterior de los tubos cada 5 minutos para acelerar el proceso de descongelación. Tenga en cuenta que la rápida descongelación de las muestras a temperatura ambiente o superior puede conducir a una degradación significativa.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de que las muestras se hayan descongelado por completo (puede tardar más de una hora dependiendo de la cantidad de muestra), centrifugar el izado a 3.220 g durante 20 minutos en una centrífuga de mesa refrigerada a 4 oC para eliminar la mayor parte de los desechos celulares del principio.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a tubos centrífugos de policarbonato de 50 ml que hayan sido pre-enfriados sobre hielo y centrifugar las muestras a 16.000 g durante 20 min a 4oC (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Transfiera sólo el sobrenadante transparente que consiste en el extracto de célula entera clarificada del centro de la columna líquida en el tubo muy lentamente y con cuidado, sin alterar la capa lipídica turbia (Figura 2), en un tubo refrigerado de 15 ml utilizando pipetas serológicas pre-refrigeradas. Evite eliminar todo el izado en el tubo de la centrífuga para evitar el arrastre de lípidos y desechos. El sobrante de izado en el tubo centrífugo se puede centrifugar varias veces para recuperar pequeñas cantidades de extracto después de cada giro. NOTA: Los lípidos junto con las proteínas desnaturaladas parecen turbios/lechosos y se encuentran en la parte superior de la interfaz líquido/aire, y ocasionalmente por encima del propio pellet que consiste en residuos celulares insolubles (Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61164/61164fig02.jpg"> Figura 2: Extraer capas en un tubo centrífugo. Se indican las principales características visibles de todo el extracto de célula en un tubo después de la centrifugación a 16.000 g durante 20 min. La abundancia relativa de cada entidad depende del tipo de muestra, la fase de crecimiento de las células (exponencial frente a estacionaria), la cantidad de búfer de lelisis utilizado para resuspend células y la eficiencia de la lysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61164/61164fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="12"><li>Centrifugar cualquier lysate restante durante 5 minutos para recuperar más del extracto. Repita esta centrifugación de 5 minutos varias veces si es necesario para recuperar la mayor cantidad de extracto transparente posible. Deseche el izado turbio que contiene lípidos cerca de la parte inferior del tubo cerca del pellet.</li>
	<li>Utilice estos extractos para aplicaciones posteriores como purificación compleja de proteínas, inmunoprecipitación y análisis proteómico.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una limitación del estudio de las proteínas nativas de la levadura es la lisis ineficiente de las células de levadura debido a su pared celular resistente. Aunque se han desarrollado varios métodos, el método más consistente y eficiente en nuestras manos es el criogrinding de las células de levadura flash congelado como palomitas de maíz. Este método permite la preparación confiable de extractos de células enteras de alta calidad de levadura en ciernes en comparación con otros métodos de lysis. Los resultados representat...

La levadura es un organismo modelo popular para los estudios de proteínas, ya que es un organismo eucariota simple con una abundancia de herramientas genéticas y bioquímicas disponibles para los investigadores1. Debido a su robusta pared celular, un desafío que enfrentan los investigadores es en la eliminación eficiente de las células sin dañar el contenido celular. Se dispone de diferentes métodos para la obtención de extractos proteicos mediante la interrupción de las células de levadura que incluyen lisis enzimática (zymolyase)2,3, lisis química4, lisis física por congelación-descongelación5, a presión (prensa francesa)6,7, mecánica (perlas de vidrio, molinillo de café)8,9, basado en sonicación10 y criogénico2,11. La eficiencia de la lysis celular y el rendimiento proteico pueden variar considerablemente dependiendo de la técnica empleada, afectando así al resultado final o a la idoneidad para la aplicación posterior deseada para el alsate. Al estudiar proteínas que son inestables, tienen modificaciones posttranslacionales fugaces, o son sensibles a la temperatura, es particularmente importante utilizar un método que minimice la pérdida o degradación de la muestra durante la preparación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Técnica de preparación de extractos</td>
			<td>Detalles</td>
			<td>Ventajas</td>
			<td>Desventajas</td>
			<td>Análisis descendente</td>
			<td>Referencia</td>
		</tr><tr><td>Prensa francesa: Homogeneizador de alta presión (también conocido como Microfluidizer) con pretratamiento enzimático con Zymolyase</td>
			<td>Zymolyase-20T, un homogeneizador de alta presión Microfluidizer. El disruptor consiste en una bomba de alta presión accionada por aire (relación 1:250; presión de aire requerida 0,6-l MPa) y una cámara de interrupción especial con una unidad de contrapresión adicional. Se requiere un tamaño mínimo de muestra de 20 ml para el procesamiento.</td>
			<td>La interrupción total final obtenida con el protocolo combinado se acercó al 100 % con 4 pasadas a una presión de 95 MPa, en comparación con sólo una interrupción del 32 % con 4 pasadas a 95 MPa utilizando sólo homogeneización sin la Zymolyase.</td>
			<td>No es adecuado para aplicaciones a pequeña escala. Las enzimas pueden ser costosas para preparaciones a gran escala.</td>
			<td>Purificación de proteínas</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Batidor de cuentas: Zymolyase células tratadas con dosel con cuentas de vidrio en un instrumento fastprep</td>
			<td>Aproximadamente, se añade un volumen igual de cuentas de vidrio frías, secas y lavadas con ácido de 0,5 mm a un volumen determinado de pellet celular en el tampón de la lysis y las células se interrumpen por agitación manual vigorosa.</td>
			<td>Es particularmente útil cuando se producen extractos de muchos cultivos de levadura pequeñas diferentes para fines de ensayo en lugar de para la purificación de proteínas.</td>
			<td>Durante el procedimiento de perlas de vidrio, las proteínas se tratan duramente causando una espuma extensa que conduce a la desnaturalización de proteínas. La cantidad de rotura celular varía, mientras que la proteólisis, así como la modificación de las proteínas pueden resultar del calentamiento del extracto por encima de 4oC durante la rotura mecánica.</td>
			<td>Principalmente análisis de ADN y ARN, pero también análisis de proteínas mediante la desnaturalización de gel electropheoresis, ya sea con o sin hinchazón occidental.</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Tratamiento con zymolyase seguido de lelisis mediante una combinación de shock osmótico y homogeneización de Dounce</td>
			<td>Después de la digestión enzimática de las paredes celulares, los esferoplastos se liszan con 15 a 20 golpes de un pestillo ajustado (despeje de 1 a 3 m) en un homogeneizador dounce.</td>
			<td>Ventajoso para usar cepas deficientes en proteasa como BJ926 o EJ101. Esta es la forma más suave de romper las células de levadura y por lo tanto es más adecuado para la preparación de extractos que pueden llevar a cabo funciones enzimáticas complejas (por ejemplo, traducción, transcripción, replicación del ADN) y en las que se debe mantener la integridad de las estructuras macromoleculares (por ejemplo, ribosomas, empalmes). También es útil para aislar núcleos intactos que se pueden utilizar para estudios de cromatina (Bloom y Carbon, 1982) o para extractos de proteínas nucleares (Lue y Kornberg, 1987).</td>
			<td>Las principales desventajas del procedimiento de lysis esferoplastia son que es relativamente tedioso y caro, especialmente para preparaciones a gran escala (>10 litros), y los largos períodos de incubación pueden conducir a la proteólisis o modificación de proteínas.  Para las preparaciones de cromatina, parecen ser de diferente o menor calidad que las producidas por la centrifugación diferencial (basada en la integridad de la escalera nucleosoma).</td>
			<td>Aislamiento de núcleos intactos para estudios de cromatina, extractos que pueden llevar a cabo funciones enzimáticas complejas, extractos que requieren la integridad de macromoleculares, extractos de proteínas nucleares.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Interrupción celular de las células congeladas parpadeantes mediante la molienda de nitrógeno líquido utilizando un mortero/pestle o una licuadora</td>
			<td>Las células se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido y luego se aleban moliendo manualmente en un mortero usando un pestillo, o usando una licuadora Waring en presencia de nitrógeno líquido.</td>
			<td>El protocolo es rápido y fácil. Puede acomodar diferentes cantidades de células de levadura incluyendo cultivos muy grandes. Su principal ventaja es que las células se toman inmediatamente del estado de crecimiento activo en nitrógeno líquido (-196 oC), disminuyendo las actividades enzimáticas degradativas como proteasas y nucleasas, así como actividades que modifican proteínas (por ejemplo, fosfatasas y quinasas). Es especialmente adecuado para la fabricación de extractos de células enteras de un solo cultivo de levadura para la purificación de proteínas a gran escala.</td>
			<td>Un poco desordenado y potencialmente peligroso para el investigador descuidado. Las muestras pequeñas (es decir, cultivos de levadura de 10 a 100 ml) no se procesan fácilmente porque no hay suficiente masa de grumos de células congeladas para fracturarse eficazmente en la licuadora. Es lento procesar muestras individuales y limpiar el equipo entre usos.</td>
			<td>Extractos de células enteras de un solo cultivo de levadura para la purificación de proteínas a gran escala.</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Autolisis, Molino de cuentas</td>
			<td>pH 5,0, 50 oC, 24 h, 200 rpm / 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min</td>
			<td>La lelisis rápida y eficiente, especialmente para la preparación de extractos a pequeña escala</td>
			<td>La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas. Se requiere equipo de batido de cuentas.</td>
			<td>Análisis a pequeña escala.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>Autolisis, Sonicación</td>
			<td>pH 5,0, 50 oC, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulsador 80%, potencia 80%</td>
			<td>Los equipos de sonicación suelen estar disponibles en la mayoría de las instituciones.</td>
			<td>La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas. Se requiere equipo de sonicación. La lelisis lenta puede tardar más de 24 horas.</td>
			<td>Preparaciones de la pared celular de levadura.</td>
		</tr><tr><td>Proceso de ebullición y congelación</td>
			<td>No se necesita ningún equipo especializado que no sea un congelador estándar y un bloque de calefacción o baño de agua caliente.</td>
			<td>Eficiente, reproducible, sencillo y barato.</td>
			<td>La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas.</td>
			<td>Análisis de ADN por PCR.</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Comparación de los métodos disponibles para la preparación de extractos de levadura.
La criogrinding (también conocida como molienda criogénica/fresado criogénico) se emplea comúnmente para recuperar ácidos nucleicos, proteínas o productos químicos de muestras sensibles a la temperatura de una manera confiable para análisis cuantitativos o cualitativos. Se ha utilizado con éxito para múltiples aplicaciones en diversos campos incluyendo biotecnología, toxicología, ciencias forenses12,13, ciencia ambiental, biología vegetal14 y ciencia de los alimentos. El aislamiento de macromoléculas biológicas intactas suele depender críticamente de la temperatura. Las temperaturas extremadamente bajas aseguran que las proteasas y nucleasas permanezcan inactivas, lo que resulta en un aislamiento confiable de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas para análisis posteriores. De hecho, un molino de congelador normalmente mantiene una temperatura de la muestra de -196 oC (el punto de ebullición de LN2),minimizando así la desnaturalización y degradación del ADN/ARN o de las proteínas.
El molino congelador emplea una cámara de molienda electromagnética que mueve rápidamente una barra de metal sólido o cilindro de ida y vuelta dentro de un vial que contiene la muestra para pulverizar entre tapones de acero inoxidable. El instrumento crea y invierte rápidamente un campo magnético dentro de la cámara de molienda. A medida que el campo magnético se desplaza hacia adelante y hacia atrás, el imán aplasta la muestra contra los enchufes logrando así el "criogrinding" y la pulverización de las palomitas de maíz. El molino congelador reemplaza el mortero y el pestillo y permite el procesamiento secuencial de múltiples muestras (o hasta 4 muestras más pequeñas simultáneamente) con alta reproducibilidad y evita la variabilidad de usuario a usuario asociada con la molienda manual. Una vez procesadas las muestras, los extractos de celdas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores.

<table><tbody><tr><td>Tubos de policarbonato de 50 mL con tapones de rosca</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptona</td><td>BD Biosiences 211677</td><td></td><td>Levadura YPD componente de medios</td></tr><tr><td>BD Bacto Extracto de levadura</td><td>BD Biosiences</td><td>212750</td><td>Levadura YPD componente de medios</td></tr><tr><td>Beckman Centrífuga Avanti</td><td>Beckman</td><td>B38624</td><td>Centrífuga de alta velocidad</td></tr><tr><td>Beckman JLA-9.1000</td><td>Beckman</td><td>366754</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>D-(+)-Dextrosa Anhidro</td><td>MP Biomedicals</td><td>901521</td><td>Levadura YPD componente de medios</td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-44</td><td>Eppendorf</td><td>22637461</td><td>Rotor de cangilón oscilante</td></tr><tr><td>Eppendorf centrífuga refrigerada 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Centrífuga refrigerada</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5150-1GA</td><td>Excluidor de volumen y crioprotector</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FisherBiotech</td><td>BP310-100</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>Anticuerpo HIS6</td><td>Novagen</td><td>70796</td><td>Anticuerpo para HIS tag</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-1KG</td><td>Sal para mantener la fuerza iónica</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>CALBIOCHEM</td><td>474790</td><td>Inhibidor del proteasoma</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la fosfatasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32957</td><td>Cóctel de inhibidores de la fosfatasa</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>P7170-1L</td><td>Tinción de proteínas</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32963</td><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td></tr><tr><td>Rotor JLA 25.500</td><td>Beckman</td><td>JLA 25.500</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Butirato de sodio</td><td>EM Science</td><td>BX2165-1</td><td>Inhibidor de la histona desacetilasa</td></tr><tr><td>fluoruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6521</td><td>Inhibidor de la fosfatasa</td></tr><tr><td>Vanadato de sodio</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Inhibidor de la fosfatasa</td></tr><tr><td>Alfa</td><td>Aesar</td><td>13408-09-8</td><td>Inhibidor de la fosfatasa</td></tr><tr><td>Spex Certiprep 6850 molino de congelación</td><td>SPEX Sample Prep</td><td>6850</td><td>Molino de congelación</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resina</td><td>BD Biosiences</td><td>635502</td><td>Para la extracción de proteínas marcadas con HIS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR International</td><td>VW1521-07</td><td>Detergente no iónico</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>AMRESCO</td><td>M131-250ML</td><td>Agente reductor</td></tr></tbody></table>

preparación de extractos celulares mediante criogrinding en un molino congelador automatizado

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

La facilidad de manipulación genética y la fuerte conservación evolutiva de la maquinaria celular eucariota en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae la ha convertido en un organismo modelo genético preeminente. Sin embargo, dado que el aislamiento eficiente de las proteínas depende de una interrupción óptima de las células, el uso de levadura para el análisis bioquímico de las proteínas celulares se ve obstaculizado por su pared celular, que es costosa de digerir enzimáticamente (usando lyticase o zymolyase), y difícil de interrumpir mecánicamente (usando un batidor de cuentas tradicional, una prensa francesa o una trituradora de café) sin causar calentamiento de muestras, lo que a su vez causa denatura y degradación de proteínas. Aunque la molienda manual de células de levadura bajo nitrógeno líquido (LN2) utilizando un mortero y un peste evita el sobrecalentamiento de las muestras, es intensiva en mano de obra y está sujeta a variabilidad en la lisis celular entre los operadores. Durante muchos años, hemos estado preparando con éxito extractos de levadura de alta calidad utilizando criogrinding de células en un molino congelador automatizado. La temperatura de -196 oC alcanzada con el uso de LN2 protege el material biológico de la degradación por proteasas y nucleasas, permitiendo la recuperación de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas. Aquí describimos esta técnica en detalle para las células de levadura en ciernes que implica primero congelar una suspensión de células en un tampón de lisis a través de su adición por gotas en LN2 para generar gotas congeladas de células conocidas como "palomitas de maíz". Estas palomitas de maíz se pulverizan bajo LN2 en un molino congelador para generar un extracto congelado "en polvo" que se descongela lentamente y se clarifica por centrifugación para eliminar los desechos insolubles. Los extractos resultantes están listos para aplicaciones posteriores, como purificación de proteínas o ácidos nucleicos, análisis proteómicos o estudios de inmunoprocipitación. Esta técnica es ampliamente aplicable para la preparación de extractos celulares de una variedad de microorganismos, tejidos vegetales y animales, especímenes marinos incluyendo corales, así como el aislamiento de ADN / ARN de especímenes fósiles forenses y permafrost.

Comparamos dos métodos diferentes para la lelisis de células de levadura, a saber, el fresado de cuentas de vidrio a 4 oC y un método automatizado de criogrinding a -196 oC, para evaluar las proteínas de recuperación relativa en los extractos celulares preparados con ambos métodos. Para este estudio, elegimos usar una cepa de levadura en ciernes YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-200 trp1-1[am] ubi1-1::TRP1 ubi-2::ura3 1ubi3-Uub-2 ubi4-2::LEU2 [pUB39] [pUB221])<sup class="x...

Describimos un método confiable para la preparación de extractos de células enteras a partir de levadura u otras células utilizando un molino congelador criogénico que minimiza la degradación y desnaturalización de proteínas. Los extractos celulares son adecuados para la purificación de complejos proteómicos funcionales, análisis proteómicos, estudios de inmunoprocipitación y detección de modificaciones de proteínas lábiles.

Preparación de extractos celulares mediante criogrinding en un molino congelador automatizado

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

La levadura es un organismo modelo popular, no sólo para estudios genéticos, sino también para estudios bioquímicos de proteínas y otras macromoléculas extraídas de cepas de tipo salvaje y de levadura mutante. Sin embargo, debido a sus paredes celulares resistentes, un desafío importante que los investigadores enfrentan es esta lysis eficiente de las células de levadura sin dañar el contenido celular. El aislamiento de macromoléculas biológicas intactas suele ser crítico, dependiendo de la temperatura.La preparación de los extractos a baja temperatura garantiza que las proteasas y nucleasas intracelulares permanezcan inactivas, lo que resulta en un aislamiento confiable de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas para una lelisis suficiente. Varios métodos están disponibles para la obtención de extractos de levadura a través de la lysis enzimática, química y física. Sin embargo, la lysis enzimática es costosa debido a la necesidad de enzimas purificadas para digerir la pared celular, limitando así el uso de un menor número de células.Además, las reacciones enzimáticas deben ser monitoreadas de cerca para prevenir la sobre digestión y la lysis prematura de las células. Los métodos químicos que utilizan agentes desnaturalizantes fuertes, aunque son eficaces, dan como resultado la desnaturalización de las proteínas y, como tales, no son adecuados para el aislamiento de complejos proteicos o enzimas funcionales. Los métodos físicos, como la lisis bajo alta presión en una prensa francesa, se pueden llevar a cabo en el frío a los cuatro grados centígrados, pero eso no es lo suficientemente frío como para evitar la degradación y la desnaturalización de todas las proteínas nativas.Otros métodos físicos populares son el uso de un mortero y un mortero, licuadora o molinillo de café para moler las células de levadura resuspendidas en un tampón de lisis y congeladas como gotas o molienda y mezcla de cuentas de vidrio y levadura en un molino de batidor de cuentas de preparación rápida o una lisis por sonicación. Sin embargo, la molienda manual es intensiva en mano de obra y el rendimiento proteico resultante puede variar considerablemente dependiendo de las técnicas empleadas mientras que la lisis por sonicación o molienda en una licuadora, molinillo de café o molino de batidor de cuentas genera una cantidad sustancial de calor, lo que resulta en una desnaturalización y degradación de proteínas. Por lo tanto, para obtener lisis de células de levadura con proteínas en su estado nativo con una desnaturalización y degradación mínimas para aplicaciones como purificaciones de complejos proteicos funcionales, ensayos bioquímicos o detección de modificaciones post-traduccionales fugaces, es esencial utilizar un método de lisis fácilmente escalable que minimice la generación de calor al tiempo que permita una lisis eficiente independientemente de la cantidad de células.Aquí describimos un método que implica el uso de un molino criogelante para la lisis de las células en nitrógeno líquido a menos 196 Celsius para generar extractos de células congeladas permitiendo así la recuperación de macromoléculas funcionales intactas, como proteínas o ADN y ARN, a temperaturas muy bajas que minimizan la desnaturalización y la degradación. Este método se puede adaptar fácilmente para su uso con cualquier tipo de muestra de célula o tejido de cualquier especie, incluyendo muestras forenses e incluso antiguas recuperadas de sitios arqueológicos o encontradas congeladas en permafrost. El molino congelador utiliza una cámara de molienda electromagnética superconductora que mueve rápidamente una barra de metal sólido hacia adelante y hacia atrás dentro de un archivo de policarbonato que contiene la muestra para pulverizar entre tapones de acero inoxidable.Este método de lysis celular física permite una lysis más eficiente y resultados reproduciblemente en un extracto de mejor calidad. Las células de levadura se cultivaron a una concentración de 10 millones de células por mil. Estas células de levadura se colocaron en botella de centrífuga prefrinada y se hilaron durante 10 minutos a 2, 400 G.Una vez que el giro está completo, decantar el sobrenadante sin perturbar las células peletadas.Este pellet fue resuspendido en una pequeña cantidad de agua helada, aproximadamente la mitad del volumen inicial del cultivo para lavar las células. Las células resuspendidas se giraron de nuevo durante otros 10 minutos a 2.400 G.Una vez que el siguiente giro está completo, nosotros, de nuevo, decantamos todo el sobrenadante sin alterar el pellet. Este pellet será resuspended y 15 ML de tampón de lyis helada.Asegúrese de que el pellet esté completamente resuspendido. Las células resuspendidas deben permanecer sobre hielo en un tubo pre-marcado hasta que estén listas para el siguiente paso. Use siempre equipo de protección personal cuando manipule nitrógeno líquido, como gafas de seguridad, protección de manos y abrigos de laboratorio.Para maximizar nuestra destreza, a menudo usamos un par de guantes térmicos blancos emparedados entre dos pares de guantes de nitrilo. Cambie los guantes exteriores y de nitrilo con frecuencia, ya que se rasgan fácilmente después de ser expuestos a nitrógeno líquido. En nuestro laboratorio, transferimos una alícuota de nitrógeno líquido a un pequeño contenedor de nitrógeno líquido de cinco litros.El nitrógeno líquido se vierte en un tubo de 50 ML que se ha enfriado previamente sobre hielo seco. Una vez que el tubo de 50 ML está lleno de nitrógeno líquido, agregamos el extracto de levadura lentamente, de una manera prudente gota al tubo en incrementos de 1,5 mililitros. Para minimizar la formación de grandes pellets de palomitas de maíz, la suspensión de levadura se añade en un movimiento circular.Para evitar aún más la formación de grandes pellets de palomitas de maíz, utilizamos grandes fórceps para asegurar que todos los pellets estén entre 0,3 y 0,5 centímetros de diámetro. Debido a que el nitrógeno líquido siempre se evapora, asegúrese de rellenar el tubo con nitrógeno líquido antes de agregar cada 1,5 mil alícuota de suspensión de levadura. Una vez que toda la suspensión de levadura se ha convertido en palomitas de maíz permitir que el tubo con palomitas de maíz se siente sin la tapa durante dos a tres minutos para dejar que todo el nitrógeno líquido residual se evapore.Para estar seguro de que todo el nitrógeno líquido se ha evaporado, cierre la tapa casi por completo y agite suavemente. Si hay un silbido, indica que el nitrógeno líquido aún no se ha evaporado por completo. Abra la tapa durante un minuto más o menos para permitir que el nitrógeno líquido restante se evapore antes de cerrar la tapa firmemente.El líquido residual en el tubo puede causar una explosión si la tapa se cierra prematuramente. Estas palomitas de maíz de levadura se pueden almacenar casi indefinidamente en menos 80 grados C.Para al menos cinco muestras, asegúrese de que tiene 30 a 35 litros de nitrógeno líquido disponibles. Llene el molino del congelador a la línea completa y cierre la tapa para permitir que el molino del congelador se precalfie durante unos minutos.Una vez más, recuerde siempre usar equipo de protección personal cuando se trate con nitrógeno líquido. Los viales de molienda de policarbonato, los tapones de extremo de acero inoxidable y la barra del impactador deben enfriarse previamente con nitrógeno líquido. Mantenga estos componentes sumergidos hasta que el nitrógeno líquido deje de burbujear.Recuerde mantener todas las muestras de palomitas de maíz en hielo seco hasta que se complete todo el proceso de molienda. Extraiga todo el nitrógeno líquido de los viales de molienda y transfiera sus palomitas de maíz al vial. No olvide colocar una barra de impactador magnético en el vial de molienda también.Selle el vial de molienda colocando cuidadosamente el tapón de acero inoxidable uniformemente en el extremo del vial de molienda. Golpeamos cada extremo del vial de molienda en una placa de pan de madera con un respaldo de goma absorbente de vibraciones para asegurar que los tapones finales se colocan correctamente y están sellando los viales de molienda firmemente. Es importante asegurar los tapones finales para asegurarse de que no se sueltan y permitir que las muestras se derramen en el molino del congelador durante el proceso de molienda.Coloque un vial de molienda en la cámara de molienda del molino congelador y fije en su lugar. Cierre la tapa del molino del congelador y muele la muestra durante tres ciclos a dos minutos por ciclo, a una velocidad de trituración de 14. Después de que los ciclos de molienda se completen desbloquear el vial con el lysate de la célula de polvo congelado.Para evitar que el izado se descongele, trabaje rápida y cuidadosamente para desenroscar uno de los tapones finales con la herramienta de apertura. Una vez abierto el vial, retire la barra del impactador y transfiera rápidamente el extracto de polvo congelado en un plato de pesaje de plástico precalado. Recuperar la mayor parte del extracto congelado como sea posible golpeando el vial en la placa de madera.Una vez que todo el polvo se retira del vial, transfiera rápidamente todos los extractos de polvo a un tubo preetiquetado de 15 mil mantenido en hielo seco. Aunque lo mejor es proceder con la descongelación y el uso de los extractos de inmediato para minimizar la degradación de la proteína, el lysate en polvo congelado se puede almacenar durante la noche en menos 80, si es necesario. Descongelar el polvo se desenfría lentamente en una suspensión de hielo que circula continuamente utilizando una barra de agitación magnética en un cubo de hielo.Para facilitar incluso el descongelación, retire el hielo que se desarrolla en el exterior de los tubos con frecuencia, aproximadamente cada cinco minutos más o menos. Una vez que los extractos comienzan a descongelarse en un cóctel inhibidor de la proteasa 1X y 10 inhibidores del proteasoma micromolar MG132 para prevenir la degradación de las proteínas. Una vez que las muestras están completamente descongeladas, lo que puede tardar más de una hora, gire las muestras a 3, 220 G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.Este giro eliminará la mayoría de los desechos celulares del izado. Cuando el giro esté completo transfiera el sobrenadante a botellas de policarbonato que se hayan precalentado sobre hielo y deseche el pellet. Centrifugar el supernnato y las muestras a 16.000 G en cuatro grados Celsius durante 20 minutos para aclarar el extracto.Una vez completado el giro, recupere sólo el sobrenadante transparente cuidadosamente desde el centro de la columna líquida sin alterar la capa turbia que contiene la pieza en la parte superior o los desechos peletados en la parte inferior del tubo centrífugo. Transfiera el izado transparente en un tubo de 15 Mil precalinado. El líquido nublado restante se puede actualizar durante cinco minutos a la misma velocidad para permitir la recuperación de algunos más del lysate al por mayor.Los extractos ya están listos para su uso en experimentos, como la purificación de complejos proteicos y la inmunoprecipitación. Comparamos dos métodos diferentes de lysis de células de levadura, a saber, el fresado de cuentas de vidrio a cuatro grados Celsius y un método automatizado de molienda criogénica en menos 196 Celsius para evaluar las proteínas recuperadas relativas y los extractos celulares preparados con ambos métodos. A partir de este estudio elegimos utilizar una cepa de levadura en ciernes que lleva un plásmido de copia alta que expresa un tándem HIS-MYC etiquetado ubiquitina.Así que podemos evaluar la afinidad de la recuperación de proteínas poliubiquitinadas etiquetadas a partir de extractos al por mayor, después de la purificación de afinidad utilizando cuentas de afinidad de etiqueta TALON cobalto HIS seguidas de hinchazón occidental con un anticuerpo monoclonal HIS tag. Proteínas poliubiquitinas que normalmente son muy efímeras debido a su rápida degradación por la maquinaria proteosoma de ubiquitina y por lo tanto ofrecen una muy buena manera de comparar la calidad de los extractos al por mayor preparados por diferentes métodos. Como vemos en la mitad derecha de la membrana teñida de Ponceau, recuperamos un mayor rendimiento total de proteínas en los extractos al por mayor preparados por el protocolo de molino crioelédizar como se juzgó por la tinción más intensiva de Ponceau en todo el carril de extracto al por mayor.Esto es especialmente claro en las partes inferior y superior del molino congelador carriles enteros de extractos. Además, como se muestra en la mitad derecha de la etiqueta HIS Western blot, observamos una mejor recuperación de la proteína ubiquitinada de la etiqueta HIS-MYC seguida de tirar hacia abajo usando cuentas de Talon de los extractos al por mayor preparados por la molienda criogénica. Concluimos que el molino congelador criogénico es superior a otros métodos para la preparación de extractos celulares, especialmente cuando se requieren macromoléculas funcionales para la aplicación posterior.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se ilustra aquí el uso de electrones cryotomography (TEC) para estudiar la ultraestructura de las células bacterianas en casi nativo estados, a "macromoleculares" (~ 4 nm) de resolución.

Electron Cryotomography de las células bacterianas

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Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

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Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno

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El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

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Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

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Preparación de laminillas a partir de muestras biológicas vítreas utilizando un microscopio electrónico de barrido de doble haz para la criotomografía electrónica

Este manuscrito describe el método de blot-and-plunge para congelar manualmente especímenes biológicos para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula.

Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

Aquí, presentamos una línea para el fresado de haces de iones enfocados correlativos en 3D para guiar la preparación de muestras celulares para la tomografía crioelectrónica. La posición 3D de las proteínas de interés marcadas con fluorescencia se determina primero mediante criofluorescencia y luego se dirige a la molienda. El protocolo es adecuado para células de mamíferos, levaduras y bacterias.

Preparación de muestras mediante fresado por haz de iones focalizado correlativo en 3D para tomografía crioelectrónica de alta resolución

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Preparación de muestras para criotomografía in situ de células de mamíferos

Aprende a preparar extractos celulares de levadura mediante criomolienda automatizada a -196°C. Este método preserva la integridad de proteínas y macromoléculas funcionales para estudios bioquímicos y purificación de complejos proteicos.

Preparación de extractos celulares mediante criogrinding en un molino congelador automatizado

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