Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

El aislamiento rápido de los tejidos del SNC, incluidas las meninges, permite un análisis exhaustivo del fenotipo, la función y la localización de las células inmunitarias en condiciones homeostáticas y patógenas. Los dos métodos demostrados permiten la extracción rápida de los tejidos del SNC con las meninges, lo que resulta ideal para el análisis posterior mediante técnicas unicelulares y métodos histológicos. Aunque los resultados representativos se centran en el análisis de las células inmunitarias, estos dos métodos pueden utilizarse para analizar las células residentes del SNC, como la microglía, los astrocitos, los pericitos, las células endoteliales, las células estromales y las neuronas.

Comience por aislar muestras de cerebro y médula espinal de ratones sacrificados. Después de extirpar la cabeza, haga una incisión en la línea media de la piel y gírela sobre los ojos para liberar el cráneo. Cortar el hueso nasal para liberar la mandíbula del cráneo.

Luego retire la mandíbula, la lengua y los ojos. Corta a lo largo de los aspectos laterales del cráneo para liberar el tejido a lo largo del meato auditivo externo y recortarlo. Para recolectar la muestra de médula espinal, separe la caja torácica de la columna vertebral cortando paralelamente a la columna vertebral con tijeras afiladas.

Haga un pequeño corte en la región lumbar inferior para aislar la columna vertebral, luego recorte y retire cualquier músculo restante a lo largo de la columna para exponer las vértebras. Al realizar la descalcificación, revise el hueso diariamente para determinar si está blando y flexible. Extraiga el tejido de la solución de EDTA con pinzas, colóquelo en una placa de Petri y pruebe suavemente la suavidad del hueso con una aguja de calibre 25.

Si la aguja penetra fácilmente en el hueso, el proceso de descalcificación está completo. Para extraer la capa craneal en el cerebro, haga una incisión en la línea media de la piel y voltee la piel sobre los ojos. Coloque las tijeras dentro del foramen magna y comience a cortar el cráneo lateralmente a lo largo de las cortezas hacia el bulbo olfatorio, manteniendo las incisiones por encima del meato auditivo externo y la mandíbula.

Realice los mismos cortes en el lado opuesto con cortes que se unen en el bulbo olfatorio para liberar la tapa del cráneo del cerebro. Con pinzas, retire el casquete craneal y colóquelo en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medio RPMI frío suplementado con 25 milimolares HEPES. Coloque pinzas curvas debajo de la base del cerebro y levántelas para liberar el cerebro de la capa craneal.

Extraiga la columna vertebral de las vértebras y el tejido de la médula espinal cortando en paralelo a la columna vertebral para separar la caja torácica de la columna vertebral. A continuación, haz un pequeño corte en la región lumbar inferior para aislar la columna de vértebras. Recorta y retira cualquier músculo restante a lo largo de la columna vertebral para exponer las vértebras.

A continuación, coloque las tijeras quirúrgicas extrafinas dentro de la columna vertebral y corte a lo largo del borde lateral de la columna. Corta completamente el borde lateral opuesto para dividir la columna vertebral en una porción anterior y otra posterior. Use pinzas para despegar la médula espinal lenta y cuidadosamente de la columna vertebral y colóquela en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de RPMI frío con HEPES de 25 milimolares.

Luego, transfiera las porciones anterior y posterior de la columna vertebral a otro tubo. Para quitar las meninges de la tapa del cráneo, saque la tapa del cráneo del medio RPMI y use pinzas afiladas para marcar alrededor del borde exterior. Pele las meninges del borde de la tapa del cráneo, raspando para eliminar las meninges durales y aracnoideas y colóquelas en una placa de Petri.

Para extirpar las meninges de la columna vertebral, saque la columna de la media y marque alrededor de los bordes de la columna vertebral con pinzas afiladas para liberar las meninges. Use pinzas curvas para despegar las meninges del borde de las vértebras y colóquelas en una placa de Petri. Coloque un colador de malla de nailon en un tubo cónico de 50 mililitros.

Para crear una suspensión celular, mueva las meninges a un colador y agregue tres mililitros de RPMI suplementado con HEPES, luego use un émbolo de una jeringa de cinco mililitros para moler el tejido y los medios a través del colador. Vierta el tejido del cerebro o la médula espinal con el medio en una placa de Petri de 100 milímetros y use pinzas para mover el tejido al fondo. Pica el tejido cerebral con una cuchilla de afeitar estéril y junta el tejido en el fondo del plato.

Agregue tres mililitros de RPMI suplementado con 10% de FCS a la placa de Petri, luego use una pipeta serológica de 10 mililitros para resuspender el tejido en el medio y transferirlo a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue colagenasa tipo 1 y DNasa 1 al tejido e incube los tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Invierta los tubos cada 15 minutos para mezclar bien el tejido con las enzimas.

Después de la incubación, agregue EDTA a cada tubo para obtener una concentración final de 0,01 molar e incube los tubos durante cinco minutos adicionales para inactivar la colagenasa. Agregue nueve mililitros de RPMI suplementado con 10% de FCS a cada tubo, luego centrifugue los tubos a 450 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Utilice una pipeta Pasteur con vacío para aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tocar el pellet de la célula.

Agregue tres mililitros de solución de gradiente de densidad isotónica 100% de stock al pellet de celda, luego agregue medios RPMI 10%FCS adicionales para llevar el volumen final a 10 mililitros y resuspender el pellet de celda. Invierta y mezcle bien el tubo, luego inserte una pipeta serológica con un mililitro de solución de gradiente de densidad isotónica al 70% en el fondo del tubo. Coloque lentamente la solución en la base, teniendo cuidado de no hacer burbujas.

Retire la pipeta serológica del tubo, asegurándose de no alterar el gradiente. Centrifugar el tubo a 800 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, luego aspirar el sobrenadante, incluida la capa de residuos de mielina, hasta que queden dos o tres mililitros en el tubo. Utilice una pipeta de un mililitro para recolectar la capa celular entre el gradiente de densidad del 30% y el 70% y transfiérala a un nuevo tubo de 15 mililitros.

Agregue el medio RPMI 10%FCS para llevar el volumen final a 15 mililitros, luego centrifugue las celdas a 450 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Este protocolo se utilizó para evaluar las células B y T en las meninges, el cerebro y la médula espinal durante la esclerosis múltiple progresiva. La activación se llevó a cabo para distinguir las células inmunitarias infiltrantes de derivación periférica CD45 alta de la microglía baja CD45 y las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos negativos.

Pocas células altas de CD45 estaban presentes en la médula espinal y el tejido cerebral de los ratones tratados simuladamente. El mismo punto de corte de compuerta para la alta expresión de CD45 se utilizó en las meninges para identificar las células inmunitarias altas de CD45 y excluir las células no inmunitarias. En todos los tejidos del SNC TMEV-IDD, se observó un aumento de los porcentajes de células inmunitarias CD45 altas en comparación con los ratones tratados de forma simulada.

Durante la TMEV-IDD crónica, el porcentaje de células B entre las células inmunitarias altas CD45 en el cerebro y la médula espinal fue mayor en comparación con el compartimento meníngeo. Se tomaron imágenes de cerebros y médula espinal descalcificados para identificar la localización de las células B y T dentro del compartimento del SNC. La extracción convencional del cerebro del casquete craneal dio como resultado una capa de pia intacta, pero se excluyeron las capas meníngeas restantes.

Tanto en el cerebro descalcificado como en la médula espinal, todas las capas meníngeas estaban intactas. Los linfocitos B y los linfocitos T conmutados por isotipo se localizaron con expresión de IgG y CD3, respectivamente. La cotinción de IgG con ER-TR7 reveló que las células B estaban presentes en el parénquima del SNC y las meninges, mientras que los agregados celulares dentro de las meninges positivas para ER-TR7 contenían múltiples células B positivas para IgG y células T CD3 positivas.

Un paso crítico en estos protocolos es la extracción cuidadosa de los tejidos del SNC, esencial para mejorar la pureza de las suspensiones unicelulares y para obtener tejido histológico con morfología de alta calidad. Las técnicas descritas permiten el análisis exhaustivo de las células que ocupan el compartimento del SNC, ideal para examinar el fenotipo, la función y la localización de las células bajo homeostasis y durante la patogénesis de la enfermedad.