Name: Evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprende a medir la síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans mediante FRAP no radioactivo. Este método permite monitorear tasas de síntesis en tiempo real y aplicar cribados genéticos y farmacológicos.

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Agradecemos a Chaniotakis M. y Kounakis K. por la grabación y edición de vídeo. K.P. está financiado por una subvención de la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (HFRI) y la Secretaría General de Investigación y Tecnología (GSRT). N.T. está financiado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC – GA695190 – MANNA), los Programas Marco de la Comisión Europea y el Ministerio de Educación de Grecia.

NOTA: Tanto las fusiones transcripcionales como las traslacionales a fluoróforos se pueden utilizar para evaluar la traducción de proteínas de novo en varios tejidos. Las tasas de síntesis de proteínas se pueden evaluar para múltiples familias de proteínas que se localizan en diferentes compartimentos celulares, incluyendo citoplasma, mitocondrias y núcleo7. Las siguientes cepas se utilizan para monitorear las tasas de síntesis de proteínas globales y neuronales, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Mantenimiento, sincronización y preparación de nematodos transgénicos para el seguimiento de la síntesis de proteínas de novo
<ol><li>Utilice un estereomicroscopio diseccionado para evaluar las etapas del desarrollo y el crecimiento de los nematodos transgénicos de tipo salvaje (wt) y mutantes.</li>
	<li>Día 1: Utilice una selección de gusano para seleccionar y transferir 10 larvas L4 de animales transgénicos wt y mutantes que llevan al reportero fluorescente deseado a placas de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con Escherichia coli (OP50) (Tabla 1).<ol>
<li>Haga una elección de gusano colocando un alambre de platino en el extremo cónico de una pipeta Pasteur de vidrio fundiendo el vidrio en el sitio de contacto en un quemador Bunsen. A continuación, aplanar el extremo del alambre de platino en forma de espátula utilizando cualquier herramienta (por ejemplo, pinza o martillo ligero).</li>
		<li>Inocular una sola colonia de bacterias E. coli (OP50) en un matraz que contenga 50 ml de medio líquido luria-Bertani (LB) y crecer durante 10 horas a 37 oC en una incubadora de temblores (200 rpm; Tabla 1). A continuación, sembrar placas NGM con 200 l de cultivo bacteriano. Incubar las placas de semillas a temperatura ambiente durante la noche para permitir el crecimiento del césped bacteriano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar y cultivar los nematodos a la temperatura estándar de 20 oC.</li>
	<li>Día 5: Las placas contienen una población mixta de gusanos transgénicos. Seleccione y transfiera 15 larvas L4 de cada cepa en placas OP50-NGM recién sembradas.</li>
	<li>Día 6: Realice el ensayo FRAP y monitoree la tasa de síntesis de proteínas el día 1 de la edad adulta.</li>
	<li>Preparar y utilizar cicloheximida que contenga placas NGM como control positivo: NOTA: Preparar una solución en stock de cicloheximida diluyendo en agua a una concentración de 10 mg/ml. Mantener la solución de stock a 4oC.<ol>
<li>Matar las bacterias exponiendo las placas NGM descongeladas durante 15 minutos con luz UV (222 s/cm de intensidad2).</li>
		<li>Añadir cicloheximida encima de placas de semillas bacterianas a 500 g/ml de concentración final en el volumen de agar.</li>
		<li>Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
		<li>Transfiera los nematodos transgénicos que expresen psod-3GFP en el vehículo y las placas que contienen cicloheximida.</li>
		<li>Incubar animales durante 2 h a una temperatura estándar de 20oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ensayo FRAP utilizando animales transgénicos que expresan reporteros de tejido somático pife-2GFP y psod-3GFP
NOTA: Monitoree la tasa global de síntesis de proteínas en todo el cuerpo animal. Estos reporteros transcripcionales presentan diferentes niveles de expresión y se expresan omnipresentemente en múltiples tejidos somáticos, incluyendo los músculos del intestino, la faringe y la pared corporal.
<ol><li>Escoja y transfiera animales transgénicos adultos de 1 día a placas NGM individuales sembradas con una caída de 20 l de OP50 en el centro.</li>
	<li>Retire la tapa y coloque cada placa debajo de una lente objetivo 20x de un microscopio de epifluorescencia.</li>
	<li>Enfoque y capture una imagen de referencia antes de fotoblanchar (pre-blanqueo).</li>
	<li>Fotoblecir cada muestra durante 10 minutos. NOTA: Detenga el fotoblanqueo cuando la señal fluorescente se apague a una intensidad de 30 – 50% en relación con la imagen de pre-blanqueo. La intensidad de la luz y la duración del período de blanqueo deben ajustarse en consecuencia para el fluoróforo específico, la etapa animal y la célula o tejido que se está examinando. Debe determinarse experimentalmente la duración adecuada de la irradiación para alcanzar una extensión adecuada de la fotoblancada, ya que para los distintos especímenes debe determinarse experimentalmente.</li>
	<li>Capturar una imagen después de fotoblanco (blanqueador).</li>
	<li>Mantenga a los animales en placas NGM individuales y déjelos recuperarse.</li>
	<li>Imagen y registro de la recuperación de cada reportero fluorescente cada 1 hora durante al menos 6 horas a un estereomicroscopio de fluorescencia.</li>
	<li>Alternativamente, realice una evaluación de recuperación fluorescente utilizando un microscopio de epifluorescencia (por ejemplo, AxioImager Z2).</li>
	<li>Evaluar cuidadosamente la salud animal por animal mediante el seguimiento de su locomoción, sensibilidad al tacto, capacidad reproductiva y supervivencia durante los próximos 3 días. Los nematodos que mostraban signos de daño después de la fotoblancada fueron excluidos de un análisis posterior.</li>
</ol>3. Montaje de las muestras y realizar el ensayo FRAP utilizando nematodos transgénicos que expresen GFP citoplasmático pan neuronal, punc-119GFP
NOTA: Monitoree la síntesis de proteínas pan-neuronales mediante fotoblancarido dirigido en la región de la cabeza, donde se encuentra el anillo nervioso.
<ol><li>Prepare almohadillas de agarosa del 2%.</li>
	<li>Agregue una gota de 10 l de tampón M9 al centro de la almohadilla de agarosa.</li>
	<li>Transfiera 5 nematodos transgénicos que expresen GFP citoplasmático pan-neuronalmente en una gota de tampón M9.</li>
	<li>Use una pestaña para esparcir el líquido. NOTA: Los animales muestran movimientos reducidos en 2 minutos debido a la absorción de M9 en el agar.</li>
	<li>Cambie la posición del nematodo para evitar la superposición mediante el uso de un pico de "pestaña".</li>
	<li>Coloque la muestra bajo una lente objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia. NOTA: No utilice un cubreobjetos.</li>
	<li>Enfoque y capture una imagen de referencia (pre-blanqueo).</li>
	<li>Fotoblecar el área de interés objetivo durante 90 segundos. NOTA: Detenga el fotoblanqueo cuando la señal fluorescente se apague a una intensidad de 30 – 50% en relación con la imagen de pre-blanqueo. La intensidad de la luz y la duración del período de blanqueo deben ajustarse en consecuencia para el fluoróforo específico, la etapa animal y la célula o tejido que se está examinando. Debe determinarse experimentalmente la duración adecuada de la irradiación para alcanzar una extensión adecuada de la fotoblancada, ya que para los distintos especímenes debe determinarse experimentalmente.</li>
	<li>Capturar una imagen después de fotoblanco (blanqueador).</li>
	<li>Agregue una gota de 10 l de tampón M9 en nematodos fotoblanes.</li>
	<li>Dejar que los animales se recuperen durante 5 minutos.</li>
	<li>Utilice el pico "eyelash" o una pipeta para transferir los nematodos a placas NGM individuales sembradas con 20 l de OP50 en el centro.</li>
	<li>Capture una imagen de cada muestra cada 1 hora bajo un estereofonoscopio de epifluorescencia. NOTA: Cuente t-0 para el tiempo de recuperación después de la fotoblancada.</li>
</ol>4. Análisis de datos de la captura de imágenes durante el ensayo FRAP
<ol><li>Analizar las imágenes adquiridas utilizando software (por ejemplo, Fiji).</li>
	<li>Abra imágenes con el software.</li>
	<li>Seleccione el comando Dividir canales a través del menú desplegable Imagen y color. NOTA: Mantenga la imagen del canal verde.</li>
	<li>Utilice la herramienta Selección a mano alzada para establecer manualmente la región fluorescente de interés (por ejemplo, todo el cuerpo, cabeza, intestino).</li>
	<li>Seleccione el comando Medición a través del menú desplegable Analizar para medir la intensidad media de píxeles del área de interés para cada punto de tiempo. NOTA: El porcentaje de recuperación de fluorescencia se calcula utilizando las imágenes de referencia capturadas después de la fotoblancada.</li>
</ol>5. Informe de análisis estadístico
<ol><li>Utilice al menos 20 – 25 nematodos de cada cepa y/o condición. NOTA: Se deben realizar tres réplicas biológicas.</li>
	<li>Realice la prueba t delestudiante (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con P < 0.05 como significativo utilizando software de análisis estadístico.</li>
</ol>

<ol><li>Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4E+function+in+somatic+cells+modulates+ageing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).</li>
<li>Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+as+an+integral+quality+control+mechanism+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing.</a> Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).</li>
<li>Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+absolute+protein+synthesis+rates+reveals+principles+underlying+allocation+of+cellular+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources.</a> Cell. 157 (3), 624-635 (2014).</li>
<li>Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+and+measurement+of+protein+translation+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space.</a> Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growing+Toolbox+for+Protein+Synthesis+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+monitoring+of+protein+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), 4547(2009).</li>
<li>Parker, R., Sheth, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P+bodies+and+the+control+of+mRNA+translation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">P bodies and the control of mRNA translation and degradation.</a> Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).</li>
<li>Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+Proteostasis+by+P+Body-Mediated+Regulation+of+eIF4E+Availability+during+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).</li>
<li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).</li>
<li>Keith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+Proteasome+Dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans+Activates+an+Adaptive+Response+Involving+the+Conserved+SKN-1+and+ELT-2+Transcription+Factors+and+the+Autophagy-Lysosome+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (2), 1005823(2016).</li>
<li>Kumsta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+receptor+p62%2FSQST-1+promotes+proteostasis+and+longevity+in+C.+elegans+by+inducing+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy.</a> Nature Communications. 10 (1), 5648(2019).</li>
<li>Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+aggregation%2C+and+degradation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease.</a> Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses en competencia.

La modulación de síntesis de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Durante el envejecimiento, se perturba la síntesis de proteínas globales y específicas. Estudios recientes revelan el hecho de que el equilibrio de traducción de proteínas controla directamente la senescencia y el envejecimiento no es simplemente un subproducto del proceso de envejecimiento. En particular, los componentes básicos de la maquinaria de traducción, como el factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E), que facilita el taponamiento...

La síntesis y degradación de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Una multitud de enfermedades relacionadas con la edad son instigadas por la producción de proteínasdefectuosas 1,2. Con el fin de medir las tasas globales de traducción de proteínas, existen técnicas bioquímicas como el perfil ribosomal, que implica la secuenciación profunda de fragmentos de ARNm protegidos contra ribosomas para monitorear la expresión, así como la nueva síntesis de proteínas3. Este método, además de ser una lectura indirecta de las tasas de traslación, ya que el aumento de la asociación de ARN a los ribosomas no significa necesariamente un aumento de la traducción, tiene desventajas técnicas, como un alto costo y un requisito de una gran cantidad de material de partida. Por otro lado, los métodos basados en proteómica permiten la cuantificación directa de proteínas mediante perfiles metabólicos de pulso seguidos de análisis de espectrometría de masas4,,5. Sin embargo, se trata de un enfoque semicuantitativo con resolución temporal limitada que no se puede utilizar fácilmente in vivo. Además, el etiquetado de la proteína puede distribuirse de manera desigual en el animal/tejido de interés. Es importante destacar que ambos métodos pueden ocultar variaciones específicas de los tejidos o de las células en las tasas de traducción de proteínas en animales o tejidos enteros, respectivamente.
Caenorhabditis elegans es un organismo modelo fácil de usar que se puede cultivar en grandes cantidades6. Además, su sostenibilidad genética y transparencia permiten obtener imágenes en vivo in vivo. Este protocolo describe la metodología para detectar las tasas de síntesis de proteínas utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Aprovechamos la expresión transgénica de proteínas fluorescentes, ya sea en todo el organismo o en tejidos/células específicos. Los animales transgénicos pueden expresar la GFP utilizando el promotor de un gen, que se expresa ampliamente/globalmente o un promotor específico del tejido para atacar tipos celulares específicos. Esta técnica se puede extender a un promotor específico para examinar las tasas de síntesis de proteínas de una proteína específica.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Biozym</td><td>8,40,004</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de agarosa 2%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio deshidratado (CaCl2?2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>SERVA Electroforesis</td><td>17101.01</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7698</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td>SMZ645</td></tr><tr><td>edc-3(ok1427); Ej[punc-119GFP, pRF4]</td>Laboratorio <td></td> de <td>Tavernarakis</td><td>Mantener animales a 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Imager Z2</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 cepa</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección de fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Lumar V12</td></tr><tr><td>Greiner Placas de Petri (60 x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5237</td><td></td></tr><tr><td>IFE-2(OK306); Ex[pife-2GFP, pRF4]</td>Laboratorio <td></td> de <td>Tavernarakis</td><td>Mantener a los animales a 20 &° </td></tr><tr><td>C software de análisis de imágenes</td><td>Fiji</td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,37,010</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>LB medio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>M9Sulfato de magnesio (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio (75 x 25 x 1 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>10 006 12</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office 2011 Paquete de software Excel</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>N2; Ex[pife-2GFP; pRF4]</td>Laboratorio <td></td> de <td>Tavernarakis</td><td>Mantener animales a 20 &° C</td></tr><tr><td>N2; Ej[psod-3GFP; pRF4]</td>Laboratorio <td></td> de <td>Tavernarakis</td><td>Mantener a los animales a 20 &° C</td></tr><tr><td>N2; Ex[punc-119GFP; pRF4]</td>Laboratorio <td></td> de <td>Tavernarakis</td><td>Mantener animales a 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1.06.586</td><td></td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td><td></td>de agar medio de crecimiento de nematodos (NGM) Solución madre de</tr><tr><td>nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>BD, Bacto</td> 211677 <td></td> Tampón de fosfato Cloruro <td></td></tr><tr><td></td> de sodio (NaCl)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,40,41,000</td><td></td></tr><tr><td>Equipo estándar para la preparación de placas de agar (autoclave, placas de Petri, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipo estándar para el mantenimiento de lombrices (pico de alambre de platino, incubadoras, etc.).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>software de análisis estadístico</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, EE. UU.</td><td></td><td>Paquete de software GraphPad Prism</td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV</td><td>Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pico</td><td></td><td></td><td></td> de gusano</tr></tbody></table>

evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en caenorhabditis elegans

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Mantener un proteomo saludable es esencial para la homeostasis celular y del organismo. La perturbación del equilibrio entre el control traslacional de proteínas y la degradación instiga una multitud de enfermedades relacionadas con la edad. La disminución de los mecanismos de control de calidad de la proteostasis es un sello distintivo del envejecimiento. Los métodos bioquímicos para detectar la síntesis de proteínas de novo siguen siendo limitados, tienen varias desventajas y no se pueden realizar en células vivas o animales. Caenorhabditis elegans, siendo transparente y fácilmente modificado genéticamente, es un excelente modelo para monitorear las tasas de síntesis de proteínas mediante el uso de técnicas de imagen. Aquí, introducimos y describimos un método para medir la síntesis de proteínas de novo in vivo utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Los animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en células o tejidos específicos son irradiados por una poderosa fuente de luz que resulta en fotoblancarse de fluorescencia. A su vez, la evaluación de la recuperación de la fluorescencia significa una nueva síntesis de proteínas en células y/o tejidos de interés. Por lo tanto, la combinación de nematodos transgénicos, intervenciones genéticas y/o farmacológicas junto con imágenes vivas de las tasas de síntesis de proteínas puede arrojar luz sobre los mecanismos que median el colapso de la proteostasis dependiente de la edad.

Utilizando el procedimiento presentado aquí, se utilizaron nematodos transgénicos de tipo salvaje y mutante que expresan los siguientes reporteros somáticos, pife-2GFP, psod-3GFP y punc-119GFP, para evaluar las tasas de síntesis de proteínas de acuerdo con los protocolos respectivos. Particularmente, los gusanos mutantes de tipo salvaje y ife-2 que expresan la GFP citoplasmática a través de sus tejidos somáticos m...

Aquí, introducimos y describimos un método noradioactivo y no invasivo para evaluar la síntesis de proteínas de novo in vivo, utilizando el nematodo Caenorhabditis elegans y la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Este método se puede combinar con pantallas genéticas y/o farmacológicas para identificar nuevos moduladores de la síntesis de proteínas.

Evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

La tasa de síntesis de proteínas se perturba durante la enfermedad y el envejecimiento. La recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo, o FRAP, permite la medición de la tasa de síntesis de proteínas in vivo. Utilizamos gusanos C.elegans transparentes, que expresan GFP, como modelo para monitorear la síntesis de proteínas novedosa después de la fotoblanquida.Proporcionamos directrices prácticas para medir la recuperación de la fluorescencia mediante el uso de gusanos transgénicos, que expresan la GFP bajo diferentes promotores, ya sea ampliamente expresados o en células o tejidos específicos. Además, este método ofrece monitoreo de la velocidad de síntesis de proteínas en tiempo real. Utilice un estereomicroscopio diseccionado para evaluar las etapas del desarrollo y el crecimiento de nematodos transgénicos de tipo salvaje y mutantes.Escoge 10 larvas L4 de animales transgénicos salvajes y mutantes que lleven al reportero fluorescente deseado sobre placas de medios de crecimiento de nematodos sembradas con E.coli. Incubar y cultivar los nematodos a la temperatura estándar de 20 grados centígrados. Cuatro días más tarde, la placa contiene una población mixta de gusanos

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Biología

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

Aquí detallamos protocolos específicamente diseñados para monitorear los defectos morfogénicos que ocurren durante las fases tempranas y tardías de la elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans. En última instancia, estos protocolos están diseñados para identificar los genes que regulan estas fases y caracterizar sus requisitos diferenciales a lo largo del eje antero-posterior del embrión.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

El método presentado aquí pretende explorar la agregación de proteínas durante el envejecimiento normal en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. El protocolo representa una poderosa herramienta para el estudio de los agregados grandes altamente insolubles que se forman con la edad y determinar cómo cambios en proteostasis impactan de agregación de la proteína.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de RNA, DNA y proteínas de la misma muestra, en un esfuerzo por reducir la variación y mejorar la reproducibilidad, facilitar interpretaciones.

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

El deterioro proteostático es un sello distintivo del envejecimiento, que facilita la aparición de enfermedades neurodegenerativas. Esbozamos un protocolo para medir cuantificablemente la proteostasis en dos tejidos diferentes de Caenorhabditis elegans a través de la expresión heteróloga de repeticiones de poliglutamina fusionadas a un reportero fluorescente. Este modelo permite un rápido análisis genético in vivo de la proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

Este método describe un protocolo para la preparación de extractos de proteína de alto rendimiento de caenorhabditis muestras de elegans y co-inmunoprecipitación posterior.

Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans

El siguiente protocolo describe el desarrollo y la optimización de un flujo de trabajo de alto rendimiento para el cultivo de gusanos, imágenes de fluorescencia y procesamiento automatizado de imágenes para cuantificar los agregados de poliglutamina como una evaluación de los cambios en la proteostasis.

Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

Aquí, se presenta un método para el análisis de la cinética de agregación de proteínas en el nematodo Caenorhabditis elegans. Los animales de una población sincronizada por edad se visualizan en diferentes puntos de tiempo, seguidos de un recuento de inclusión semiautomatizado en CellProfiler y se ajustan a un modelo matemático en AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans sirve como un excelente sistema modelo con métodos robustos y de bajo costo para estudiar la duración de la salud, la vida útil y la resistencia al estrés.

Encuesta de métodos de bajo costo para medir la esperanza de vida y la salud en Caenorhabditis elegans

Este protocolo proporciona un procedimiento sencillo y de bajo coste para cuantificar la tasa de letalidad embrionaria en Caenorhabditis elegans. Permite la detección sencilla de anomalías embrionarias en poblaciones sin equipos especializados ni experiencia en recogida de lombrices. El protocolo puede utilizarse para cuantificar los efectos de mutaciones genéticas, caídas genéticas mediadas por interferencia de ARN y dieta.

Cuantificación de la tasa de letalidad embrionaria en Caenorhabditis elegans

Aprende a medir la síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans mediante FRAP no radioactivo. Este método permite monitorear tasas de síntesis en tiempo real y aplicar cribados genéticos y farmacológicos.

Evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans

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