Name: In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a realizar electroporación in utero en el cerebro embrionario de hurón para manipular células progenitoras neuronales in vivo. Este método permite estudiar la expansión y plegamiento de la neocorteza en desarrollo.

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Agradecemos a los Servicios e Instalaciones del Instituto Max Planck de Biología Molecular y Genética por el excelente apoyo brindado, en particular todo el equipo de los Servicios Biomédicos (BMS) para la excelente cría de hurones y J. Peychl y su equipo de la Instalación de Microscopía Ligera. Estamos particularmente agradecidos a Katrin Reppe y Anna Pfeffer del BMS por el apoyo veterinario excepcional y a Lei Xing del grupo Huttner por ayudar con cirugías de hurones.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con la Legislación Alemana de Bienestar Animal después de la aprobación por el Landesdirektion Sachsen (licencias TVV 2/2015 y TVV 21/2017).
1. Preparación para la electroporación del útero
<ol><li>Prepare la mezcla de ADN. En este protocolo se utiliza una concentración final de 1 g/l de pGFP. Disolver EL ADN en PBS y complementar con 0.1% Fast Green para facilitar la visualización. Una vez preparada, mezcle la mezcla de ADN en pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces o tocando los dedos. Conservar a temperatura ambiente hasta su uso. NOTA: En el caso de las coelectrooraciones, la mezcla de ADN está preparada para contener una concentración final de 1 g/L de plásmido que codifica un gen de interés junto con 0,5 g/l de pGFP diluido en PBS.</li>
	<li>Prepare la mesa de cirugía con todas las herramientas e instrumentos necesarios.</li>
	<li>Tire de los capilares de vidrio con el tirador de micropipetas. Ajuste el diámetro de la punta capilar cortando la parte distal del capilar utilizando fórceps como se describió anteriormente41.</li>
</ol>2. Preparación de hurones para la cirugía
<ol><li>Mantenga las jills embarazadas con embriones en ayunas E33 durante al menos 3 horas antes de la cirugía para reducir el riesgo de vómitos.</li>
	<li>Antes de la cirugía esterilizar todas las herramientas mediante autoclaving. Realizar la cirugía en una habitación especialmente asignada en condiciones asépticas para eliminar posibles fuentes de contaminación.</li>
	<li>Coloque la jill embarazada en la caja de narcosis con 4% de isoflurano.</li>
	<li>Cuando se anestesia, coloque el hurón en la mesa de operación con una almohadilla de calor y adjunte la máscara de narcosis con un flujo constante de isoflurano de 2-3% a la nariz. Para garantizar el nivel adecuado de anestesia, compruebe la falta de los siguientes reflejos:<ol>
<li>El reflejo palpebral al tocar la piel periocular</li>
		<li>El reflejo flexor pellizcando la piel entre la2a y3a,o3a y 4a de las dos extremidades posteriores</li>
		<li>Si el reflejo palpebral está ausente y el reflejo flexor se reduce claramente, compruebe si el reflejo del dolor pellizcando un dedo del dedo de cada extremidad posterior. NOTA: Asegúrese de tener un estetoscopio a mano para controlar la frecuencia cardíaca y el ritmo si es necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyectar el hurón por vía subcutánea con analgésico (0,1 ml de metamizol, 50 mg/kg de peso corporal), antibiótico (0,1 ml/kg de peso corporal de 20 mg/kg de amoxicilina + ácido clavulánico) y glucosa (10 ml de solución de glucosa al 5%).</li>
	<li>Coloque una gota de solución de pomada en los ojos para prevenir la deshidratación ocular durante el procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Afeitar el vientre del hurón usando una afeitadora.</li>
	<li>Limpiar la piel con agua y jabón, desinfectar el vientre con un 70% de exfoliación de etanol, desinfectar 2x con yodo y dejar secar.</li>
</ol>3. En electroporación del útero de hurones
<ol><li>Asegúrese de que el área quirúrgica es estéril: coloque herramientas quirúrgicas estériles en tejidos estériles y cambie la capa y los guantes.</li>
	<li>Coloque una cortina quirúrgica estéril en el animal.</li>
	<li>Usando un bisturí, abre quirúrgicamente el vientre en la linea alba con un corte largo de 5 cm de largo.</li>
	<li>Corta la capa muscular usando tijeras.</li>
	<li>Coloque los hisopos de gasa alrededor del sitio de la incisión y mojelos con PBS. Los hisopos de gasa absorberán el PBS adicional que se agregará durante la cirugía. NOTA: Mantenga el calor y el soporte de PBS durante toda la cirugía.</li>
	<li>Exponga el útero de hurón y colóquelo en los hisopos de gasa.</li>
	<li>Cargue un capilar de vidrio con la solución inyectable utilizando una pipeta con una punta de carga larga. Asegúrese de que el volumen de carga esté aproximadamente entre 5 y 20 oL, dependiendo del número de embriones y del número de condiciones experimentales diferentes. El volumen medio inyectado por embrión es de 3-5 l. Fije el capilar de vidrio cargado a un soporte y conecte el otro lado del soporte a un tubo y una boquilla.</li>
	<li>Inspeccione el primer embrión y encuentre la cabeza.</li>
	<li>Coloque la fuente de luz de fibra óptica junto a la cabeza del embrión para facilitar la visualización. NOTA: Las paredes uterinas de hurón son muy oscuras, y es difícil ver a través de ellas a menos que la luz brrille directamente sobre ellas.</li>
	<li>Realizar una sola inyección intraventricular en el ventrículo de uno de los hemisferios cerebrales y mantener el otro hemisferio intacto para servir como un control interno. El ventrículo en sí no es fácilmente distinto por el ojo, por lo que su ubicación se estima en función de la ubicación del iris pigmentado, que es visible. La inyección intraventricular se realiza tomando el soporte unido al capilar del vidrio y penetrando la piel, el cráneo y el tejido cerebral con la punta del capilar del vidrio. NOTA: Asegúrese de no dañar la placenta, que es más oscura que las placentas murinas.<ol>
<li>Cuando la punta del capilar de vidrio esté en el ventrículo, inyecte aproximadamente 3–5 ml de la solución inyectable por la boquilla utilizando la boquilla conectada al soporte capilar de vidrio. Debido a que la solución inyectada contiene 0.1% Fast Green, el ventrículo inyectado ahora se volverá verde oscuro, y será visible como una estructura en forma de riñón.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los electrodos de pinza en el útero por encima de la cabeza del embrión para que el polo positivo se coloque por encima del área que se dirigirá y el polo negativo por debajo del área inyectada.</li>
	<li>Establezca las siguientes condiciones de electroporación en el electroporador: Longitud del pulso a 50 ms; Tensión de pulso á 100 V; Intervalo de pulsos 1 s; Número de pulsos 5. A continuación, pulse el botón"Pulso"del electroporador.</li>
	<li>Arroje rápidamente varias gotas de PBS 1x caliente en el embrión electroporado.</li>
	<li>Repita el procedimiento para todos los embriones. Mantenga el útero constantemente húmedo con PBS caliente. NOTA: Si los primeros embriones que miran hacia la vagina no son fácilmente accesibles, es mejor no electropograrlos.</li>
	<li>Cuando todos los embriones estén electroporados, vuelva a colocar el útero en la cavidad peritoneal.</li>
	<li>Suturar la capa muscular con el peritoneo usando una sutura 4-0.</li>
	<li>Suturar la piel usando el mismo grosor y rociar la herida con spray de aluminio.</li>
	<li>Coloque el animal en una jaula y manténgalo caliente con una fuente de calor. Supervise cuidadosamente al animal hasta que despierte.</li>
</ol>4. Cuidado postoperatorio y alojamiento de animales específicos
<ol><li>Durante 3 días después de la cirugía asegúrese de que los animales se someten a los siguientes cuidados postoperatorios: 20 mg/kg de amoxicilina (antibiótico) 1x al día; 25 mg/kg de metamizol (analgésico) 3 veces al día.</li>
	<li>Asegúrese de que los hurones estén alojados individualmente.</li>
	<li>Asegúrese de que los hurones sean examinados por un veterinario al menos 1 veces al día.</li>
	<li>Asegúrese de que los hurones sean perturbados lo menos posible durante el parto.</li>
	<li>Después de que los cachorros sean destetados o sacrificados, prepare las jills para la histerectomía.</li>
</ol>5. Histerectomía de hurones
NOTA: Se realiza una histerectomía para reducir el número de animales sacrificados de modo que los animales esterilizados puedan ser donados para adopción como mascotas. El procedimiento prequirúrgico para la histerectomía es el mismo que en el paso 2.
<ol><li>Afeitar y esterilizar el vientre del hurón como se describe en los pasos 3.1 y 3.2.</li>
	<li>Abra quirúrgicamente el vientre en la linea alba. Corta la capa muscular. Levante la capa muscular y cobise el intestino con un dedo mientras abre completamente la capa muscular.</li>
	<li>Coloque los hisopos de gasa alrededor del sitio de la incisión y mojelos con PBS estéril. Exponga el útero de hurón y los ovarios y colóquelos en los hisopos de gasa.</li>
	<li>Comienza la histerectomía por un lado ligando la arteria ovarica y la vena ovarica craneal hasta el mesovar. Coloque una abrazadera a cada lado de la ligadura y realice otra ligadura craneal a las abrazaderas. Fije la tercera abrazadera en los extremos de la ligadura para salvarlos. Repita en el otro lado.</li>
	<li>Cortar entre las abrazaderas y separar el cornua uteri del mesentería en ambos lados.</li>
	<li>Ligar la arteria uterina en ambos lados uterinos caudal al ostium uteri. Luego liga la vagina y fijar la ligadura. Fije la abrazadera en los extremos de las ligaduras para salvarlas. Ponga dos abrazaderas craneales a la ligadura. Corte entre las abrazaderas y desensafíe el útero de la vagina. Retire el útero y los ovarios y deséchelos. Raspar la membrana mucosa residual de la colza del útero.</li>
	<li>Separe todas las abrazaderas restantes y acorte los extremos de la ligadura. Asegúrese de controlar el sangrado después de retirar las abrazaderas.</li>
	<li>Suturar la capa muscular y la piel como se describe en los pasos 3.16 y 3.17. Siga el protocolo postoperatorio como en los pasos 3.18 y 4.1–4.3. Mantener a los animales en el centro animal durante al menos 2 semanas con visitas veterinarias regulares. Después de que los animales están completamente recuperados, pueden ser donados para adopción.</li>
</ol>

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<li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146 (1), 18-36 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+progenitor+expansion%2C+self-renewal+and+neurogenesis-a+polarized+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).</li>
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<li>Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+radial+migration+of+neurons+by+long-distance+somal+translocation+in+the+developing+ferret+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En electroporación del útero en hurón es una técnica importante, con ventajas y desventajas con respecto a otros métodos. Hay pasos críticos y limitaciones para este método, así como posibles modificaciones y aplicaciones futuras a tener en cuenta.
Desde el trabajo pionero de Víctor Borrell y sus colegas en la manipulación genética del neocórtex hurones postnatal a través de la electroporación o inyección viral35,42,<sup cla...

El neocórtex es la lámina exterior del cerebrum mamífero y el asiento de las funciones cognitivas superiores1,2,3,4,5. Con el fin de lograr una manipulación genética aguda en el neocórtex de mamíferos in vivo durante el desarrollo embrionario, se han explorado dos métodos diferentes: infección viral6 y electroporación del útero7. Ambos métodos permiten la focalización eficiente de las células neocorticales, pero sufren de algunas limitaciones. La principal ventaja de la electroporación del útero en comparación con la infección viral es la capacidad de lograr la especificidad espacial dentro del neocórtex, que se logra mediante la regulación de la dirección del campo eléctrico.
Dado que la electroporación se demostró por primera vez para facilitar la entrada de ADN en las células in vitro8, se ha aplicado para entregar ADN en varios vertebrados in vivo. En la neurociencia del desarrollo, en la electroporación del útero del neocórtex del ratón se notificó por primera vez en 20019,10. Este método consiste en una inyección de la mezcla de ADN en el ventrículo lateral del cerebro embrionario y posterior aplicación del campo eléctrico utilizando electrodos de pinza, lo que permite la precisión espacial7,,11. En el útero la electroporación se ha aplicado desde entonces para entregar ácidos nucleicos con el fin de manipular la expresión de genes endógenos o ectópicamente añadidos en el neocórtex del ratón. Recientemente se han realizado importantes progresos al aplicar la metodología de edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 a través de la electroporación del útero en el neocórtex del ratón para realizar (1) la alteración del gen en las neuronas postmitóticas12,,13 y las células progenitoras neuronales14y (2) el genoma15 y la edición del epigenoma16.
Muy poco después del primer informe en ratón, en electroporación del útero se aplicó a la rata embrionaria neocórtex17,18. Los no roedores siguieron siendo un desafío hasta que se notificó la primera electroporación del útero de hurones, un pequeño carnívoro, en 201219,,20. Desde entonces, en la electroporación del útero de hurones se ha aplicado para estudiar los mecanismos del desarrollo de neocortex mediante el etiquetado de progenitores neuronales y neuronas20,,21,22,23, manipulando la expresión de genes endógenos, incluyendo el uso de la tecnología CRISPR/Cas924,y mediante la entrega de genes ectópicos21,,22,,25, incluyendo genes específicos para el ser humano26. Además, en la electroporación del útero de hurones se ha utilizado para abordar las características del desarrollo del neocórtex humano en condiciones patológicas27,,28.
En el contexto del desarrollo de neocórtex, las ventajas de usar hurones como organismo modelo en comparación con los ratones se deben al hecho de que los hurones recapitulan mejor una serie de características similares a las humanas. A nivel anatómico, los hurones presentan un patrón característico de plegado cortical, que también está presente en humanos y la mayoría de otros primates, pero está completamente ausente en ratones o ratas4,,29,,30,,31. A nivel histológico, los hurones tienen dos zonas germinales subventriculares distintas, denominadas zonas subventriculares internas y externas (ISVZ y OSVZ, respectivamente)32,33, separadas por la capa de fibra interna23. Estas características también se comparten con los primates, incluyendo los seres humanos, pero no con los ratones34. La ISVZ y la OSVZ en hurones y humanos están pobladas con abundantes células progenitoras neuronales, mientras que la zona subventricular (SVZ) de ratones contiene sólo progenitores neuronales dispersos21,32,35,36. A nivel celular, los hurones exhiben una alta proporción de un subtipo de progenitores neuronales denominados glia radial basal o externa (bRG u oRG, respectivamente), que se consideran instrumentales para la expansión evolutiva del neocortex de mamíferos34,,37,,38. por lo tanto, bRG son muy abundantes en el neocórtex hurón humano y embrionario fetal, pero son muy raros en el ratón embrionario neocórtex35,,36. Además, el hurón bRG muestra heterogeneidad morfológica similar a la del bRG humano, muy superior al ratón bRG21. Por último, a nivel molecular, el desarrollo de hurón neocórtex muestra patrones de expresión génica muy similares a los del neocórtex humano fetal, que se presume que controlan el desarrollo de plegado cortical, entre otras cosas39.
Las características biológicas y moleculares celulares del hurón bRG las hacen altamente proliferativas, similares a la bRG humana. Esto se traduce en una mayor producción de neuronas y el desarrollo de un neocórtex ampliado y altamente complejo34. Estas características hacen que los hurones sean excelentes organismos modelo para el estudio de características similares a las humanas del desarrollo de neocórtex que no se pueden modelar en ratones26,,40. Para aprovechar al máximo el hurón como organismo modelo se desarrolló el método presentado. Consiste en la electroporación del útero de embriones hurones E33 con un plásmido que expresa la GFP (pGFP) bajo el control de un promotor ubicuo, CAG. Los embriones electroporados pueden ser analizados embrionaria o postnatal. Con el fin de reducir el número de animales sacrificados, las hurones hembra (jills) son esterilizadas por histerectomía y donadas para adopción como mascotas. Si los embriones dirigidos se cosechan en etapas embrionarias, se realiza una segunda cirugía y los embriones son extirpados por una sección cesárea, mientras que las jills se histerorectan. Si los embriones objetivo se analizan en etapas postnatales, las jills se histeroscenten después de que los cachorros han sido destetados o sacrificados. Por lo tanto, también se presenta un protocolo para la histerectomía de las jills.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>4-0 Sutura Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V392ZG</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Spray de aluminio</td><td>cp-pharma</td><td>98017</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Amoxicilina+ácido clavulánico (Synulox RTU)</td><td>WDT</td><td>6301</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Soporte cappilar</td><td>WPI</td><td>MPH6S12</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Solución de ungüento de dexpantenol</td><td>Bayer</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sábana de cortina de cirugía 45x75cm</td><td>Pinza</td> de electrodo de <td>cirugía</td>Hartmann 2513052</tr>, <tr><td>chapada en platino 5mm</td><td>BTX</td><td>45-0489</td><td>Electroporación Electroporador</td></tr><tr><td></td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Hurón Mustela putorius furo</td><td>Marshall</td><td>NA</td><td>Organismo experimental</td></tr><tr><td>Fuente de luz de fibra óptica</td><td>Olympus</td><td>KL1500LCD</td><td>Pinza de electroporación</td></tr><tr><td>Allgaier instrumente</td><td>08-033-130</td><td></td><td>Pinza de cirugía</td></tr><tr><td>3C-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>3C-SA</td><td>Pinza de cirugía</td></tr><tr><td>55</td><td>Dumostar</td><td>11295-51</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Pinzas 5-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>5-SA</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Hisopos de gasa</td><td>grandes Hartmann</td><td></td><td>401723 Cirugía</td></tr><tr><td>Hisopos de gasa pequeños</td><td>Hartmann</td><td>401721</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>anticuerpo GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>GFP anticuerpo Aves</td><td>labs</td><td>GFP1020</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Cappilares de vidrio (vidrio de borosilicato con filamento, OD: 1,2 mm, ID: 0,69 mm, 10 cm de longitud)</td><td>Instrumento</td><td>Sutter BF120-69-10</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Bela-pharm</td><td>K4011-02</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla</td> térmica para cirugía <td>Hans Dinslage</td><td>Sanitas SHK18</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Yodo (solución de Betadine 100 mg/ml)</td><td>Meda</td><td>997437</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>CP</td><td>21311</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Consejos de carga 20&micro; l</td><td>Eppendorf</td><td>#5242 956.003</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Metamizol</td><td>WDT</td><td>99012</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Tijeras de disección Metzenbaum</td><td>Aesculap</td><td>BC600R</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Modelo</td><td>P-97</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>pCAGGS-GFP</td><td>NA</td><td></td><td>NA De Kalebic et al., eLife, 2018</td></tr><tr><td>Anticuerpo PCNA</td><td>Millipore</td><td>CBL407</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>pH3 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab10543</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí de</td> anticuerpos <td>Aesculap</td><td>294200104</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td></td><td>Braun</td><td>EP100</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Sox2 anticuerpo</td><td>R+D Systems</td><td>AF2018</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Pinza quirúrgica 13cm</td><td>WDT</td><td>27080</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Cuchara doble quirúrgica (Williger)</td><td>WDT</td><td>27232</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Paño quirúrgico</td><td>WDT</td><td>28800</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas pequeñas</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Portaagujas de sutura</td><td>Aesculap</td><td>BM149R</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Tbr2 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td>Pipeta de transferencia de anticuerpos</td></tr><tr><td>3ml</td><td>Fischer </td><td>Cirugía 13439108</td><td>científica</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Julabo</td><td>TW2</td><td>Surgery</td></tr></tbody></table>

in vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

La manipulación de la expresión génica in vivo durante el desarrollo embrionario es el método de elección al analizar el papel de los genes individuales durante el desarrollo de mamíferos. En la electroporación del útero es una técnica clave para la manipulación de la expresión génica en el cerebro de mamífero embrionario in vivo. Aquí se presenta un protocolo para la electroporación del útero del neocórtex embrionario de hurones, un pequeño carnívoro. El hurón se está utilizando cada vez más como modelo para el desarrollo de neocórtex, ya que su neocórtex exhibe una serie de características anatómicas, histológicas, celulares y moleculares que también están presentes en primates humanos y no humanos, pero ausentes en modelos de roedores, como el ratón o la rata. En la electroporación del útero se realizó en el día embrionario (E) 33, una etapa de midneurogénesis en hurones. En la electroporación del útero se dirige a las células progenitoras neuronales que recubren los ventrículos laterales del cerebro. Durante la neurogénesis, estas células progenitoras dan lugar a todos los demás tipos de células neuronales. Este trabajo muestra resultados representativos y análisis en E37, día postnatal (P) 1 y P16, correspondientes a 4, 9 y 24 días después en electroporación del útero, respectivamente. En etapas anteriores, la progenie de las células dirigidas consiste principalmente en varios subtipos de progenitores neuronales, mientras que en etapas posteriores la mayoría de las células etiquetadas son neuronas postmitoticas. Así, en la electroporación del útero permite el estudio del efecto de la manipulación genética en las características celulares y moleculares de varios tipos de células neuronales. A través de su efecto en varias poblaciones celulares, en la electroporación del útero también se puede utilizar para la manipulación de características histológicas y anatómicas del neocórtex hurón. Es importante destacar que todos estos efectos son agudos y se realizan con una especificidad espaciotemporal determinada por el usuario.

En la electroporación del útero de hurones en E33 dio lugar a la focalización de las células progenitoras neuronales que recubren la superficie ventricular del neocórtex embrionario (Figura 1). Estas células se llaman progenitores apicales y son altamente proliferativas, dando lugar a todos los demás tipos de células durante el desarrollo. Tras la división asimétrica, los progenitores apicales generaron otro progenitor apical y una célula más diferenciada, típicamente un progenitor basal (BP...

Aquí se presenta un protocolo para realizar la manipulación genética en el cerebro de hurón embrionario utilizando en la electroporación del útero. Este método permite la focalización de células progenitoras neuronales en el neocórtex in vivo.

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Este protocolo nos permite realizar una manipulación genética in vivo en un modelo animal clave que nos permite estudiar la expansión y plegado de un neocórtex en desarrollo. La principal ventaja de este método es el uso de alta especificidad espacial y temporal en la orientación de las células madre neurales que son el tipo de célula clave para el desarrollo cerebral. Antes de comenzar el procedimiento, tire de los capilares de vidrio en un tirador de micro pipetas y utilice fórceps para cortar la parte distal del capilar para ajustar el diámetro de la punta capilar.En el día embrionario 33, agregue la concentración adecuada de ADN en PBS, complementada con 0.1%Fast Green con mezcla suave, y coloque un hurón hembra embarazada, anestesiado, de 3 horas de ayuno en una mesa de operación con una almohadilla térmica. Confirme el nivel adecuado de sedación tocando la piel periocular y pellizcando la piel entre el segundo y el tercero o el tercer y el cuarto dedo de ambas extremidades posteriores. El isoflurano puede causar efectos adversos, como náuseas y mareos.Cuando manipule isoflurano en forma líquida, utilice el equipo de protección. Durante la cirugía, utilice recipientes apropiad

in-vivo-targeting-neural-progenitor-cells-ferret-neocortex-utero

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de rata E16

En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de ratón E15

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las...

Neonatal electroporación superficie pial

Este procedimiento muestra cómo dirigirse a las interneuronas en el prosencéfalo del ratón en desarrollo mediante electroporación en el útero. Esta técnica fue particularmente eficiente para lograr la expresión génica selectiva en subtipos de interneuronas destinadas a las capas superficiales de la corteza.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

Este protocolo describe en detalle cómo transfectar específicamente diferentes regiones en el sistema nervioso central C57BL/6 a través de la electroporación en el útero. En este protocolo se incluyen instrucciones detalladas para las transfecciones de regiones que se desarrollan en la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el núcleo septal lateral y el cuerpo estriado.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

Aquí, presentamos la manipulación genética aguda de organoides corticales humanos cortados en rodajas por electroporación. Estos modelos de organoides corticales son particularmente susceptibles a la inyección, ya que las estructuras similares a los ventrículos se pueden identificar fácilmente después del corte, lo que permite la investigación funcional del desarrollo cortical humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución cortical.

Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

Aprende a realizar electroporación in utero en el cerebro embrionario de hurón para manipular células progenitoras neuronales in vivo. Este método permite estudiar la expansión y plegamiento de la neocorteza en desarrollo.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

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