Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

Este protocolo describe el trasplante ortotópico de fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria y proporciona enfoques valiosos para investigar la biología tumoral, las respuestas a los medicamentos y el mecanismo de resistencia a los medicamentos. Esta técnica es mínimamente invasiva y garantiza la correcta colocación de los tejidos tumorales dentro de la almohadilla de grasa mamaria, la accesibilidad para el recuento por medición y el mantenimiento de la movilidad animal. Esta técnica permite el trasplante de decenas de animales a partir del injerto de un solo paciente, para la evaluación de múltiples terapias candidatas contra el cáncer simultáneamente en un formato de ensayo preclínico.

Este método es superior a la implantación de tejido subcutáneo para establecer modelos intergráficos derivados del paciente, y también se puede utilizar cuando los implantes ortotópicos no son posibles. Lo más difícil es aplicar la cantidad adecuada de presión para despegar la almohadilla de grasa de la pared del cuerpo y hacer la bolsa de tejido. La visualización de la descamación de la almohadilla de grasa y la ubicación anatómica agrietada del fragmento de tejido, lo ayudarán a garantizar una realización exitosa del procedimiento.

Para descongelar fragmentos de tejido tumoral mamario criopreservados para trasplante. Primero, descongele un frasco criogénico del almacenamiento de nitrógeno líquido que contiene los fragmentos tumorales de interés en un baño de agua a 37 grados Celsius, con movimientos suaves ocasionales. Cuando los fragmentos se hayan descongelado, mezcle los fragmentos con una inversión suave y seque el exterior del vial.

Rocíe el vial con etanol al 70% y colóquelo en una campana de seguridad para viales. Transfiera el contenido del vial criogénico a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, añade 10 mililitros de DMEM frío, e invierte el tubo para mezclar.

Deje que los fragmentos se asienten y reemplace un sobrenadante dos veces con una alícuota de 10 mililitros, es decir, DMEM fresco y frío. A continuación, coloque el tubo sobre hielo. Para recolectar una muestra de tejido tumoral mamario, rocíe la región tumoral del ratón portador del tumor con etanol al 70% y use pinzas dentadas para pellizcar y levantar la piel que rodea el tumor.

Use tijeras para hacer una pequeña incisión y separe el tumor de la piel, teniendo cuidado de evitar la contaminación del cabello. Recorte cualquier resto de tejido de la almohadilla de grasa de ratón de la superficie exterior del tumor y coloque el tumor en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de DMEM frío. En una campana de bioseguridad, transfiera el tumor disecado a una placa de Petri estéril de 10 centímetros, que contenga suficiente DMEM para evitar que se seque, y use una cuchilla esterilizada con rayos UV para cortar el tumor en fragmentos de un milímetro cúbico en condiciones asépticas.

Luego, transfiera los fragmentos tumorales a un tubo de 15 mililitros que contiene DMEM frío en hielo. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, aplique ungüento en los ojos del ratón receptor anestesiado y afeite el abdomen alrededor de la cuarta glándula de la memoria. A continuación, desinfecte la piel expuesta tres veces, con movimientos circulares y comenzando en el centro del sitio de la cirugía mientras se desplaza hacia los bordes exteriores, con un exfoliante quirúrgico de povidona y yodo, seguido de la eliminación del exfoliante con una almohadilla de alcohol isopropílico al 70%.

Para el trasplante de los fragmentos de tejido tumoral, en la cuarta almohadilla de grasa mamaria inguinal, cubra al animal con un paño quirúrgico fenestrado estéril y use pinzas dentadas para pellizcar y levantar la piel en el cuarto pezón. Con el lado romo de las puntas hacia abajo, use unas tijeras para hacer una incisión parasagital de aproximadamente un centímetro desde el pezón número cuatro hacia la cabeza. Use un aplicador de punta de algodón para separar la piel del peritoneo en el lado medial de la incisión y retire suavemente la almohadilla de grasa viscoelástica número cuatro de la piel.

Use una aguja estéril de calibre 27 para asegurar la piel cerca del cuerpo del animal y use pinzas dentadas para extender suavemente la almohadilla de grasa lejos del cuerpo. Ubique el ganglio linfático inguinal en la intersección de los vasos principales de la glándula y cauterice cuidadosamente los vasos mediales al ganglio linfático y la grasa adyacente a la cuarta y quinta almohadillas de grasa. Con unas tijeras de microdisección, corte cada vaso cauterizado de uno en uno, hasta que se retire la sección de la almohadilla de grasa que contiene el ganglio linfático, y use pinzas romas para agarrar la almohadilla de grasa.

Con la otra mano y con un movimiento curvo, inserte la punta cerrada de un par de pinzas finas en ángulo en el centro de la almohadilla de grasa por encima del vaso restante cerca de la pared del peritenoneo. Retraiga las puntas y vuelva a insertarlas en el orificio original, abriendo las pinzas para estirar el orificio en un bolsillo pequeño. Retire las pinzas del orificio y utilícelas para insertar un fragmento de tumor en la bolsa.

Abra lentamente las puntas para liberar el fragmento del tumor en el bolsillo de la almohadilla de grasa y retire con cuidado las pinzas. Después de confirmar que el fragmento se ha depositado en el bolsillo de la almohadilla de grasa, comenzando desde la base de la incisión, recoja el de cada lado de la incisión con pinzas dentadas y levante ligeramente la piel. Desenrolle los bordes de la incisión con pinzas de garra y apriete los bordes para formar una superficie continua en la parte superior.

Sosteniendo los dos lados con las pinzas dentadas, use un aplicador de clip para heridas para colocar un clip en el centro de la incisión y coloque al animal en una jaula limpia sobre una superficie de calentamiento con monitoreo hasta que esté completamente recostado. Por lo general, los tumores de xenoinjerto derivados del paciente o de modelos de ratón modificados genéticamente se pueden palpar de aproximadamente dos a ocho semanas después del trasplante. La tinción de H&E se puede realizar para analizar la patología tumoral, mientras que la inmunohistoquímica se puede utilizar para monitorear marcadores de un linaje celular específico de interés, o la viabilidad celular y el estado funcional.

Es importante asegurarse de que el fragmento tumoral esté colocado de forma segura en la bolsa, para que no se caiga y crezca dentro del espacio subcutáneo. Una vez que los tumores han crecido, se puede administrar un tratamiento farmacológico para evaluar las respuestas tumorales. Los tumores también se pueden extirpar para determinar el potencial metastásico de las células cancerosas.

Esta técnica básica se ha utilizado desde la década de 1950. Nuestra modificación proporciona una manera más eficiente y menos invasiva de llevar a cabo la biología del desarrollo a mayor escala en los estudios sobre el cáncer.