Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro
2 de junio de 2020
Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.
La diferenciación neuronal de los ensayos con ratones es un modelo excelente para ilustrar los mecanismos clave implicados en la neurogénesis. Demostramos un método optimizado para la neurogénesis embrioide utilizando una estrategia de cribado de toros de la empresa. Esta técnica tiene las ventajas de alta eficiencia, bajo costo y fácil operación, y es adecuada para la popularización entre los laboratorios.
Es una herramienta poderosa para la investigación en neurociencias. Para realizar la diferenciación utilizando el protocolo uno, siembre 20.000 células madre embrioides de ratón en dos mililitros de medio de diferenciación basal en cada pocillo de una placa de seis pocillos recubierta de gelatina al 0,1%. Después de la unión de las células, lave las células con dos mililitros de PBS y agregue dos mililitros de medio de diferenciación basal a cada pocillo, luego vuelva a colocar las células en la incubadora.
Deje que las células se diferencien durante ocho días, reemplazando el medio cada dos días. Para realizar el protocolo dos, agregue 1,5 millones de células madre embrioides de ratón en una placa bacteriana no adhesiva en 10 mililitros de medio de diferenciación basal e incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para permitir la formación del cuerpo embrioide. Después de dos días, transfiera los agregados celulares a tubos de centrífuga de 15 mililitros y déjelos sedimentar por gravedad.
Retirar el sobrenadante y añadir 10 mililitros de medio de diferenciación basal fresco para volver a suspender los cuerpos embrioides. Luego vuelva a plantarlos en un nuevo plato no adhesivo e incubelos durante otros dos días. Recoja y siembre alrededor de 50 cuerpos embrioides en dos mililitros de medio de diferenciación basal por pocillo en una placa de seis pocillos recubierta de gelatina.
Para la inducción de ácido retinoico, agregue dos microlitros de stock de RA en cada pocillo hasta una concentración final de un micromolar. Regrese la placa a la incubadora y diferencie las celdas durante otros cuatro días. Para realizar la diferenciación utilizando el protocolo tres, repita el protocolo dos, pero permita solo dos días para la formación del cuerpo embrionario y seis días para la inducción de la AR.
El control de calidad de la formación de cuerpos embrioides debe llevarse a cabo mediante microscopía. Solo aquellos con núcleos brillantes pueden diferenciarse con éxito en el proceso posterior. Para el protocolo cuatro, siembre 20.000 células madre embrionarias de ratón por pocillo en las placas recubiertas de gelatina y siga el protocolo uno.
Después de permitir que las células se diferencien durante cuatro días, agregue dos microlitros de todo el stock de RA trans en cada pocillo e incube la placa durante otros cuatro días. Para realizar el protocolo cinco, repita el protocolo cuatro, pero comience la inducción de la AR después de solo dos días de diferenciación. Para el protocolo seis, plante 1,5 millones de células madre en una placa bacteriana no adhesiva en 10 mililitros de N2B27 medio dos e incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para permitir la formación del cuerpo embrioide.
Después de dos días, recoja los agregados celulares como se describió anteriormente y vuelva a suspender los cuerpos embrioides con 10 mililitros de N2B27 fresco medio dos. Vuelva a plantarlos en una nueva placa bacteriana no adhesiva y permita la diferenciación durante otros dos días. Al cuarto día, recoja y siembre unos 50 cuerpos embrioides por pocillo en placas de seis pocillos recubiertas de gelatina con dos mililitros de N2B27 medio dos.
Agregue dos microlitros de todo el stock de RA trans en cada pocillo e induzca la diferenciación durante otros cuatro días. Para realizar el protocolo siete, siembre alrededor de 20.000 células en dos mililitros de medio de diferenciación basal por pocillo en las placas recubiertas de gelatina. Después de la fijación de las celdas y dos lavados con PBS, agregue dos mililitros de medio N2B7, dos a cada pocillo y permita que las celdas se diferencien durante ocho días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Después de realizar la diferenciación de la fase uno utilizando el protocolo tres, siembre alrededor de 500.000 derivados de células madre embrionarias de ratón en dos mililitros de medio de diferenciación basal por pocillo en las placas recubiertas de gelatina al 0,1%. Divida aleatoriamente los derivados en tres grupos para probar tres protocolos de diferenciación de fase dos. Incubar la placa durante seis horas, luego lavar las células dos veces con dos mililitros de PBS y agregar dos mililitros de medio de diferenciación basal N2B27 medio uno o medio N2B27 dos a cada pocillo, según el protocolo.
Coloque las cuchillas en la incubadora y deje que las células se diferencien durante otros 10 días, cambiando el medio correspondiente cada dos días. Se probaron siete protocolos para determinar el protocolo óptimo para la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en células precursoras generales o NPC. Los protocolos se probaron tanto en esclusas A2lox como en 129 células, y el estado de diferenciación de cada grupo se monitorizó mediante un microscopio óptico.
La mayoría de los derivados de A2lox y 129 mostraron morfologías bien apiladas y similares a las de la neurita según el protocolo tres, lo que indica la formación de NPC. Sin embargo, las células diferenciadas mediante el protocolo dos parecían apoptóticas, lo que puede deberse a la falta de nutrientes dentro de los cuerpos embrioides. Para confirmar aún más la formación de NPC, se detectaron células nestin-positivas mediante un ensayo de inmunofluorescencia.
El protocolo tres dio como resultado que el porcentaje más alto de células nestin-positivas alcanzara hasta el 78 y el 69% en A2lox y 129 derivados, respectivamente. Se probaron tres protocolos para la diferenciación de NPC en neuronas. Se determinó que el protocolo tres induce la diferenciación de manera más efectiva.
La mayoría de los derivados de A2lox y 129 en el protocolo de fase dos tres tenían estructuras similares a neuronas prolongadas con neuritas claras y extensiones del cuerpo celular. Los ensayos de inmunofluorescencia confirmaron además la generación de neuronas con un porcentaje de células positivas para beta tubulina tres de hasta el 68 y el 59% en A2lox y 129 derivados, respectivamente, utilizando el protocolo tres. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que los ensayos con ratones estén sanos y no estén diferenciados antes de la diferenciación.
Además, se debe llevar a cabo un estricto control de calidad después de la formación en cuerpos perforados y antes de la diferenciación de la fase dos. Esta técnica proporciona un modelo estándar para los investigadores de neurobiología y biología del desarrollo y se espera que sea una herramienta poderosa para ilustrar los mecanismos clave involucrados en la neurogénesis.
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Descripción general
Este estudio presenta un método optimizado y rentable para la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas. Mediante el uso de ensayos con células madre embrionarias de ratón, la técnica demuestra una alta eficiencia y simplicidad, lo que la convierte en ideal para un uso amplio en laboratorios dedicados a la investigación neurológica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Diferenciación celular
- Biología de células madre
Antecedentes
- La diferenciación neuronal es fundamental para comprender la neurogénesis.
- Los modelos de células madre embrionarias son eficientes para estudiar el desarrollo celular.
- Los protocolos óptimos pueden mejorar el rendimiento y la viabilidad de las células diferenciadas.
Objetivo del estudio
- Establecer un método estándar y eficiente para derivar neuronas a partir de células madre embrionarias.
- Facilitar la utilidad de este método en diversos laboratorios.
- Evaluar diferentes protocolos para obtener los mejores resultados en la diferenciación celular.
Métodos Utilizados
- Cultivo celular en placas recubiertas con gelatina y en placas bacterianas no adherentes.
- Células madre embrionarias de ratón como modelo biológico para la diferenciación.
- Siete protocolos de diferenciación que implican condiciones variables para la formación de cuerpos embrionarios e inducción con ácido retinoico.
- Seguimiento de la diferenciación mediante microscopía y ensayos de inmunofluorescencia.
- Medidas de control de calidad para la viabilidad de los cuerpos embrionarios y el éxito de la diferenciación.
Resultados principales
- El protocolo tres produjo el porcentaje más alto de células precursoras neurales positivas para nestina (78% en derivados A2lox y 69% en derivados 129).
- Se observaron neuronas positivas para beta-tubulina III en tasas del 68% y 59% para derivados A2lox y 129, respectivamente.
- El control de calidad indicó que los cuerpos embrioides sanos son cruciales para una diferenciación exitosa.
Conclusiones
- Este estudio proporciona una herramienta robusta para la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas, mejorando la investigación en neurobiología.
- Las metodologías descritas pueden adaptarse para aplicaciones más amplias en biología del desarrollo.
- Crea oportunidades para comprender mejor el desarrollo neuronal y los trastornos relacionados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de modelos in vitro confiables de neurogénesis es fundamental para la validación de dianas en programas de enfermedades neurodegenerativas. Este método proporciona un sistema escalable y rentable para generar células precursoras neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón, lo que favorece la reducción del riesgo mecanicista en fases iniciales. El enfoque permite el cribado fenotípico reproducible y el desarrollo de ensayos para estudios de modulación de vías.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas en las vías de neurodesarrollo mediante un sistema definido de diferenciación.
- Valor operativo: Proporciona una fuente renovable de células precursoras neurales positivas para nestina destinadas a estudios de interacción con dianas.
- Valor predictivo: Facilita la alineación de biomarcadores mediante resultados cuantificables, como la generación de neuronas positivas para beta-tubulina III.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera poblaciones neuronales estandarizadas adecuadas para ensayos de cribado de compuestos y modulación de vías.
- Valor operativo: Utiliza protocolos de bajo costo y fácil operación, compatibles con formatos de placas de múltiples pocillos para alto rendimiento.
- Valor de reproducibilidad: Los pasos definidos de formación de cuerpos embrioides e inducción con ácido retinoico garantizan consistencia entre lotes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Produce células neuronales relevantes para la enfermedad que modelan mecanismos clave de la neurogénesis para la validación de dianas.
- Valor operativo: Permite la maduración longitudinal en medio N2B27 II para el mantenimiento prolongado de neuronas y ensayos funcionales.
- Continuidad traslacional: Conecta la diferenciación de células madre en fase de descubrimiento con flujos de trabajo de investigación neurobiológica preclínica.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, permitiendo modelos neuronales derivados de células madre para la verificación de hipótesis sobre dianas y la preparación de ensayos antes de los esfuerzos de identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar un sistema controlado para estudiar vías neurogénicas y dinámicas de diferenciación.
- Selección: Ofrece lecturas cuantificables basadas en microscopía e inmunofluorescencia para evaluar el efecto de compuestos en poblaciones de precursores neurales y neuronas.
- Análisis: Genera métricas porcentuales de eficiencia de diferenciación (nestina+, beta-tubulina III+) que apoyan el análisis comparativo entre condiciones y la selección de resultados positivos.
- Investigación Traductiva: Permite la continuidad desde la diferenciación de células madre hasta la maduración neuronal, para validación fenotípica y funcional posterior.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y reutilizable de diferenciación aplicable a múltiples proyectos de neurobiología y biología del desarrollo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del blanco mediante la generación reproducible de células precursoras neuronales y neuronas a partir de células madre embrionarias murinas (mESCs).
- Valor operativo: Reduce la variabilidad técnica mediante un control de calidad definido de cuerpos embrioides y pasos temporizados de inducción con ácido retinoico.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al proporcionar lecturas biológicas tempranas en un sistema fisiológicamente relevante.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de blancos al permitir la reducción mecanicista del riesgo en las vías de neurogénesis.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, manipulación de cuerpos embrioides y técnicas de ensayo de inmunofluorescencia.
- Depende de placas recubiertas con gelatina, placas bacterianas no adherentes y condiciones controladas del incubador (37°C, 5% CO2).
- Necesita la estandarización de la preparación del stock de ácido retinoico y la evaluación de la calidad de los cuerpos embrioides mediante microscopía.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir protocolos entre líneas de células madre embrionarias murinas (por ejemplo, A2lox frente a derivados de 129).
- Limitado por la necesidad de un control estricto de la calidad del estado de salud de los cuerpos embrioides antes de la inducción con ácido retinoico para asegurar el éxito de la diferenciación.
