Name: Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprende a utilizar la plataforma LEVITATT para pruebas de toxicidad de algas con nanomateriales y sustancias difíciles. Este método emplea iluminación LED para minimizar el calor y garantizar un campo de luz uniforme durante el ensayo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue financiada por PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, acuerdo de subvención 760813 bajo el programa de investigación e innovación Horizonte 2020.

1. Descripción de la configuración de LEVITATT
<ol><li>Utilice viales de vidrio de centelleo de 20 ml(Figura 1, inserto 1) permitiendo la penetración de la luz. Alternativamente, se pueden utilizar viales de plástico penetrables ligeros. Cuantifique la intensidad de la luz utilizando un fotómetro.</li>
	<li>Utilice al menos una suspensión de prueba de 4 ml al comienzo de la prueba para permitir la cuantificación de la biomasa y la caracterización/cuantificación de nanomateriales durante y después de la incubación (Figura 1, inserto 2).</li>
	<li>Coloque los viales de centelleo de 20 ml con una tapa(Figura 1, inserto 3) donde se perfore un pequeño orificio (aproximadamente 1 mm de diámetro) para permitir el intercambio deCO2 con la atmósfera. Este intercambio es crucial para garantizar niveles estables de pH y CO2 durante las pruebas.</li>
	<li>Para sustancias volátiles, utilice una tapa recubierta de teflón hermética para permitir el enriquecimiento de CO2 del espacio de la cabeza utilizando una jeringa9 o matraces completamente cerrados sin fase gaseosa en la que el CO2 se mantenga en solución mediante un sistema tampón de bicarbonato de sodio enriquecido (NaHCO3)10.</li>
	<li>Fije los viales con abrazaderas montadas en la carcasa exterior(Figura 1, inserto 4).</li>
	<li>Utilice una fuente de luz LED situada debajo de los viales de prueba(Figura 1, inserción 5) que proporcione una iluminación fluorescente uniforme de tipo "blanco frío" o "luz diurna" y una intensidad de luz en el rango de 60–120 á-M-2s -1 medido en el rango de longitud de onda fotosintéticamente eficaz de 400 nm a 700 nm. La configuración emplea una intensidad de luz ajustable en el rango de 5–160 m-2s-1 mediante el ajuste de un atenuador de luz a la fuente. Esto permite realizar pruebas a intensidades de luz más altas y más bajas.</li>
	<li>Monte la configuración en un agitador orbital para agitar muestras durante toda la prueba. Esto mantiene las células en suspensión libre y facilita la transferencia de masa deCO2 del aire al agua(Figura 1, inserto 6).</li>
	<li>Coloque la configuración en una sala de temperatura controlada o en un gabinete termostático para mantener temperaturas estables durante las pruebas(Figura 1, inserto 7).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2.jpg"> Figura 1: Imagen de la tabla de iluminación vertical LED para pruebas de toxicidad de algas (LEVITATT). 1) Viales de centelleo de vidrio de 20 ml para incubación, 2) 4 ml de muestra para análisis, 3) tapa con orificio perforado para intercambio deCO2, 4) carcasa para condiciones de luz definidas, 5) fuente de luz LED situada en el centro de la carcasa, 6) agitador orbital para agitación durante el experimento, y 7) un gabinete termostático. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Preparación del medio de crecimiento de algas
<ol><li>El medio de crecimiento de algas ISO 8692 consta de cuatro soluciones de stock diferentes. Pesar la cantidad adecuada de sales y diluir en agua ultrapura según la Tabla 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluciones de stock</td>
			<td>Nutrientes</td>
			<td>Concentración en solución de stock</td>
			<td>Concentración en la solución de ensayo</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">1: Macronutrientes</td>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1,5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (N: 3,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2a 6H2O</td>
			<td>1.2 g/L</td>
			<td>12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2a 2H2O</td>
			<td>1,8 g/L</td>
			<td>18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4a 7h2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (S: 1,95 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0,16 g/L</td>
			<td>1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2: Fe-EDTA</td>
			<td>FeCl3a 6H2O</td>
			<td>64 mg/L</td>
			<td>64 g/L (Fe: 13 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA-2H2O</td>
			<td>100 mg/L</td>
			<td>100 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">3: Elementos de seguimiento</td>
			<td>H3BO3a
</td>
			<td>185 mg/L</td>
			<td>185 g/L (B: 32 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2a 4H2O</td>
			<td>415 mg/L</td>
			<td>415 g/L (Mn: 115 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2
</td>
			<td>3 mg/L</td>
			<td>3 g/L (Zn: 1,4 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2a 6H2O</td>
			<td>1,5 mg/L</td>
			<td>1.5 g/L (Co: 0,37 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuCl2a 2H2O</td>
			<td>0,01 mg/L</td>
			<td>0.01 g/L (Cu: 3,7 ng/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4a 2H2O</td>
			<td>7 mg/L</td>
			<td>7 g/L (Mo: 2,8 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4: NaHCO3</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>50 g/L</td>
			<td>50 mg/L (C: 7,14 mg/L)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Concentraciones de nutrientes en soluciones de stock para medio de crecimiento de algas
NOTA: H3BO3 se puede disolver añadiendo 0,1 M NaOH. EDTA debe retirarse al probar metales, para evitar la complejidad con iones metálicos. Esterilice las soluciones de stock por filtración por membrana (diámetro medio del poro 0,2 m) o mediante autoclavación (120 oC, 15 min). No realice las soluciones de material de autoclave 2 y 4, pero esterilícelas mediante filtración por membrana. Almacene las soluciones en la oscuridad a 4 oC.
<ol start="2"><li>Para producir 1 L de medio de crecimiento de algas, transfiera 500 ml de agua ultrapura esterilizada a un matraz volumétrico esterilizado de 1 L y añada 10 ml de solución de stock 1: Macronutrientes, 1 ml de solución de stock 2: Fe-EDTA, 1 mL de solución de stock 3: Elementos de traza y 1 ml de solución de stock 4: NaHCO3.</li>
	<li>Llene hasta 1 L con agua ultrapura esterilizada, detenga el matraz y agite bien para homogeneizar el medio de crecimiento de algas.</li>
	<li>Equilibrar la solución antes de su uso dejándola durante la noche en contacto con el aire o burbujeando con aire estéril filtrado durante 30 min. Después del equilibrio, ajuste el pH, si es necesario, a pH 8,1 ± 0,2, con 1 M HCl o 1 M NaOH.</li>
</ol>3. Configuración de la prueba de algas
NOTA: En la Figura 2se muestra un diagrama de flujo del procedimiento de prueba de algas.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig2v6.jpg"> Figura 2: Diagrama de flujo de la configuración de la prueba de algas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Preparar una solución de stock del compuesto de ensayo en la concentración de ensayo más alta deseada en el medio de crecimiento de algas preparado de acuerdo con el paso 2. Para la preparación de soluciones/suspensiones de stock, siga la OCDE 201 (para compuestos solubles) o la OCDE 318 (para nanomateriales).</li>
	<li>Mida el pH en la solución en stock. Si se desvían más de una unidad del medio de crecimiento de algas, ajuste el pH a 8 con 1 M HCl o 1 M NaOH.</li>
	<li>Calcular el volumen de inóculo necesario para alcanzar una concentración celular final de 1 x 104 células/ml en una solución de prueba de 25 ml. NOTA: El inóculo debe provenir de una cultura de raphidocelis subcapitata de crecimiento exponencial no contaminado cultivada con la configuración LEVITATT.</li>
	<li>Calcular la cantidad de solución de stock para añadir a cada matraz volumétrico de 25 ml para obtener las concentraciones de ensayo deseadas. El factor entre cada concentración no debe exceder de 3,2.</li>
	<li>Marque un matraz volumétrico de 25 ml para cada concentración elegida y un control marcado de matraz volumétrico adicional de 25 ml.</li>
	<li>Añadir la cantidad de solución de stock del compuesto de ensayo necesario para alcanzar las concentraciones deseadas al matraz volumétrico de 25 ml. No agregue una solución de stock al control.</li>
	<li>Añadir el medio a cada matraz volumétrico de 25 ml para alcanzar un volumen de aproximadamente 20 ml.</li>
	<li>Añadir el volumen de inóculo calculado en el paso 3.3 a cada matraz volumétrico de 25 ml. Añadir el medio a cada matraz volumétrico de 25 ml a un volumen total final de 25 ml.</li>
	<li>Tape los matraces y mezcle bien girando los matraces dos veces verticalmente.</li>
	<li>Transfiera 0,4 ml de cada matraz a viales de tapones de tornillo individuales y añada 1,6 ml de acetona (saturada con MgCO3):una muestra para cada concentración de ensayo y el control. Cierre bien las tapas y guárdelas en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las mediciones de fluorescencia (sección 4).</li>
	<li>Pipet 4 ml de cada solución de ensayo en viales de centelleo de 20 ml (3 réplicas por concentración y 5 réplicas para el control). Tapa de tornillo en los viales de centelleo. Recuerde que las tapas deben tener un orificio perforado (aproximadamente 1 mm de diámetro) para permitir el intercambio deCO2.</li>
	<li>Después de 24 h, 48 h y 72 h, pipetear 0,4 ml de cada vial en viales de tapón de tornillo y añadir 1,6 ml de acetona (saturado con MgCO3). Cierre bien las tapas y guárdelas en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las mediciones de fluorescencia (sección 4).</li>
	<li>Después de tomar la última muestra a 72 h, aduique suavemente las tres réplicas para una concentración dada en un vial y mida el pH. Repita el proceso para todas las concentraciones y el control. El pH no debe desviarse más de 1,5 unidades del pH inicial para cualquiera de las muestras medidas.</li>
	<li>Descargue los líquidos restantes en un contenedor de residuos siguiendo sus normas y reglamentos institucionales.</li>
</ol>4. Análisis de muestras de pruebas de algas
<ol><li>Utilice un espectrofotómetro de fluorescencia para medir la biomasa de algas (aquí expresada como clorofila A). La emisión máxima de clorofila A es de 420 nm para la longitud de onda de excitación y de 671 nm para la longitud de onda de emisión.</li>
	<li>Mida la fluorescencia de cada muestra individual tres veces y calcule el valor medio de cada muestra.</li>
	<li>Utilice la ecuación 1 para calcular la tasa de crecimiento. La fluorescencia medida (unidades relativas) se puede utilizar directamente como parámetro de biomasa en la ecuación 1. Ecuación 1: μ (ln Nt – ln N0) / t donde μ es la tasa de crecimiento (d-1), N0 es la biomasa inicial, Nt es la biomasa en el momento t, y t es la duración del período de prueba (d). Nota, N0 y Nt deben expresarse en la misma unidad.</li>
	<li>Utilice un software estadístico para ajustar una curva de regresión no lineal (por ejemplo, una función log-logística o Weibull) a los datos de la tasa de crecimiento para obtener valores de concentración efectivos en una inhibición del 10%, 20% y 50%. En la información complementaria se proporciona un ejemplo de código para el ajuste en el software estadístico R utilizando el paqueteDRC 11.</li>
</ol>

<ol><li>European Chemicals Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+on+Registration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Chemicals+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidance on Registration.</a> European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).</li>
<li>Organisation for Economic Cooperation and Development. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+Document+on+Aquatic+Toxicity+Testing+of+Difficult+Substances+and+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Organisation+for+Economic+Cooperation+and+Development%22%5BJournal%5D)">Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures.</a> Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).</li>
<li>Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+microplate+algal+assay+technique+for+aquatic+toxicity+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicity+Assessment%22%5BJournal%5D)">A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment.</a> Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).</li>
<li>Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+certain+shade+of+green%3A+can+algal+pigments+reveal+shading+effects+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Integrated+Environmental+Assessment+and+Management%22%5BJournal%5D)">A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles.</a> Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algae+response+to+engineered+nanoparticles%3A+current+understanding%7B%2C%7D+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications.</a> Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).</li>
<li>Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniscale+algal+toxicity+test%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A miniscale algal toxicity test.</a> Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).</li>
<li>Organisation for Economic Cooperation and Development. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+No.+201%3A+Freshwater+Alga+and+Cyanobacteria%2C+Growth+Inhibition+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Organisation+for+Economic+Cooperation+and+Development%22%5BJournal%5D)">Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test.</a> Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).</li>
<li>International Organization for Standardization (ISO). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Quality+-+Fresh+Water+Algal+Growth+Inhibition+Test+with+Unicellular+Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Organization+for+Standardization+%28ISO%29%22%5BJournal%5D)">Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae.</a> International Organization for Standardization (ISO). , (2012).</li>
<li>Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+toxicity+tests+with+volatile+and+hazardous+compounds+in+air-tight+test+flasks+with+CO2+enriched+headspace%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace.</a> Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).</li>
<li>Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+growth+inhibition+test+in+filled%2C+closed+bottles+for+volatile+and+sorptive+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).</li>
<li>Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+analysis+using+R%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dose-response analysis using R.</a> PloS One. 10 (12), 0146021(2015).</li>
<li>Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+freely+dissolved+concentrations+of+semivolatile+and+hydrophobic+test+chemicals+in+in+vitro+assays-measuring+high+losses+and+crossover+by+headspace+solid-phase+microextraction%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).</li>
<li>Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Headspace+passive+dosing+of+volatile+hydrophobic+chemicals+-+toxicity+testing+exactly+at+the+saturation+level%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level.</a> Chemosphere. 211, 694-700 (2018).</li>
<li>Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+algal+toxicity+testing+using+fluorometric+microplate+and+Erlenmeyer+flask+growth-inhibition+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).</li>
<li>Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+miniaturized+algal+bioassay+in+phytotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening.</a> Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).</li>
<li>Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round-robin+testing+with+the+selenastrum--capricornutum+microplate+toxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay.</a> Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).</li>
<li>Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fluorometric+microplate+algal+toxicity+assay+for+riverine+periphytic+algal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).</li>
<li>Lee, W. M., An, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+zinc+oxide+and+titanium+dioxide+nanoparticles+on+green+algae+under+visible%2C+UVA%2C+and+UVB+irradiations%3A+no+evidence+of+enhanced+algal+toxicity+under+UV+pre-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation.</a> Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).</li>
<li>Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+morphology+and+size+of+zinc+oxide+nanoparticles+on+its+toxicity+to+the+freshwater+microalga%2C+Raphidocelis+subcapitata%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata.</a> Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).</li>
<li>Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+of+titanium+dioxide+and+zinc+oxide+nanoparticles+in+the+presence+of+wastewater-derived+organic+matter+and+implications+for+algal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity.</a> Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).</li>
<li>Hartmann, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+testing+metal+and+metal+oxide+nanoparticles+in+algal+bioassays%3A+titanium+dioxide+and+gold+nanoparticles+as+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies.</a> Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).</li>
<li>Farkas, J., Booth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+fluorescence-based+chlorophyll+quantification+methods+suitable+for+algae+toxicity+assessment+of+carbon+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials.</a> Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).</li>
<li>Handy, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+conducting+ecotoxicity+test+methods+with+manufactured+nanomaterials%3A+what+have+we+learnt+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far.</a> Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).</li>
<li>Handy, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicity+test+methods+for+engineered+nanomaterials%3A+practical+experiences+and+recommendations+from+the+bench%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El fitoplancton convierte la energía solar y el dióxido de carbono en materia orgánica y, por lo tanto, desempeña un papel fundamental en el ecosistema acuático. Por esta razón, las pruebas de inhibición de la tasa de crecimiento de algas se incluyen como una de las tres pruebas de toxicidad acuática obligatorias necesarias para la evaluación del riesgo reglamentario de los productos químicos. La capacidad de realizar un ensayo de toxicidad de algas fiable y reproducible es clave a este respecto. Las configuraciones de p...

El ensayo de toxicidad por algas es uno de los tres únicos ensayos obligatorios utilizados para generar los datos de ecotoxicidad necesarios para el registro antes y después del mercado de productos químicos por normativas europeas e internacionales (por ejemplo, REACH1 y TSCA (EE.UU.)). Para ello, las organizaciones internacionales han elaborado directrices estandarizadas de pruebas de algas (por ejemplo, ISO y OCDE). Estas normas y directrices de prueba prescriben condiciones de prueba ideales en términos de pH, temperatura, niveles de dióxido de carbono e intensidad de la luz. Sin embargo, mantener condiciones de ensayo estables durante las pruebas de algas es en la práctica difícil y los resultados sufren problemas de reproducibilidad y fiabilidad para una serie de sustancias químicas y nanomateriales (a menudo denominados "sustancias difíciles")2. La mayoría de las configuraciones de pruebas de toxicidad de algas existentes funcionan con volúmenes relativamente grandes (100-250 ml) situados en un agitador orbital dentro de una incubadora. Tal configuración limita el número de concentraciones de prueba y replica volúmenes alcanzables y altos de cultivo de algas y material de prueba. Además, estas configuraciones rara vez tienen un campo de luz uniforme y las condiciones de iluminación fiables son además difíciles de obtener en frascos grandes, en parte como la intensidad de la luz disminuye exponencialmente cuanto más viaja la luz y en parte debido a la geometría del matraz. Las configuraciones alternativas comprenden microtíteres de plástico3 placas que contienen pequeños volúmenes de muestra que no permiten volúmenes de muestreo adecuados para medir el pH, mediciones adicionales de biomasa, extracción de pigmentos u otros análisis que requieren muestreo destructivo. Un desafío particular utilizando las configuraciones existentes para las pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y sustancias que forman suspensiones de color es la interferencia o el bloqueo de la luz disponible para las células de algas, a menudo denominada "sombreado"4,,5. El sombreado puede ocurrir dentro de los viales por el material de prueba y/o interacciones entre el material de ensayo y las células de algas, o el sombreado puede ocurrir entre viales, debido a su posicionamiento en relación entre sí y la fuente de luz.
El método se basa en la configuración de la prueba de toxicidad de algas a pequeña escala introducida por Arensberg et al.6 que permite realizar pruebas de conformidad con normas como la OCDE 2017e ISO 86928. El método se optimiza aún más para abordar las limitaciones mencionadas anteriormente por: 1) utilizando la tecnología de luz LED para garantizar condiciones de luz uniformes con una generación de calor mínima, 2) proporcionando un volumen de muestra adecuado para el análisis químico/biológico manteniendo un pH constante, niveles deCO2 y 3) lo que permite el uso de material contenedor de ensayo versátil para pruebas de sustancias volátiles o sustancias con un alto potencial de sorción.

<table><tbody><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V179124</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134</td><td></td></tr><tr><td>BlueCap botellas (1L)</td><td>Buch & Holm A/S</td><td>&nbsp; </td><td></td>Ácido 9072335</tr><tr><td>bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Lámina acrílica transparente (40x40 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto (II) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobre (II) dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; E5134</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de fluorescencia F-7000</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (III) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz LED</td><td>Helmholt Elektronik A/S</td><td>H35161</td><td>Blanco neutro, 6500K</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Raphidocelis subcapitata</td><td>NORCCA</td><td></td><td>NIVA-CHL1 cepa</td></tr><tr><td>Viales de centelleo (20 mL)</td><td>Fisherscientific</td><td>11526325</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de sodio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Abrazadera de muelle</td><td>Frederiksen Scientific A/S</td><td>472002</td><td></td></tr><tr><td>Armario termostático</td><td>VWR</td><td>WTWA208450</td><td>Alternativa: habitación con control de temperatura</td></tr><tr><td>Tubo de ventilación (&Oslash; 125 mm)</td><td>Silvan</td><td>22605630165</td><td></td></tr><tr><td>Matraces volumétricos (25 mL)</td><td>DWK Life Sciences</td><td>246781455</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de zinc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

Los datos de ecotoxicidad son un requisito para el registro previo y posterior al mercado de productos químicos por normativa europea e internacional (por ejemplo, REACH). El ensayo de toxicidad de algas se utiliza con frecuencia en la evaluación del riesgo reglamentario de los productos químicos. Con el fin de lograr una alta fiabilidad y reproducibilidad, el desarrollo de directrices estandarizadas es vital. Para las pruebas de toxicidad de algas, las directrices requieren condiciones estables y uniformes de parámetros como el pH, la temperatura, los niveles de dióxido de carbono y la intensidad de la luz. Los nanomateriales y otras sustancias llamadas difíciles pueden interferir con la luz causando una gran variación en los resultados obtenidos que obstaculiza su aceptación regulatoria. Para hacer frente a estos desafíos, hemos desarrollado LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). La configuración utiliza iluminación LED desde abajo, lo que permite una distribución homogénea de la luz y un control de temperatura, al mismo tiempo que minimiza el sombreado intramuestra. La configuración optimiza el volumen de la muestra para la cuantificación de la biomasa y garantiza al mismo tiempo una afluencia suficiente deCO2 para apoyar el crecimiento exponencial de las algas. Además, el material de los contenedores de prueba se puede adaptar para minimizar la adsorción y la volatilización. Al probar sustancias de color o suspensiones de partículas, el uso de luces LED también permite aumentar la intensidad de la luz sin generación de calor adicional. El diseño compacto y los requisitos mínimos de equipamiento aumentan las posibilidades de implementación del LEVITATT en una amplia gama de laboratorios. Si bien cumplió con las directrices estandarizadas de ISO y la OCDE para las pruebas de toxicidad de algas, LEVITATT también mostró una menor variabilidad entre muestras para dos sustancias de referencia (3,5-Dicholorophenol y K2Cr2O7)y tres nanomateriales (ZnO, CeO2y BaSO4)en comparación con los matraces y las placas de microtíter Erlenmeyer.

Se lleva a cabo un ensayo inicial con una sustancia de referencia para determinar la sensibilidad de la cepa de algas. Las sustancias de referencia utilizadas regularmente para R. subcapitata son el dicromato de potasio y 3,5-Diclorfenol7,8. La Figura 3 y la Tabla 2 muestran un resultado representativo de una prueba de algas que incluye ajuste de curva y resultados estadísticos cuando el paquete de la RDC en...

Demostramos pruebas de toxicidad algas para sustancias difíciles (por ejemplo, sustancias de color o nanomateriales) utilizando una configuración iluminada verticalmente con un LED.

Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Cuando una empresa química quiere poner en el mercado un nuevo producto químico u otro material, necesita entregar datos de una serie de pruebas de ecotoxicidad. La prueba de algas es una de las tres pruebas obligatorias que se deben realizar. La prueba de algas sufre por el hecho de que es bastante difícil de realizar.Por esta razón, hemos desarrollado la plataforma de pruebas LEVITATT. El LEVITATT utiliza luz LED para evitar problemas con la generación excesiva de calor. Además, garantiza un campo de luz uniforme.Tiene un tamaño compacto, lo que significa que no necesita mucho espacio para realizar la prueba de algas, pero al mismo tiempo, permite utilizar suficiente volumen de muestra para realizar análisis químicos y caracterización antes, durante y después de la prueba. Esto es especialmente importante cuando se prueban nanomateriales. Este vídeo demostrará el uso de LEVITATT para pruebas de toxicidad algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles.La demostración consta de los siguientes cuatro pasos. En primer lugar, describa los componentes del LEVITATT. El segundo paso es preparar la solución para los medios de crecimiento de algas.Y el tercer paso es dar una visión general del procedimiento de cómo realizar una prueba de toxicidad de algas. El último paso es medir el aumento de la biomasa de algas por fluorómetro. El LEVITATT se puede colocar en el armario de la habitación con temperatura controlada.Esto permite una temperatura estable durante toda la exposición. La configuración se coloca en un agitador orbital para permitir la rotación de las muestras durante la prueba. El ensayo se realiza en viales de centelleo de 20 mililitros que contienen cuatro mililitros de exposición al medio.Una tapa de tornillo con un orificio perforado permite el intercambio de CO2 con aire durante la exposición. La fuente LED se intercala entre dos láminas de plástico y se encuentra en el centro de cada carcasa. La colocación crea un campo de luz homogéneo y minimiza el sombreado entre las muestras.Cada carcasa está montada con abrazaderas y puede contener hasta cinco muestras. El tamaño compacto minimiza el espacio necesario para realizar el experimento. Para preparar las soluciones de stock, sopesar la cantidad adecuada de cada compuesto.La solución de stock consiste en varias sales vitales para el crecimiento de las algas. Cuando se ha pesado la cantidad adecuada de sales, se diluyen con agua ultrapura. Las soluciones de stock se esterilizan ya sea por filtrado o autoclaving.Después de la esterilización, las soluciones de stock se pueden almacenar en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Preparar una serie de concentraciones de exposición. El factor entre las concentraciones de exposición no debe exceder de 3,2.El volumen adecuado de algas de crecimiento exponencial se añade a cada concentración de prueba. La densidad celular final debe ser de aproximadamente 10.000 células de algas por mililitro. Es clave que la referencia previa esté creciendo exponencialmente para cumplir con los criterios de validez de la prueba.Los viales de medición se mezclan para permitir una distribución homogénea de algas y compuestos antes del muestreo. Las muestras se vierten en vasos de pico, y cuatro mililitros se canalizan en viales de centelleo de 20 mililitros. Los viales de centelleo ahora están tapados.Pipetear 0,4 mililitros de cada concentración. Añadir 1,6 mililitros de acetona para interrumpir la pared celular y liberar la clorofila a la fase líquida. Cada vial de vidrio ahora está firmemente cerca para evitar la evaporación de la acetona durante el almacenamiento.Los viales de centelleo tapado ahora se distribuyen aleatoriamente en el LEVITATT y se incuban durante 72 horas. Mida la intensidad de la luz y la temperatura al inicio y al final de la incubación para garantizar el cumplimiento de las pautas deseadas. El submuestreo se realiza a intervalos de 24 horas pipeteando 0,4 mililitros de cada vial de centelleo en viales de vidrio.Añadir 1,6 millones de acetona para interrumpir la pared celular y liberar la clorofila a la fase líquida. Después de añadir acetona, atornillar las tapas firmemente y dejar las muestras en la oscuridad hasta el análisis. Utilice un fluorómetro para cuantificar la biomasa en la muestra adquirida durante todo el período de prueba.Los ajustes del fluorómetro deben ser de 420 nanómetros como longitud de onda de excitación y una longitud de onda de emisión de 671 nanómetros. Cada muestra individual se mide tres veces y se observan los valores relativos. Los valores relativos del fluorómetro se utilizan para calcular la tasa de crecimiento que se utilizará para el tratamiento de datos posterior.Utilice un software estadístico para ajustar una curva de regresión no lineal a los datos de la tasa de crecimiento calculada. Un ejemplo de una curva de regresión no lineal podría ser un log-logistic de función viable. El intervalo de confianza del 95% asociado se muestra junto con el ajuste del modelo.Los valores de concentración regularmente efectivos como 10, 20 y 50% ineficientes se utilizan para informar el resultado de una prueba de ecotoxicidad. En conclusión, el LEVITATT proporciona una plataforma compacta para pruebas de toxicidad de algas de productos químicos regulares que cumplen con las directrices internacionales estandarizadas. Además, la configuración proporciona una plataforma robusta para el ensayo de sustancias difíciles que interfieren con el paso de la luz hacia el algas, como nanomateriales o sustancias de color.

a-small-scale-setup-for-algal-toxicity-testing-nanomaterials-other

Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

Este estudio se refiere al desarrollo y la estandarización de un protocolo metodológico para determinar el valor a largo plazo (14 días) toxicidad letal ejercida por las sustancias químicas, aguas residuales industriales o de aguas residuales y líquidos de muestras ambientales en el crustáceo de agua...

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

El objetivo de este procedimiento es demostrar la reproducibilidad y adaptabilidad del uso de un formato de placa de microtitulación para el cribado de microalgas. Este cribado rápido combina la fluorometría WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) para medir el rendimiento fotosintético como indicador de la salud del Fotosistema II (PSII) con cocultivos de bacterias y algas de pequeño volumen.

Un ensayo biológico Volumen pequeños para evaluar bacteriana / fitoplancton Co-cultura Usando AGUA-Pulse-Amplitud Modulada (AGUA-PAM) Fluorometría

La integración del cultivo de microalgas con los gases de combustión industriales introducirá en última instancia metales pesados y otros compuestos inorgánicos en los medios de crecimiento. Este estudio presenta un procedimiento utilizado para determinar el destino final y el impacto de los metales pesados y contaminantes inorgánicos en el crecimiento de Nannochloropsis salina cultivada en fotobiorreactores.

La cuantificación de los metales pesados ​​y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

Las etapas embrionarias son las más susceptibles a los xenobióticos. Aunque la toxicidad química depende de la salinidad, no existe ningún método para probar la dependencia de la salinidad de la toxicidad para los organismos acuáticos. Aquí, describimos un método nuevo y de alto rendimiento para determinar la dependencia de la salinidad de la toxicidad para los embriones acuáticos.

Ensayo de toxicidad dependiente de la salinidad del Plata nanocoloides Usando Medaka huevos

Este manuscrito describe cómo preparar biochips fluídicos con células epiteliales branquiales de trucha arco iris para su uso en un sensor de impedancia de sustrato de celda eléctrica portátil de campo.  También se describe el protocolo para realizar una prueba rápida de toxicidad del agua potable con el sensor.

Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

Una metodología experimental se presenta para comparar el rendimiento de los pequeños (100 L) y grandes (1,000 L) escala reactores diseñados para la remediación de las algas de las aguas residuales vertedero. Características del sistema, incluyendo el área de superficie a volumen, tiempo de retención, la densidad de la biomasa, y concentraciones de alimentación de aguas residuales, se pueden ajustar sobre la base de aplicación.

La comparación de la escala en un sistema de reactor fotosintética de las algas Saneamiento de Aguas Residuales

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la dispersión de los nanomateriales en medio acuoso con la caracterización en tiempo real para identificar las condiciones óptimas de la sonicación, intensidad y duración para mayor estabilidad y uniformidad de nanopartículas dispersiones sin afectar la integridad de la muestra.

Dispersión de los nanomateriales en medios acuosos: hacia la optimización del Protocolo

Aquí, presentamos un protocolo para construir laboratorio burbuja columna fotobiorreactores y usarlos para cultivo de microalgas. También proporciona un método para la determinación de la tasa de crecimiento del cultivo y el contenido de lípidos neutros.

Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

El cultivo axiónico a escala de banco facilita la caracterización microalgal y la optimización de la productividad antes del posterior escalado del proceso. Los fotobiorreactores proporcionan el control necesario para experimentos microalgas fiables y reproducibles y se pueden adaptar para cultivar de forma segura microalgas con los gases corrosivos (CO2, SO2,NO2) de las emisiones de combustión municipal o industrial.

Cultivo de microalgas y cuantificación de biomasa en un fotobiorreactor a escala de banco con gases de combustión corrosivos

Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Este trabajo tiene como objetivo evaluar y revisar el procedimiento de bioensayo de letalidad de Artemia salina , también identificado como ensayo de letalidad de camarones en salmuera. Este método simple y barato proporciona información sobre la toxicidad general (considerada como una evaluación preliminar de la toxicidad) de las muestras, es decir, los productos naturales.

Bioensayo de letalidad utilizando Artemia salina L.

Aprende a utilizar la plataforma LEVITATT para pruebas de toxicidad de algas con nanomateriales y sustancias difíciles. Este método emplea iluminación LED para minimizar el calor y garantizar un campo de luz uniforme durante el ensayo.

Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles

Explorar más videos