Name: Medición de la confluencia de iPSCs utilizando un sistema automatizado de imágenes. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprende a medir la confluencia de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando un sistema de imágenes automatizado. Este método evalúa diferentes recubrimientos de matriz extracelular para optimizar el crecimiento celular.

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El estudio fue apoyado por subvenciones de la Fondazione Bambino Gesù y Ricerca Corrente (Ministerio de Salud italiano) a C.C.  Nos gustaría agradecer al Dr. Enrico Bertini (Departamento de Neurociencia, Unidad de Enfermedades Neuromusculares y Neurodegenerativas, Laboratorio de Medicina Molecular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù), Dr. Stefania Petrini (Centro Central de Microscopía Confocal, Laboratorios de Investigación, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Departamento de Oncohematología, Terapia Génica y Celular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù) y Roberta Ferretti (Departamento de Oncohematología, Terapia Génica y Celular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù) para discusiones científicas y ayuda técnica. Maria Vinci recibió una "beca para niños con cáncer del Reino Unido".

1. Recubrimiento de placas de 96 pozos
NOTA: Se probaron diferentes recubrimientos en la misma placa pero en pocillos separados (consulte el Archivo suplementario).
<ol><li>Diluir el Matrigel 1:100 en DMEM. Añadir 100 μL por pocillo a las placas de 96 pocillos e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Después de esto, retire la solución y lave los pocillos con 100 μL de DMEM dos veces.</li>
	<li>Laminina diluida (20 μg/mL, LN-521) en PBS (con calcio y magnesio). Añadir 100 μL al pozo e incubar a 4 °C durante la noche. Al día siguiente realizar dos lavados con DMEM antes de sembrar las células.</li>
	<li>Vitronectina diluida (10 μg/mL) en tampón de dilución. Agregue 100 μL por pocillo a la placa de 96 pocillos e incube durante 1 hora a temperatura ambiente. Lave los pocillos con PBS (sin calcio y magnesio) antes de colocar las células.</li>
	<li>Diluir HU-fibronectina (30 μg/mL) en ddH2O. Añadir 100 μL a los pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de esto, lave los pocillos con el medio antes de sembrar las células.</li>
</ol>2. Mantenimiento de iPSCs en cultivo
NOTA: Las iPSC se compraron comercialmente. Las iPSCs se derivaron de fibroblastos humanos sanos y se reprogramaron utilizando tecnología episomal.
<ol><li>Desde el congelador de -80 °C o nitrógeno líquido, descongelar las iPSC criopreservadas en un baño maría a 37 °C. Limpie el vial que contiene las células con etanol al 70% antes de moverlo al gabinete de seguridad biológica.</li>
	<li>Agregue la suspensión celular a 5 ml de medios de cultivo celular precalentados (p. ej., mTeSR1) gota a gota con una pipeta de 1000 μL en un tubo cónico estéril de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar las células a 304 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Retire el medio y vuelva a suspender el pellet celular en 4 ml de medio de cultivo celular.</li>
	<li>Colocar la suspensión celular en dos pocillos de las placas de 6 pocillos (105 iPSCs por placa de cultivo celular de 6 pocillos), donde los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) han sido chapados previamente. Semillas MEFs dos días antes de emplatar iPSCs a una densidad de 2.4 x 104/cm2 en DMEM (que contiene 10% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina).</li>
	<li>Después de la siembra, complemente los medios celulares con 10 μM del inhibidor de ROCK Y-27632.</li>
	<li>Cultive las iPSC en MEF durante las primeras 4-5 semanas y luego en condiciones libres de alimentador (condición libre de MEF), utilizando uno de los recubrimientos de interés (consulte el paso 1 y la Tabla 1) en mTeSR1.</li>
	<li>Cuando las iPSCs son 70-80% confluentes, paso 1:4 usando 0,5 mM de tratamiento EDTA durante 3-5 min a RT. Añadir 1 mL de 0,5 mM EDTA para una placa de 6 pocillos (o cantidades proporcionales para otros tipos de placas). Transferir a nuevos pozos en condiciones libres de alimentadores e incubar a 37 °C, 5% CO2, 20%O2.</li>
	<li>Cambie el medio con mTeSR1 nuevo todos los días y divida las celdas cada 2 días.</li>
</ol>3. Caracterización de la confluencia celular
<ol><li>Use 96 placas de pocillos para los experimentos.</li>
	<li>Sembrar 10,000 células por pocillo después de al menos 1 mes de cultivo en condiciones libres de alimentador para asegurarse de que los MEF no fueron pasados. Use portaobjetos de conteo desechables para contar las células con el microscopio óptico.</li>
	<li>Realizar los experimentos por triplicado. Por lo tanto, pruebe cada condición de siembra en tres pozos.</li>
	<li>Realice la adquisición automatizada de imágenes desde el día 1 después de la siembra utilizando un citómetro en modo de campo claro. Realice la adquisición automatizada de imágenes cada 24 h durante 5 días. Para obtener información detallada sobre los parámetros experimentales, consulte el Archivo complementario.</li>
	<li>Utilice el contraste automático y la exposición automática para visualizar mejor las células.</li>
	<li>Establezca la configuración de análisis (consulte Archivo suplementario) para el análisis de confluencia para aplicar una máscara de 60%, 80% y 100% por pozo, con el fin de evaluar los cambios de enfoque debidos a la refracción de la luz en el borde de los pozos. Utilice la configuración de análisis de máscara diferente mencionada anteriormente para analizar la confluencia celular en cada punto de tiempo.</li>
</ol>4. Análisis estadísticos
<ol><li>Reporte los resultados cuantitativos como medias ± error estándar de la media (SEM).</li>
	<li>Para comparar las diferencias generales de las diferentes condiciones de recubrimiento, obtenga datos utilizando las mismas muestras y realice la prueba t de muestra pareada de Student. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos, y todos los valores de p informados son bilaterales.</li>
</ol>5. Caracterización de los microfilamentos citoesqueléticos
<ol><li>Fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA al 4%) en PBS durante 10 min en RT, seguido de dos lavados en PBS (10 min en total).</li>
	<li>Añadir 100 μL de solución de bloqueo (compuesta por 5% BSA, 0,1% Triton en PBS) a cada pocillo durante 1 h a RT.</li>
	<li>Retire la solución de bloqueo y lave las muestras dos veces con PBS durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 100 μL de la solución de trabajo conjugada con faloidina por muestra e incubar durante 1 h a RT.</li>
	<li>Lave las células dos veces con PBS (10 min en RT).</li>
	<li>Núcleos de tinción con Hoechst 33342 diluidos 1:10000 en PBS durante 10 min a RT.</li>
	<li>Retire la solución de Hoechst y lave las células dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez.</li>
	<li>Lave la muestra conH2Oy deje secar bajo una campana química.</li>
	<li>Añadir 100 μL de medios de montaje (es decir, PBS:glicerol, 1:1) para cubrir las células y preservar la fluorescencia de las muestras.</li>
	<li>Observe la celda a Ex/Em 493/517 nm en un microscopio confocal de barrido láser equipado con una fuente láser de luz blanca (WLL) y un láser de diodo de 405 nm. Adquiera imágenes confocales secuenciales utilizando un objetivo de inmersión en aceite HC PLAPO 40x. Utilice la misma potencia láser, divisores de haz, ajustes de filtro, diámetros de agujero de alfiler y modo de escaneo para todas las muestras examinadas.</li>
</ol>

<ol><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li>
<li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li>
<li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li>
<li>Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li>
<li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li>
<li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li>
<li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li>
<li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2%2B+induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li>
<li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+%26+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li>
<li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight%2C+cell+surface-associated+glyco-protein+%28fibronectin%29+lost+in+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+fibrillogenesis%2C+a+cell-mediated+matrix+assembly+process%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li>
<li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibrillogenesis%3A+fibronectin%2C+integrins%2C+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li>
<li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de iPSCs para el modelado de enfermedades y el futuro cribado de fármacos junto con su posible aplicación en medicina de precisión lo convierte en una tecnología de gran relevancia y por esta razón creemos que es necesario entender claramente la condición de cultivo in vitro que mejor se asemeja a la situación fisiológica de las células madre embrionarias. En este contexto, probamos diferentes recubrimientos ECM utilizando iPSC de tipo salvaje para comprender las condiciones que permiten que las células permanezca...

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se obtienen de células somáticas y se pueden diferenciar en diferentes tipos de células. A menudo se utilizan como un sistema para modelar la patogénesis de la enfermedad o realizar la detección de drogas, y también ofrecen el potencial de ser utilizados en el contexto de la medicina personalizada. Dado que las iPSC tienen un gran potencial, es importante caracterizarlas completamente para su uso como un sistema modelo confiable. Anteriormente mostramos la importancia de cultivar iPSCs en un ambiente hipóxico, ya que estas células dependen de la glucólisis y un ambiente aeróbico puede causar desequilibrio redox1. Las iPSC también son vulnerables a otras condiciones de cultivo, particularmente al entorno extracelular. La optimización de las condiciones de cultivo es un tema clave para mantenerlas sanas y proliferantes. Un cultivo saludable de iPSC conducirá a células sanas diferenciadas que generalmente son el punto final del modelo utilizado para comprender las características moleculares, celulares y funcionales de trastornos humanos específicos o procesos celulares.
En este estudio, se ha utilizado un protocolo simple para probar la confluencia de iPSCs utilizando diferentes condiciones de recubrimiento en pozos separados. Las iPSC requieren una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) para adherirse correctamente, pero la coexistencia de iPSCs y MEF dificulta la realización de análisis como ARN o extracción de proteínas, ya que hay dos poblaciones de células. Para evitar la capa de alimentación, se han utilizado diferentes proteínas pertenecientes a la matriz extracelular (ECM) para recrear el nicho celular natural y tener un cultivo de iPSC libre de alimentador. En particular, Matrigel es una preparación solubilizada de membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que está enriquecida en proteínas de la matriz extracelular (es decir, laminina, colágeno IV, proteoglicanos de heparán sulfato, entactina/nidógeno y factores de crecimiento)2,3. Las otras condiciones de recubrimiento utilizadas son, en cambio, proteínas purificadas con relevancia conocida en la construcción de las ECM: se sabe que la laminina-521 es secretada por células madre pluripotentes humanas (hPSC) en la masa celular interna del embrión y es una de las lamininas más comunes en el cuerpo después del nacimiento 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectina es una matriz de cultivo celular libre de xeno-conocida por apoyar el crecimiento y la diferenciación de hPSC 12,13,14,15,16; La fibronectina es una proteína ECM importante para el desarrollo de vertebrados y la unión y mantenimiento de células madre embrionarias en estado pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Dado que existen diferentes condiciones de recubrimiento, las comparamos en términos de su efecto sobre la confluencia de las iPSC.

<table><tbody><tr><td>Pipetas serológicas Stripette de 10 mL, poliestireno, envueltas individualmente en papel/plástico, estériles</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>Tool</td></tr><tr><td>Tubos centrífugos cónicos de polipropileno (PP) de alta claridad de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Tool</td></tr><tr><td>1x PBS (con Ca2+; Mg2+)</td><td>Thermofisher</td><td>14040133</td><td>Medium</td></tr><tr><td>1x PBS (sin Ca2+; Mg2+)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Medium 5 mL Stripette Pipetas serológicas, poliestireno, envueltas individualmente en papel/plástico, estériles</td><td>Herramienta Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de cultivo celular, 96 pocillos, PS, F-Bottom</td><td>Soporte Greiner Bio One</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular, 6 pocillos</td><td>Soporte</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Costar 3516DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucosa)</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td>Medio</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED4SS-500g</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Epi Episomal iPSC</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td></tr><tr><td>FAST - READ 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>Tool</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>Medio</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Merck</td><td>FC010</td><td>Recubrimiento</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>H2O</td><td></td><td>MILLIQ</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher</td><td>33342</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Laminina 521</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>77003</td><td>Recubrimiento</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td></td><td>LS25030081 Reactivo</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Matrigel Recubrimiento de 354277 de matriz con certificación hESC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td><td>Life Technologies</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento MTESR1 Medio</td><td>Tecnologías de células madre 85851</td><td></td><td>Medio</td></tr><tr><td>MTESR1 Suplemento Tecnologías</td><td>de células madre</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>Medio Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Faloidina</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>7180</td><td>Recubrimiento</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Reactivo</td></tr></tbody></table>

medición de la confluencia de ipscs utilizando un sistema automatizado de imágenes.

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Este estudio se centra en comprender cómo el cultivo de iPSC en diferentes sustratos de recubrimiento ECM puede afectar la confluencia celular. Se ha establecido un protocolo para evaluar la confluencia de iPSC en tiempo real sin necesidad de contar células en suspensión unicelular para evitar cualquier perturbación del crecimiento. Se utilizó un sistema de análisis de imágenes de alto contenido para evaluar la confluencia de iPCS en 4 ECM diferentes a lo largo del tiempo de manera automatizada. Se utilizaron diferentes entornos de análisis para evaluar la confluencia celular de las iPSCs adherentes y solo se observó una ligera diferencia (a las 24 y 48 horas con laminina) si se aplicó una máscara al 60, 80 o 100%. También mostramos que la laminina conduce a la mejor confluencia en comparación con Matrigel, vitronectina y fibronectina.

En este estudio, investigamos la confluencia de iPSCs cuando se cultivan en diferentes condiciones de recubrimiento. Usando un citómetro, pudimos obtener resultados fácilmente informativos en triplicados en 5 días. Dado que las iPSC apenas se adhieren a recipientes de plástico y es necesario un recubrimiento para apoyar su proliferación, decidimos monitorear la confluencia de iPSCs humanas, ya que es indicativo de la salud del cultivo celular y puede reflejar su potencial de diferenciación. Después de la expansión in vit...

El objetivo del protocolo es comparar diferentes condiciones de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) para evaluar cómo el recubrimiento diferencial afecta la tasa de crecimiento de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En particular, nuestro objetivo es establecer las condiciones para obtener un crecimiento óptimo de los cultivos iPSC.

Medición de la confluencia de iPSCs utilizando un sistema automatizado de imágenes.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Este protocolo es importante porque permite una evaluación rápida de la confluencia inducida de células madre pluripotentes en diferentes sustratos de recubrimiento de matriz extracelular en tiempo real. La principal ventaja de este protocolo es que no requiere el recuento de suspensiones de una sola célula, lo que evita la perturbación del crecimiento de las iPSC, que son sensibles al paso. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Valentina Magliocca, postdoc de mi laboratorio.Para configurar placas recubiertas de matriz de membrana basal, diluya la matriz de membrana basal, establezca una proporción de 1 a 100 en DMEM y agregue 100 microlitros de la solución resultante a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Cuando se hayan codificado todos los pocillos, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante una hora. Al final de la incubación, deseche la solución de matriz de membrana basal y lave cada pocillo dos veces con 100 microlitros de DMEM fresco por pocillo.Para configurar placas recubiertas de laminina, diluya 20 microgramos por mililitro de laminina en PBS con calcio y magnesio, y agregue 100 microlitros de la solución de laminina a cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, incubar la placa a cuatro grados centígrados durante la noche antes de lavar los pocillos dos veces con DMEM fresco, como se ha demostrado. Para configurar placas recubiertas de vitronectina, diluya 10 microgramos por mililitro de vitronectina en tampón de dilución y agregue 100 microlitros de tampón a cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos.Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, lavar los pocillos con 100 microlitros de PBS sin calcio y magnesio por pocillo. Para preparar placas recubiertas de fibronectina humana, diluya 30 microgramos por mililitro de fibronectina en agua bidestilada y agregue 100 microlitros de la solución de fibronectina a cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos. Después de una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente, lave los pocillos con DMEM fresco como se demuestra.Dos días antes de establecer un cultivo de iPSC, siembre fibroblastos embrionarios de ratón a una densidad de 2,4 por 10 a un cuarto de centímetro cuadrado en un medio de cultivo celular completo en cada una de las dos placas de cultivo celular de seis pocillos, y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular. Para establecer un cultivo de iPSC, caliente una solución madre de iPSC criopreservadas en un baño de agua a 37 grados Celsius. Cuando las células se hayan descongelado, limpie el vial con etanol al 70% y colóquelas en un gabinete de seguridad biológica.Con una pipeta de 1000 microlitros, transfiera las células gota a gota a un tubo cónico estéril de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medio de cultivo celular precalentado. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros de medio de cultivo celular fresco. A continuación, coloque la placa de 1 por 10 a la quinta célula en cada uno de los dos pocillos de las placas de seis pocillos sembradas con fibroblastos embrionarios de ratón.Después de la siembra, complemente los cultivos celulares con 10 micromolares del inhibidor de ROCK Y-27632 y coloque las placas en la incubadora de cultivos celulares durante cuatro a cinco semanas. Cuando las células alcancen un 70 a 80% de confluencia, trate cada cultivo con un mililitro de EDTA de 0,5 milimolares durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente. Cuando las células se hayan desprendido, divida las células en una proporción de uno a cuatro en un medio de cultivo celular fresco y coloque las células en cada uno de los cuatro pocillos restantes de la placa de seis pocillos en condiciones sin alimentador.A continuación, devuelva las placas a la incubadora de cultivos celulares. Para evaluar los efectos de los diferentes recubrimientos en la confluencia celular después de al menos un mes de cultivo en condiciones sin alimentador, utilice portaobjetos de recuento desechables para contar las células de cada cultivo utilizando una cámara de recuento. Diluya las células de una por 10 a la cuarta celda por cada 200 microlitros de concentración media, y siembre las células por triplicado en cada uno de los tres pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta de recubrimiento por condición.Cuando se hayan sembrado todas las células, colóquelas en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente y todos los días durante los cinco días siguientes, realice imágenes automatizadas de las células utilizando los ajustes de contraste automático y exposición automática para una visualización óptima. Para evaluar los cambios de enfoque debidos a la refracción de la luz en el borde de los pocillos, establezca la configuración de análisis en análisis de confluencia para aplicar una máscara de 60, 80 o 100% por pocillo, y utilice los diferentes ajustes de análisis de máscara para analizar la confluencia de células en cada punto de tiempo.Para comparar las diferencias generales de las diferentes condiciones de codificación, utilice los datos de la muestra para realizar la prueba T de la muestra emparejada del estudiante, informando los resultados cuantitativos como los cambios medios en la confluencia, más o menos el error estándar de la media. Para la caracterización de los microfilamentos del citoesqueleto, primero se fijen las células con 100 microlitros de paraformaldehído al 4% en PBS por pocillo durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados de 10 minutos en 200 microlitros de PBS por lavado. Transfiera el cubreobjetos previamente colocado de la placa al portaobjetos del microscopio.Añadir 100 microlitros de suero bovino al 5% y Tritón al 0,1% en PBS a cada pocillo durante una hora a temperatura ambiente para bloquear cualquier unión inespecífica, y lavar las muestras con dos lavados de PBS de 10 minutos como se ha demostrado. Después del segundo lavado, agregue 100 microlitros de solución de trabajo conjugada de faloidina por muestra para una incubación de una hora a temperatura ambiente, seguida de dos lavados de 10 minutos en PBS. A continuación, tiña los núcleos con Hoechst 33342 diluido a una concentración de uno a 10.000 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados con PBS.Después del segundo lavado, enjuague las celdas con agua y deje que las placas se sequen bajo una capucha química. Cuando el cubreobjetos de vidrio se haya secado, cubra las celdas con 100 microlitros de un medio de montaje apropiado por pocillo y ubique las celdas en un microscopio confocal de barrido láser equipado con una fuente de láser de luz blanca y un láser de diodo de 405 nanómetros en las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas. A continuación, seleccione el objetivo de inmersión en aceite de 63x y adquiera imágenes confocales secuenciales de las células.La tinción con faloidina permite visualizar el grado de adhesión celular a la superficie de un recipiente y, en concreto, el recubrimiento utilizado para el recipiente. Las células que se adhieren a un recubrimiento muestran microfilamentos citoesqueléticos claramente visibles en lugar de microfilamentos colapsados. Las imágenes de campo claro también permiten obtener imágenes del nivel de adhesión de las iPSC a las superficies recubiertas.Las iPSC sembradas en laminina demuestran una alta tasa de proliferación celular de forma lineal a lo largo del tiempo en comparación con otros recubrimientos. Las células sembradas en la matriz de la membrana basal, la vitronectina y la fibronectina humana, por el contrario, exhiben una tasa de proliferación lineal en las primeras 96 horas con una pendiente mayor en la curva de confluencia durante las últimas 24 horas, independientemente de la máscara utilizada. Como la diferencia inicial a las 24 horas para los diferentes recubrimientos puede deberse a diferencias en la adhesión de las células, el crecimiento de las células se puede normalizar a los datos de 24 horas para los puntos de tiempo posteriores.Como se observó, no existen diferencias en términos de confluencia entre los diferentes recubrimientos, lo que sugiere que las diferencias observadas dentro de los cultivos recubiertos de laminina probablemente se deban a una mayor capacidad de las iPSC para adherirse a este recubrimiento cuando se pasan. Este estudio puede contribuir al desarrollo de metodologías estandarizadas para el cultivo de iPSCs, y puede ayudar en su posible uso futuro en clínicas. Actualmente estamos investigando la biología de los principales receptores de la superficie celular que median los contactos célula-ECM y que pueden ser responsables del mantenimiento de su capacidad de autorrenovación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Presentamos un sistema de introducción de muestras de gotas discreto para la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Se basa en un chip microfluídico barato y desechable que genera gotitas altamente monodispersas en un intervalo de tamaños de 40-60 micras, con frecuencias de 90 a 7000 Hz.

Un chip de microfluidos para ICPMS Introducción Muestra

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada...

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

En este trabajo se proporciona una guía práctica, describiendo los diferentes pasos para establecer el acoplamiento de los sistemas SMPS e ICPMS, y cómo usarlos. Se presentan tres ejemplos descriptivos.

Una guía práctica sobre el acoplamiento de un medidor de movilidad de barrido y espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente (SMPS-ICPMS)

Anticuerpos que se unen a los receptores de blanco en la superficie celular pueden conferir conformación y alteraciones clustering. Estos cambios dinámicos tienen implicaciones para caracterizar el desarrollo de fármacos en las células diana. Este protocolo utiliza la microscopia confocal y espectroscopia de la correlación de imagen a través de ImageJ/FIJI para cuantificar el grado de agrupamiento en la superficie celular del receptor.

Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

Aquí presentamos una guía práctica de la construcción de un sistema de microscopía integrado, que combina la proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, proyección de imagen de una sola molécula basada en la detección de súper resolución y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de una sola molécula la proyección de imagen, en una puesta en marcha de una manera costo-eficiente.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Presentamos un protocolo para la detección óptica en tiempo real de las proteínas solo como se secretan de las células vivas. Esto se basa en Microscopia interferométrica dispersión (iSCAT), que puede ser aplicada a una variedad de configuraciones y sistemas biológicos diferentes.

Etiqueta-libre la proyección de imagen de solo proteínas secretada desde las células viven por medio de la iSCAT microscopía

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio usando microscopía de alta resolución, herramientas computacionales y etiquetado de una sola célula en los embriones vivos de C. elegans para entender la dinámica de una sola célula durante el neurodesarrollo.

Microscopía de lámina de luz isotrópica y análisis de linaje celular automatizado para catalogar Caenorhabditis elegans embriogénesis con resolución subcelular

La formación de una red adecuada de sarcomere es importante para la maduración de los cardiomiocitos derivados del iPSC. Presentamos un enfoque basado en la super resolución que permite la evaluación cuantitativa de la maduración estructural de los cardiomiocitos derivados de células madre, para mejorar las condiciones de cultivo promoviendo el desarrollo cardíaco.

Análisis de la red α-Actinin en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC mediante microscopía de localización de molécula única

Presentamos un método para la adquisición de cursos de tiempo reportero de fluorescencia de células individuales utilizando matrices micropatterned. El protocolo describe la preparación de matrices unicelulares, la configuración y el funcionamiento de la microscopía de lapso de tiempo de barrido de células vivas y una herramienta de análisis de imágenes de código abierto para la preselección automatizada, el control visual y el seguimiento de los cursos de tiempo de fluorescencia integrados en...

Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular

Aprende a medir la confluencia de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando un sistema de imágenes automatizado. Este método evalúa diferentes recubrimientos de matriz extracelular para optimizar el crecimiento celular.

Medición de la confluencia de iPSCs utilizando un sistema automatizado de imágenes.

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