Evaluación de la estructura ocular global después del vuelo espacial mediante un método de imagen de tomografía microcalculable (Micro-CT)

Aquí proponemos un método para la evaluación de la estructura ocular global después de los rayos espaciales utilizando el método de imagen de tomografía micro-ordenador. El entorno de los tornillos espaciales, que incluye la paragravitación y la exposición a la radiación, provoca cambios únicos en la fisiología humana, incluidos los cambios de fluidos. Estos cambios de fluidos conducen a una presión intracraneal elevada y se ha atribuido como una causa importante del síndrome neurootoo ocular asociado a los rayos espaciales.

El impacto fisiológico del SANS afecta a múltiples componentes del ojo e incluye edema de disco óptico, aplanamiento del globo, pliegues coroidales y retinales, cambios de error hiperópicos y refractivos, e infracciones de la capa de fibra nerviosa. Si bien las características fisiológicas de SANS están bien documentadas, los mecanismos que impulsan el SANS todavía se entienden mal. Con el fin de tener una mejor comprensión de SANS, los modelos de roedores se están utilizando para técnicas de diagnóstico por imágenes no invasivas.

Una de estas técnicas es la micro-CT, que se ha utilizado con éxito para la evaluación de estructuras anatómicas y procesos patológicos en animales tan pequeños como ratones. Micro-CT puede lograr una resolución de tamaño micro, y a través de la combinación con un agente de contraste, puede proporcionar un buen contraste para los tejidos blandos. Micro-CT proporciona una clara ventaja en comparación con los métodos tradicionales, incluyendo la anatomía bruta, la microscopía de luz y el examen de histología para no causar daño al perfil geométrico de los especímenes y las relaciones espaciales entre las estructuras.

En nuestro estudio actual, los ratones estuvieron expuestos al ambiente espacial durante 35 días a bordo de la Estación Espacial Internacional para determinar si el entorno espacial induce daño ocular mediante la cuantificación de la microestructura de las capas de retina, RPE y coroides mediante Micro-CT. Aquí hemos demostrado cómo hemos preparado muestras para el análisis de Micro-CT. Se utilizaron ratones y ojos dentro de 38 más o menos cuatro horas después de salpicaduras hacia abajo.

Los ojos estaban enucleados, y los ojos izquierdos se fijaron en cuatro por ciento de paraformaldehído y tampones de fosfato salino durante 24 horas. Después de la fijación, los ojos se deshidrataron en etanol. Para evitar una contracción más y abrupta de la muestra fija, se utilizó una serie de soluciones etanoicas calificadas.

En primer lugar, las muestras se transfirieron al 50% de etanol durante una hora y luego aumentaron las concentraciones durante una hora cada, 70, 80, 90, 96 y 100%Después, los ojos se teñieron con un 10% de peso por volumen de ácido fosfolípido durante seis días. Finalmente, las muestras se lavaron en etanol absoluto y luego se colocaron en dos recipientes de plástico de molino individuales llenos de etanol absoluto para escanear. También se añadió una almohadilla de algodón para estabilizar la muestra durante el escaneo.

A continuación, la muestra se colocó dentro de un escáner SkyScan 1272 de sistema de rayos X de escritorio SkyScan 1272 para evaluar el daño de la retina. Para escanear, utilizamos el software SkyScan 1272. Después de abrir el software, centramos nuestra muestra en el marco.

En nuestro protocolo, no usamos ningún filtro y establecemos la matriz para aumentar el tamaño del píxel a cuatro micras. El microposicionamiento se utiliza para mantener la muestra centrada en el marco. A continuación, comprobamos los parámetros para maximizar el agente de contraste dentro de nuestra muestra y calibrar la máquina.

Para realizar la calibración, eliminamos la muestra del escáner y establecemos los parámetros de escaneo. Durante la calibración, también se comprueba una corrección de llenado plano. Debe ser superior al 80%Después de las calibraciones, la muestra se reinserta en la cámara de escaneo.

Antes de escanear, se denominan los archivos de ejemplo. Los parámetros de escaneado son los siguientes, paso de rotación 0.4, fotogramas cuatro, movimiento aleatorio 30, comprobación doble de que el tamaño de píxel se establece en 4 micras. A continuación, se inicia la exploración.

Después de escanear, NRecon se utiliza para reconstruir la muestra. En primer lugar, abrimos los archivos desde el escaneo y vemos las imágenes de escaneo sin procesar. Ajustamos el rebote del histograma para que quepa dentro de la curva.

A continuación, corregimos el artefacto de endurecimiento de la viga. Luego ajustamos el artefacto de suavizado. Finalmente, corregimos para la reducción del artefacto del anillo.

Después de todas las correcciones, confirmamos que nuestras muestras encajan dentro de nuestra región de interés. Entonces podemos comenzar la reconstrucción. Utilizamos el software DataViewer para visualizar las imágenes reconstruidas en los tres campos.

Para el análisis, se utiliza el software CTAn. Las imágenes reconstruidas se cargan en el software. El nervio óptico se utilizó para deiminar la región de interés para el análisis.

Por cálculo, usamos la parte media de la región de interés para realizar todas las mediciones para el análisis. Se tomaron tres mediciones repetidas para calcular la medición lineal del área. Se tomaron las siguientes mediciones para los tejidos oculares, la retina, el RPE, la coroides y nuestro análisis de Micro-CT mostraron que las áreas de sección transversal de la retina, el RPE y la capa de coroides eran significativamente más bajas en las muestras de vuelo espacial en comparación con los controles del suelo.

Micro-CT proporciona técnicas eficientes y no destructivas para calcular el tamaño de los cambios sin ninguna manipulación. Mediante el uso de agente de contraste, mejora la calidad de las imágenes Micro-CT, que nos ayudan a obtener una imagen gráfica clara y exitosa de la reconstrucción sin la interetil estructura de la muestra. Además, muestra que en los datos originales es digitalmente, aumentando así la accesibilidad y reproducibilidad de los hallazgos.

Además, para el propósito básico, es aceptable utilizar mediciones tridimensionales, pero la segmentación de la estructura tridimensional bruta puede ser beneficiosa para proporcionar un esquema específico de todo el espécimen. Nuestros resultados indican que las condiciones del vuelo espacial, especialmente los cambios gravitacionales, pueden inducir una respuesta aguda y a corto plazo en el ojo. Además, el trabajo futuro debe utilizar datos volumétricos para realizar otros análisis que aprovechen las capacidades de imágenes de Micro-CT, ya que se ha utilizado con éxito para el estudio de muchos tejidos normales y patéticos.