Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular
June 18th, 2020
Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.
Los evaluadores de protocolo actuales en textil, redox estado cambios de una manera intracelular compartimiento-específica. Nuestro protocolo permite una mejor comprensión y seguimiento de todos los mecanismos fisiológicos o fisiopatológicos del estrés oxidativo. Esta técnica permite la cuantificación no disruptiva de la relación de sulfuro ocular en mosaico en celdas intactas utilizando una salida métrica de relación para contrarrestar las diferencias entre los niveles de expresión de señal, el blanqueo fotográfico y las sensibilidades de detección.
Este protocolo se puede aplicar a varios organismos, incluidas las bacterias de las plantas. En el primer día del experimento tratar las células de una línea de células de cáncer de mama confluente durante dos minutos, con dos mililitros de 0.2, 5% viajes en EDTA. Cuando las células comienzan a desprenderse detienen la reacción con seis mililitros de medio completo y sedimentan las células por centrifugación.
Re suspenda el pellet en cinco mililitros de medio fresco y completo, cuente las células y diluya a 1,5 veces 10 a las quintas células por mililitro de medio completo. Luego se siembra 1.5 veces 10 a las quintas células por mililitro de células por pozo en una placa de 6 pozos, e incubar las células en la incubadora de cultivo celular durante la noche. O no agregue ninguna transducción de GFP de fila viral.
A la mañana siguiente, agregue 12,5, 25 y 50 microlitros de uno a 100 diluidos seis veces 10 a las unidades formadoras de placa 10 por mililitro de no añadir ninguna solución viral de Erode GFP, en medio completo. Añadir que a los pozos apropiados o la placa de 6 pozos para transducir las células con 50, 100 y 200 multiplicidades de infección, respectivamente. Cuando todos los pozos de muestra se hayan transducido con virus, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 16 a 24 horas.
Al día siguiente, visualice las células por microscopía de fluorescencia y reemplace el sobrenadante por medio, sin virus para permitir que las células se recuperen durante 24 horas adicionales. Para determinar la eficiencia óptima de la transducción, evalúe la intensidad de fluorescencia y la morfología de las células por citometría de flujo. Asegúrese de llevar a cabo todos los procedimientos que pueden causar infección por aerosoles o salpicaduras dentro de un gabinete de seguridad biológica certificado de nivel dos.
Para evaluar el estado redox de las células, a la mañana siguiente, incubar las células y los Wells apropiados de la placa de 6 pozos con 10 peróxido de hidrógeno micromolar durante una hora, antes de separar las células con 750 microlitros de 0,2 5% gotea en EDTA por pozo, como se ha demostrado. Detenga la reacción con dos mililitros de medio completo por pozo y tire de los sobrenadantes para cada condición en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Sedimentar las células por centrifugación y lavar los pellets en 500 microlitros de PBS por pozo por centrifugaciones dos veces.
Después del segundo lavado, filtre las suspensiones celulares a través de mallas de 40 micrometro en tubos compatibles con citometría de flujo sobre hielo, protegidos de la luz. En el software del citometro flow, ejecute la muestra de control de infección de la multiplicidad cero. Luego analice el peróxido de hidrógeno y las células no tratadas.
Permitirá calcular la relación de intensidad fluorescente media entre las formas oxidadas frente a las reducidas de la GFP de fila, utilizando la fórmula como se indica. Aquí está la estrategia de medición para seleccionar un gran número de celdas por citometría de flujo se muestra. La citometría de flujo también se puede utilizar para determinar la curva de respuesta a la dosis para el análisis de GFP de fila y la multiplicidad más eficiente de entrada de infección.
Según la multiplicidad de infección, curva de respuesta a la dosis en este análisis representativo, una multiplicidad de 200 de infección dio la mayor expresión de GFP en carretera, pero la morfología celular se realizó sugiriendo citotoxicidad. Por lo tanto, se determinó que la eficiencia óptima de transducción era una multiplicidad de infección de 100. En este análisis de estado redox, se obtuvieron intensidades de fluorescencia medias de GFP oxidadas y reducidas a partir del análisis de citometría de flujo para vehículos y cuatro tratamientos de peróxido de hidrógeno de control positivo micromolar de 10 micromolares.
Los histogramas superpuestos representan los cambios en el número de células en los 10 grupos de peróxido de hidrógeno micromolar y grupos tratados con vehículos o GFP de eyúdido reducido y oxidado. El cálculo de la relación entre el GFP de fila oxidado y reducido para este análisis reveló que el peróxido de hidrógeno micromolar 10 causó un aumento triple en la oxidación de la GFP de fila en comparación con el tratamiento del vehículo. Tener números de celda precisos es importante para los cálculos de RMN y la reproducibilidad.
Con el fin de tener resultados reproducibles, los investigadores deben mezclar a fondo las soluciones antivirales para obtener suspensiones homogéneas. Este protocolo permite a los investigadores estudiar los cambios rápidos de redox como parte integral de la amplia gama de procesos celulares normales y de la progresión de la enfermedad en tiempo real.
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Visión general
Este protocolo describe un método para evaluar el estado redox específico del compartimento subcelular dentro de las células utilizando una sonda fluorescente sensible al redox. Esta técnica permite la cuantificación no destructiva del estado redox en células intactas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Biología redox
- Estrés oxidativo
Antecedentes
- Entender los estados redox es crucial para estudiar el estrés oxidativo.
- Las sondas sensibles al redox proporcionan información sobre los mecanismos celulares.
- Los cambios en el estado redox pueden indicar condiciones fisiológicas o patofisiológicas.
- Este método puede aplicarse a diversos organismos.
Propósito del estudio
- Permitir el monitoreo del estrés oxidativo en células.
- Proporcionar un método no destructivo para cuantificar los estados redox.
- Mejorar la comprensión de las respuestas celulares a condiciones oxidativas.
Métodos utilizados
- Uso de una sonda fluorescente sensible al redox.
- Análisis ratiométrico para contrarrestar las diferencias de señal.
- Aplicación del protocolo a varios tipos de células, incluyendo células cancerosas.
- Tratamiento celular y centrifugación para la preparación de muestras.
Principales resultados
- Cuantificación exitosa de los estados redox en células intactas.
- Demostró aplicabilidad en diferentes tipos de células.
- Proporcionó información sobre los mecanismos fisiológicos del estrés oxidativo.
- Permitió el monitoreo de cambios redox en tiempo real.
Conclusiones
- Este protocolo es efectivo para evaluar el estado redox en células.
- Ofrece una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos del estrés oxidativo.
- El método puede adaptarse para varias aplicaciones de investigación.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Assessing subcellular redox dynamics enables mechanistic de-risking in target validation by linking oxidative stress pathways to disease phenotypes. This method supports predictive confidence in preclinical models through quantitative, ratiometric readouts of cellular oxidation states. It provides translational continuity from discovery to lead identification by monitoring redox changes in living systems without disrupting cellular physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying redox shifts in response to oxidative stressors like H2O2.
- Operational Value: Enables functional target validation via subcellular compartment-specific resolution of roGFP signal.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between oxidant exposure and GFP oxidation ratios.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline redox states in MDA-MB-231 cells.
- Operational Value: Delivers assay standardization through ratiometric measurement that corrects for expression variability and photobleaching.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and organisms as demonstrated in breast cancer and bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Connects redox measurements to disease-relevant systems using triple-negative breast cancer as a pathophysiological model.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring real-time redox changes during disease progression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by linking oxidative stress mechanisms to functional cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing redox status as a quantifiable biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring oxidation/reduction ratios in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through flow cytometry-compatible sample preparation and gating strategies.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via mean fluorescent intensity ratios of oxidized versus reduced roGFP forms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling real-time monitoring of redox changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for oxidative stress assessment across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oxidative stress mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of redox measurements across experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative redox response thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and adenoviral transduction techniques.
- Needs instrumentation for dual-excitation fluorescence detection (405 nm and 488 nm) and emission at 525 nm.
- Demands cross-team standardization of transduction protocols, H2O2 treatment timing, and ratio calculation methods.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targeting of roGFP constructs beyond cytosolic expression.
- Includes practical limitations such as cytotoxicity at high multiplicity of infection, requiring optimization for each cell type.
