Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

Los evaluadores de protocolo actuales en textil, redox estado cambios de una manera intracelular compartimiento-específica. Nuestro protocolo permite una mejor comprensión y seguimiento de todos los mecanismos fisiológicos o fisiopatológicos del estrés oxidativo. Esta técnica permite la cuantificación no disruptiva de la relación de sulfuro ocular en mosaico en celdas intactas utilizando una salida métrica de relación para contrarrestar las diferencias entre los niveles de expresión de señal, el blanqueo fotográfico y las sensibilidades de detección.

Este protocolo se puede aplicar a varios organismos, incluidas las bacterias de las plantas. En el primer día del experimento tratar las células de una línea de células de cáncer de mama confluente durante dos minutos, con dos mililitros de 0.2, 5% viajes en EDTA. Cuando las células comienzan a desprenderse detienen la reacción con seis mililitros de medio completo y sedimentan las células por centrifugación.

Re suspenda el pellet en cinco mililitros de medio fresco y completo, cuente las células y diluya a 1,5 veces 10 a las quintas células por mililitro de medio completo. Luego se siembra 1.5 veces 10 a las quintas células por mililitro de células por pozo en una placa de 6 pozos, e incubar las células en la incubadora de cultivo celular durante la noche. O no agregue ninguna transducción de GFP de fila viral.

A la mañana siguiente, agregue 12,5, 25 y 50 microlitros de uno a 100 diluidos seis veces 10 a las unidades formadoras de placa 10 por mililitro de no añadir ninguna solución viral de Erode GFP, en medio completo. Añadir que a los pozos apropiados o la placa de 6 pozos para transducir las células con 50, 100 y 200 multiplicidades de infección, respectivamente. Cuando todos los pozos de muestra se hayan transducido con virus, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 16 a 24 horas.

Al día siguiente, visualice las células por microscopía de fluorescencia y reemplace el sobrenadante por medio, sin virus para permitir que las células se recuperen durante 24 horas adicionales. Para determinar la eficiencia óptima de la transducción, evalúe la intensidad de fluorescencia y la morfología de las células por citometría de flujo. Asegúrese de llevar a cabo todos los procedimientos que pueden causar infección por aerosoles o salpicaduras dentro de un gabinete de seguridad biológica certificado de nivel dos.

Para evaluar el estado redox de las células, a la mañana siguiente, incubar las células y los Wells apropiados de la placa de 6 pozos con 10 peróxido de hidrógeno micromolar durante una hora, antes de separar las células con 750 microlitros de 0,2 5% gotea en EDTA por pozo, como se ha demostrado. Detenga la reacción con dos mililitros de medio completo por pozo y tire de los sobrenadantes para cada condición en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Sedimentar las células por centrifugación y lavar los pellets en 500 microlitros de PBS por pozo por centrifugaciones dos veces.

Después del segundo lavado, filtre las suspensiones celulares a través de mallas de 40 micrometro en tubos compatibles con citometría de flujo sobre hielo, protegidos de la luz. En el software del citometro flow, ejecute la muestra de control de infección de la multiplicidad cero. Luego analice el peróxido de hidrógeno y las células no tratadas.

Permitirá calcular la relación de intensidad fluorescente media entre las formas oxidadas frente a las reducidas de la GFP de fila, utilizando la fórmula como se indica. Aquí está la estrategia de medición para seleccionar un gran número de celdas por citometría de flujo se muestra. La citometría de flujo también se puede utilizar para determinar la curva de respuesta a la dosis para el análisis de GFP de fila y la multiplicidad más eficiente de entrada de infección.

Según la multiplicidad de infección, curva de respuesta a la dosis en este análisis representativo, una multiplicidad de 200 de infección dio la mayor expresión de GFP en carretera, pero la morfología celular se realizó sugiriendo citotoxicidad. Por lo tanto, se determinó que la eficiencia óptima de transducción era una multiplicidad de infección de 100. En este análisis de estado redox, se obtuvieron intensidades de fluorescencia medias de GFP oxidadas y reducidas a partir del análisis de citometría de flujo para vehículos y cuatro tratamientos de peróxido de hidrógeno de control positivo micromolar de 10 micromolares.

Los histogramas superpuestos representan los cambios en el número de células en los 10 grupos de peróxido de hidrógeno micromolar y grupos tratados con vehículos o GFP de eyúdido reducido y oxidado. El cálculo de la relación entre el GFP de fila oxidado y reducido para este análisis reveló que el peróxido de hidrógeno micromolar 10 causó un aumento triple en la oxidación de la GFP de fila en comparación con el tratamiento del vehículo. Tener números de celda precisos es importante para los cálculos de RMN y la reproducibilidad.

Con el fin de tener resultados reproducibles, los investigadores deben mezclar a fondo las soluciones antivirales para obtener suspensiones homogéneas. Este protocolo permite a los investigadores estudiar los cambios rápidos de redox como parte integral de la amplia gama de procesos celulares normales y de la progresión de la enfermedad en tiempo real.