Name: Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a aislar núcleos de adipocitos maduros para transcriptómica de célula única. Este protocolo robusto minimiza agregados nucleares y residuos celulares, facilitando el análisis de la organización del tejido adiposo en modelos murinos.

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Nos gustaría dar las gracias a David Reynolds del núcleo de Genómica Albert Einstein y Jinghang Zhang del Núcleo de Citometría de Flujo por el soporte técnico. Reconocemos el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (DK110426) y las Subvenciones Piloto y de Viabilidad del Centro de Investigación de diabetes Einstein-Mount Sinai (DK020541) y del Centro de Investigación de La Obesidad de Nueva York (DK026687) (todos a K.S.). También nos gustaría agradecer a Albert Einstein Cancer Center (CA013330) por el apoyo básico.

El cuidado y la experimentación de animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Colegio de Medicina Albert Einstein.
1. Preparación de la digestión tisular y tampones de la lesis
<ol><li>Preparar el tampón de digestión tisular.<ol>
<li>Preparar 1 ml de tampón de digestión por cada gramo de tejido adiposo.</li>
		<li>Pesar 1,5 U/ml de colagenasa D y 2,4 U/ml disase II y añadir solución salina tamponada de fosfato (PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el tampón de preparación de núcleos (NPB).<ol>
<li>Preparar HEPES de 10 mM, cloruro de magnesio de 1,5 mM, cloruro de potasio de 10 mM, sacarosa de 250 mM y 0,1% de NP-40 en agua libre de nucleasas. Mezcla bien. La sacarosa puede tardar más tiempo en disolverse que los otros componentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%.<ol>
<li>Preparar 0.5% BSA en PBS que contenga EDTA. Se recomienda utilizar PBS de grado de cultivo celular filtrado estéril PBS (ver Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Digestión enzimática del tejido adiposo
<ol><li>Diseccionar ratones para extraer tejido adiposo según Aune et al.13. Recoger tejido aislado en un plato que contenga PBS. Transfiera el pañuelo a una toalla de papel para secarlo con palmaditas. Luego coloque el tejido en un plato limpio.</li>
	<li>Añadir cloruro de calcio al tampón de digestión a una concentración final de 10 mM. Agregue un pequeño volumen de tampón de digestión al plato y sopla bien el tejido adiposo. El volumen de tampón de digestión requerido se basará en la cantidad de tejido aislado. Por lo general, se utiliza 1 ml o menos.</li>
	<li>Añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de tampón de digestión preparado (p. ej., 10 ml para cinco ratones) al tejido picado. Con una pipeta serológica, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Agregue la cantidad restante de tampón para lavar el plato y transferirlo al tubo de 50 ml que contiene la muestra. Pipetear arriba y abajo varias veces. A continuación, incubar con agitación a 200-210 rpm a 37 oC durante 12-15 min.</li>
</ol>3. Aislamiento de adipocitos
<ol><li>Después de la incubación, agregue 0.5% BSA en una proporción de 1:1 a la muestra. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) para girar hacia abajo la fracción vascular estromal (SVF). La fracción de adipocitos permanecerá en la capa superior de la muestra.</li>
	<li>Coloque un filtro de celda de 40 m en la parte superior de un tubo de centrífuga cónica de 50 ml y filtre la muestra, recogiendo la capa superior y dejando atrás el SVF en la parte inferior del tubo. Transfiera la capa superior (fracción de adipocitos) a un nuevo tubo volteando el filtro boca abajo sobre el tubo y usando 0.5% BSA para revertir lavar el filtro y recoger la muestra en el tubo.</li>
	<li>Lleve el volumen total de 0.5% BSA a 10-15 mL basado en el tamaño de la muestra y la pipeta hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica o agitar brevemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar la muestra. Centrifugar la muestra de nuevo a 300 x g durante 5 minutos en RT.</li>
</ol>4. Aislamiento de núcleos
<ol><li>Utilice una punta de pipeta de diámetro ancho y transfiera cuidadosamente la capa superior de la muestra a un filtro de celda de 100 m colocado encima de un nuevo tubo prechilled sobre hielo, dejando atrás cualquier SVF residual.</li>
	<li>Enjuague/lave el filtro con una cantidad suficiente de NPB y deseche el filtro. Desde este paso adelante tener la muestra sobre hielo tan a menudo como sea posible y trabajar rápidamente para evitar núcleos con fugas y / o mal en salud. Es útil para prechill microcentrífuga tubos para ser utilizado en pasos futuros sobre hielo.</li>
	<li>Coloque la muestra sobre hielo durante no más de 2 minutos con la invertida suave intermitente del tubo para mezclar. El tiempo de incubación en hielo debe optimizarse para el tamaño de la muestra y el tipo de adipocitos. Centrifugar a 1.000 x g a 4oC durante 10 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de NPB. Transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga limpio. Durante la transferencia, evite tocar las paredes del tubo, que contienen desechos y lípidos. Añadir 0,6 U/L inhibidor de la RNase a la muestra y mezclar. Centrifugar de nuevo a 1.000 x g a 4 oC durante 10 min. NOTA: La velocidad y el tiempo de centrifugación deben reducirse en este paso para muestras más pequeñas.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y el resuspend en 1 ml de Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0,6 U/L inhibidor de la RNase).</li>
	<li>Doble filtro en un tubo limpio con filtros apilables de 30 m. Lávese el filtro con un pequeño volumen (300 l) de Nuclei Wash Buffer. Alternativamente, para muestras más pequeñas, utilice un filtro de 30 m que se ajuste a un tubo de microcentrífuga y filtre directamente en él.</li>
	<li>Confirme el aislamiento exitoso de núcleos sanos.<ol>
<li>Manchar una pequeña alícuota de la muestra con tripano y utilizar un contador de células automatizado para evaluar el tamaño promedio de las células muertas y el porcentaje de células muertas. El tamaño medio de los núcleos para una muestra que contenga principalmente núcleos debe oscilar entre 7-10 m. El tamaño de los núcleos suele ser de alrededor de 8 m.</li>
		<li>Manchar una pequeña alícuota de la muestra con DAPI y examinar bajo un microscopio con un objetivo 20x o superior. La membrana nuclear debe estar intacta y los núcleos deben ser redondos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Paso de limpieza y concentración de núcleos FACS
<ol><li>Proceda inmediatamente al paso FACS para limpiar los núcleos y eliminar cualquier exceso de escombros. El búfer de colección debe contener Nuclei Wash Buffer. Durante el FACS se diluye el búfer. Preparar una mayor concentración de BSA e inhibidor de la RNase para tener en cuenta la dilución durante la clasificación es útil. El bloque de recogida FACS debe estar en modo de refrigeración.</li>
	<li>Después de clasificar los núcleos, centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 oC para concentrar la muestra. Reconstituir en un volumen adecuado de tampón de lavado de núcleos para lograr una concentración de 500-1.500 núcleos/L. No intente quitar todo el sobrenadante. Si lo hace, se perderán núcleos.</li>
	<li>Utilice un hemocicómetro y una alícuota teñida DAPI para un recuento final y para visualizar los núcleos. A continuación, proceda inmediatamente con snRNA-seq de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Se presenta un método sencillo y robusto para aislar núcleos individuales y estudiar la heterogeneidad del tejido adiposo. En comparación con la secuenciación de ARN de tejido entero, este flujo de trabajo ofrece una visión imparcial de la heterogeneidad celular y marcadores específicos de la población. Esto es significativo e innovador para el avance de la biología adipocitos, el metabolismo molecular y la investigación de la obesidad.
Este protocolo está especialmente optimizado para la apli...

Los estudios han demostrado que el tejido adiposo marrón (BAT) tiene una capacidad notable para disipar la energía. Existen dos tipos de adipocitos termogénicos con características de desarrollo distintas tanto en roedores como en humanos: adipocitos beige y adipocitos marrones clásicos. Mientras que los adipocitos marrones clásicos se encuentran principalmente en depósitos de BAT interescapulares, los adipocitos beige emergen esporádicamente en el tejido adiposo blanco (WAT) en respuesta a ciertas señales fisiológicas, como la exposición crónica al frío, un proceso conocido como "marrón" o "beiging". Mediante el uso de imágenes avanzadas, ahora está claro que los seres humanos adultos tienen depósitos sustanciales de UCP1+ BAT, especialmente en la región supraclavicular1,2,3,4. La cantidad de BAT humano adulto se correlaciona inversamente con la adiposidad y puede aumentarse mediante señales externas, como la exposición crónica al frío5,6 o 3-adrenergic receptor agonista7. El gasto de energía mediado por los BAT puede ofrecer un enfoque viable para combatir la obesidad.
Hasta hace poco, los adipocitos termogénicos se han considerado una población homogénea. Sin embargo, los estudios han revelado la existencia de múltiples subtipos o subpoblaciones que son distintas en el origen del desarrollo, el uso del sustrato, y el transcriptoma8,,9,,10. Por ejemplo, recientemente se describió un tipo de adipocitos beige que utiliza preferentemente glucosa para la termogénesis, el adipocitos g-beige,10. La comprensión incompleta de los tipos de células en el tejido adiposo marrón y beige y la falta de marcadores específicos constituyen una barrera crítica para el estudio de sus funciones biológicas.
Los métodos tradicionales para aislar las subpoblaciones de las células se basan en la expresión de sólo unos pocos genes marcadores conocidos. Los avances recientes en la genómica de una sola célula permiten el uso de datos de expresión génica global de células individuales para proporcionar una estimación imparcial del número de subpoblaciones en un tejido. El objetivo final de este protocolo es determinar todos los subtipos de tejido adiposo bajo diversos estímulos termogénicos a una resolución de una sola célula. A diferencia de otros tejidos y tipos celulares, determinar los subtipos celulares del tejido adiposo es un desafío debido a la fragilidad de los adipocitos llenos de lípidos. Este documento introduce un protocolo robusto para aislar núcleos individuales del tejido adiposo para su aplicación posterior a la secuenciación de ARN. Es importante destacar que la literatura reciente que compara la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) y la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) reveló que el snRNA-seq es comparable al scRNA-seq en la detección de tipos de células, y superior en cobertura celular para un tejido complejo como el cerebro11. Este protocolo combina un método de centrifugación de gradiente de densidad optimizado para tejidos adiposos por Rosen et al.12 con un paso de "limpieza" de núcleos con un clasificador de alta velocidad MoFlo XDP. Como se ve en los resultados representativos, un análisis de 7.500 núcleos individuales del tejido adiposo marrón interescapular del ratón identificó múltiples tipos de células dentro de adipocitos marrones aparentemente homogéneos. En general, este protocolo simple y robusto se puede aplicar para estudiar la organización a nivel de tejido de adipocitos y células residentes en adiposos, la identificación de genes marcadores específicos de subtipos y el fenotipado de desarrollo de ratones noqueantes/transgénicos selectivos de adiposo.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Solución de enjuague</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS con EDTA; estéril</td></tr><tr><td>filtrado BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular 100 &mu; m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de celda 40&mu; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu; m)</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 y micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>Filtros apilables</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP Clasificador de células</td><td>Beckman Coulter ML99030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protector Inhibidor de ARNasa</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

La grasa marrón y beige son tejidos adiposos especializados que disipan la energía para la termogénesis por UCP1 (Unacoupling Protein-1) y vías independientes. Hasta hace poco, los adipocitos termogénicos se consideraban una población homogénea. Sin embargo, estudios recientes han indicado que hay múltiples subtipos o subpoblaciones que son distintas en el origen del desarrollo, el uso del sustrato y el transcriptoma. A pesar de los avances en la genómica de una sola célula, la descomposición imparcial de los tejidos adiposos en subtipos celulares ha sido difícil debido a la naturaleza frágil de los adipocitos llenos de lípidos. El protocolo presentado fue desarrollado para eludir estos obstáculos mediante el aislamiento efectivo de núcleos únicos del tejido adiposo para aplicaciones posteriores, incluida la secuenciación de ARN. La heterogeneidad celular se puede analizar mediante secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos.

Los núcleos de adipocitos no clasificados contienen desechos y dobletes que crean ruido y un alto fondo en la secuenciación de ARN de una sola célula aguas abajo. La estrategia representativa de la puerta FACS se muestra en la Figura 1. Los núcleos se seleccionaron primero en función de la dispersión hacia delante (FSC) y la dispersión lateral (SSC) (A), y luego, sólo se seleccionaron singlets en función de la combinación de anchura y alturas...

Esta publicación describe un protocolo para el aislamiento de núcleos de adipocitos maduros, purificación por clasificación activada por fluorescencia y transcriptómica a nivel de una sola célula.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

La descomposición del tejido adiposo en subtipos ha sido un desafío debido a la naturaleza frágil del adipocitos. Este protocolo fue desarrollado para superar esto mediante el aislamiento efectivo de núcleos únicos. Este flujo de trabajo proporciona núcleos individuales altamente purificados con agregados nucleares minimizados y desechos celulares.Esto es ventajoso para el perfilado de transcriptoma de una sola célula de miles de células. Este protocolo simple y robusto se puede aplicar para estudiar la organización a nivel de tejido de adipocitos en sus células residentes adiposas. Y en particular, para desarrollar fenotipado, noqueo y ratones transgénicos.La demostración visual de este protocolo es fundamental para que las personas que no tienen mucha experiencia en el manejo de adipocitos puedan replicar y obtener información sobre la heterogeneidad adiposa. Después de recoger el tejido adiposo de los ratones, sécalo con una toalla de papel y colócalo en un plato limpio. Añadir cloruro de calcio al tampón de digestión a una concentración final de 10 mM.Luego, agrega un pequeño volumen al tejido y pica completamente. Agregue aproximadamente la mitad de la cantidad de tampón de digestión preparado al tejido picado. Y utilice una pipeta serológica para transferir la muestra a un tubo centrífugo de 50 ml.Lave el plato con el tampón restante y agréguelo al tubo de 50 ml. Pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo varias veces. Luego, incubar durante 12 a 15 minutos a 37 grados Celsius mientras se agita a 200 a 210 rpm.Después de la incubación, añadir 0.5%BSA a la muestra en una proporción de volumen de 1 a 1 y mezclar bien por pipeteo. Centrifugar la muestra a 300 xg durante cinco minutos a temperatura ambiente para girar hacia abajo la fracción stromovascular dejando la fracción de adipocitos en la parte superior. Filtre la fracción superior a través de un filtro de celda de 400 m en un tubo de 50 ml.Luego, voltea el filtro boca abajo sobre el tubo y transfiere los adipocitos a un tubo nuevo usando 0.5%BSA para lavar el filtro a la inversa. Lleve el volumen total de la BSA a 10 a 15 ml y pipetee la muestra hacia arriba y hacia abajo con pipeta serológica. Luego, centrifugarlo de nuevo a 300 xg durante cinco minutos a temperatura ambiente.Después de la centrifugación, utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para transferir cuidadosamente la capa superior de la muestra a un filtro de celda de 100 m encima de un nuevo tubo pre-refrigerado sobre hielo. Enjuague el filtro con una cantidad suficiente de tampón de preparación de núcleos y, a continuación, deséchelo. De este paso adelante, mantenga una muestra sobre hielo y trabaje rápidamente.Deje la muestra sobre hielo durante un máximo de dos minutos invirtiendo intermitentemente el tubo para mezclar. Luego, centrifugar a 1000 xg y 4 grados Celsius durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de tampón de preparación de núcleos.Transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga limpio para evitar tocar las paredes del tubo viejo. Añadir 0,6 unidades por inhibidor de L RNase y mezclarlo. Luego, centrifuga la muestra durante otros 10 minutos.Retire el sobrenadante y resusppend un pellet y 1 ml de tampón de lavado de núcleos. Filtre dos veces la muestra en un tubo limpio utilizando filtros apilables de 30 m. A continuación, lave los filtros con unos 300 L de tampón de lavado de núcleos.Para confirmar el aislamiento exitoso de núcleos sanos, manche una pequeña alícuota de la muestra con tripano y utilice un contador de células automatizado para evaluar el tamaño muerto promedio y el porcentaje de células muertas. Manchar en una pequeña alícuota de la muestra con DAPI y examinarla bajo un microscopio con un objetivo 20X o superior. Los núcleos deben ser redondos y tener una membrana nuclear intacta.Las flechas blancas indican núcleos sin una membrana intacta. Después de limpiar los núcleos con FACS, concentre esta muestra centrifugando a 500 xg durante cinco minutos a 4 grados centígrados. A continuación, reconstituirlo en un volumen adecuado de tampón de lavado de núcleos.Para lograr una concentración de 50 a 1500 núcleos por L y proceder con núcleos de una sola célula ARN seq. Para eliminar los desechos celulares y los dobletes, los núcleos de adipocitos se clasifican por tamaño y granularidad para excluir los agregados y multiplets nucleares. Y por último para eventos positivos de DAPI.Esta estrategia de clasificación da como resultado núcleos de un solo núcleo altamente purificados con agregados y desechos mínimos. Cuando se inspecciona por microscopía, los núcleos clasificados deben ser redondos y tener una membrana intacta. La purificación exitosa de los núcleos también se puede realizar con qRT-PCR en tiempo real utilizando imprimaciones para el ARNm Naciente de Ucp1, un gen marcador para adipocitos marrones.La plataforma de cromo determinó un transcriptoma de 7500 núcleos de tejido adipo marrón interscapular murino. Siete tipos de células diferentes se revelaron con la reducción de la dimensionalidad t-SNE y la agrupación en clústeres k-means. Todos los cúmulos expresaron Fabp4, un gen pan adipocitos y un subconjunto expresaron un alto nivel de ARNm Ucp1.Los núcleos aislaron y luego confirmaron aunque este protocolo puede ser sometido a prácticamente cualquier plataforma de expresión génica de nivel de célula única, incluyendo Chromium de 10x Genomics.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Este estudio describe un nuevo método para aislar adipocitos marrones murinos para el análisis de expresión génica y proteica.

Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de alta calidad de riñones de ratones congelados que mejoran la representación de los tipos de células renales medulares y evitan los artefactos de expresión génica de la disociación enzimática del tejido.

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de tejidos hepáticos archivados congelados por flash para RNA-seq de núcleo único, ATAC-seq y multiómica articular (RNA-seq y ATAC-seq).

Aislamiento de núcleos de tejido hepático congelado rápidamente para multiómica unicelular

Presentamos un protocolo para el ensayo de cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) específicamente en adipocitos utilizando clasificación de núcleos con tejidos adiposos aislados de ratones reporteros transgénicos con marcado de fluorescencia nuclear.

ATAC-Seq específico de adipocitos con tejidos adiposos mediante clasificación de núcleos activados por fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.

Aislamiento de núcleos de células progenitoras cardíacas de ratón para epigenoma y perfil de expresión génica a resolución de una sola célula

El estudio describe un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para aislar núcleos de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos

La biología del tejido adiposo intermuscular (IMAT) está en gran parte inexplorada debido a la limitada accesibilidad del tejido humano. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de núcleos y la preparación de bibliotecas de IMAT humano congelado para la secuenciación de ARN de núcleos individuales para identificar la composición celular de este depósito adiposo único.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo intermuscular humano y secuenciación de ARN de núcleos individuales posteriores

Aprenda a aislar núcleos de adipocitos maduros para transcriptómica de célula única. Este protocolo robusto minimiza agregados nucleares y residuos celulares, facilitando el análisis de la organización del tejido adiposo en modelos murinos.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

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