Ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado para estudiar la modificación m⁵C en Arabidopsis

La inmunoprecipitación de ARN metilado, también llamada MeRIP, es un método diseñado para identificar grupos metilados en transcriptomas completos. Se puede adaptar a extractos de ARN de muchos organismos modelo. El método es simple, no requiere ningún tratamiento químico severo y se puede utilizar para mapear cualquier modificación del ARN siempre que sea una variable específica.

Para extraer la muestra de ARN, primero muela 200 miligramos de la muestra de tejido vegetal de interés para convertirla en polvo en nitrógeno líquido, teniendo cuidado de que el tejido permanezca congelado durante todo el procedimiento. A continuación, agregue un mililitro de reactivo de extracción de ARN que contenga tiocianato de guanidina y fenol ácido al tejido vegetal molido y mezcle bien por inversión, asegurándose de que todo el tejido esté húmedo. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugar las muestras y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.

Agregue 200 microlitros de 1-bromo-3-cloropropano al sobrenadante y agite vigorosamente la muestra. Separar las fases por centrifugación y transferir aproximadamente 500 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 500 microlitros de isopropanol y 50 microlitros de acetato de sodio de tres molares a la muestra y mezclar bien por inversión.

Incubar la muestra durante 10 minutos a menos 20 grados centígrados antes de precipitar el ARN por centrifugación. Después de desechar el sobrenadante, lave el pellet dos veces con 500 microlitros de etanol al 80% y una vez con 500 microlitros de etanol al 99%. Después del último lavado, seque el pellet durante cinco a 10 minutos antes de disolverlo en 30 microlitros de agua sin RNasa.

Mida la concentración de ARN en un espectrofotómetro y digiera 20 microgramos de la muestra de ARN en una solución de agua y tampón de DNasa. Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados, utilice un volumen adecuado de reactivo de inactivación de DNasa para eliminar la enzima y comprobar la calidad y pureza del ARN aislado mediante electroforesis capilar según los protocolos estándar. Si el número de integridad de ARN de la muestra digerida de DNasa es superior a siete, agregue al menos 12 microgramos de cada muestra de ARN a un tubo nuevo.

Aumentar 0,1 nanogramos de cada transcripción in vitro previamente preparada, una metilada y otra no metilada, por cada tres microgramos de muestra de ARN y llevar el volumen final de cada tubo a 80 microlitros con agua libre de ARNasa. A continuación, sonicar todo el volumen de cada muestra de ARN en tubos de sonicación individuales y confirmar la eficacia de la sonicación y la concentración de las muestras de ARN mediante electroforesis capilar. El tamaño medio del ARN fragmentado debe ser de unos 100 nucleótidos.

Para la inmunoprecipitación de ARN metilado, se añadan nueve microgramos de cada muestra de ARN sonicado y hasta 60 microlitros de agua libre de ARNasa en nuevos tubos individuales de baja unión y se calienta el ARN a 70 grados centígrados en un baño de agua durante 10 minutos. Al final de la incubación, enfríe las muestras durante 10 minutos en un baño de agua helada y transfiera 20 microlitros de cada muestra a un nuevo tubo de unión baja para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius como entrada. Agregue agua libre de ARNasa a los 40 microlitros restantes de cada muestra hasta un volumen final de 860 microlitros y divida cada muestra en un tubo de baja unión para inmunoprecipitación y un tubo de baja unión como muestra simulada.

Agregue 50 microlitros de tampón MeRIP 10X y 10 microlitros de inhibidor de RNasa a cada muestra. A continuación, agregue 10 microlitros de anticuerpo anti-M5C a los tubos de inmunoprecipitación y 10 microlitros de agua a los tubos simulados. Selle los tubos con parafilm e incube las muestras durante 12 a 14 horas a cuatro grados centígrados con rotación por encima de la cabeza.

A la mañana siguiente, agregue 40 microlitros de perlas a un tubo de 15 mililitros por muestra. Lave las perlas con tres lavados de cinco minutos con 800 microlitros de tampón MeRIP y rotación por parte de la cabeza por muestra por lavado, recogiendo las perlas en un imán después de cada lavado para permitir que se deseche el tampón. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las perlas en 40 microlitros de tampón MeRIP fresco por muestra y agregue 40 microlitros de perlas resuspendidas a los tubos de inmunoprecipitación y muestra simulada para una incubación de dos horas a cuatro grados Celsius con rotación por encima de la cabeza.

Al final de la incubación, coloque los tubos en una rejilla magnética durante un minuto antes de desechar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar las perlas. Lave las perlas cinco veces en 700 microlitros de tampón MeRIP suplementado con 0.01%Tween-20 durante 10 minutos por lavado a temperatura ambiente con rotación por encima de la cabeza. Después del último lavado, vuelva a suspender las perlas en 200 microlitros de tampón de digestión de proteinasa K y 3,5 microlitros de proteinasa K para una incubación de tres horas a 50 grados centígrados con agitación a 800 revoluciones por minuto.

Al final de la incubación, extraiga el ARN con 800 microlitros de reactivo de extracción de ARN y el protocolo de extracción de cloroformo de fenol de tiocianato de guanidinio ácido como se demuestra. Después de la extracción, vuelva a suspender el pellet de ARN extraído en exactamente 20 microlitros de agua libre de ARNasa. En esta figura, se muestra una corrida representativa de una buena muestra de ARN.

En la misma muestra, después de la sonicación, se puede observar la presencia de un pico uniforme desplazado hacia la izquierda con un tamaño de unos 100 nucleótidos. La menor concentración se debe tanto a la pérdida de ARN durante la fragmentación como al aumento del volumen de la muestra. La calidad de la inmunoprecipitación y de las muestras simuladas se puede evaluar mediante PCR cuantitativa con transcriptasa inversa.

En este análisis representativo, alrededor del 80% de la transcripción metilada in vitro se recuperó en la muestra de inmunoprecipitación, mientras que solo se recuperó aproximadamente el 2% en la muestra simulada. Para el control no metilado, la recuperación fue inferior al 1% tanto en la inmunoprecipitación como en las muestras simuladas. Después de la secuenciación profunda y la alineación de las lecturas con el genoma, se pueden aplicar algoritmos de llamada de picos para identificar las ventanas estadísticamente significativas que se enriquecen en las muestras de inmunoprecipitación en comparación con la entrada.

Utilizando los datos de secuenciación, podemos identificar el motivo en el que la metilación del ARN ocurre con mayor frecuencia y este motivo puede servir como cebo para derribar proteínas de unión específicas.